深部脑刺激期间神经元动态活动的光栅图描述方法

Abstract

Deep brain stimulation (DBS), which usually utilizes high frequency stimulation (HFS) of electrical pulses, is effective for treating many brain disorders in clinic. Studying the dynamic response of downstream neurons to HFS and its time relationship with stimulus pulses can reveal important mechanisms of DBS and advance the development of new stimulation modes (e.g., closed-loop DBS). To exhibit the dynamic neuronal firing and its relationship with stimuli, we designed a two-dimensional raster plot to visualize neuronal activity during HFS (especially in the initial stage of HFS). Additionally, the influence of plot resolution on the visualization effect was investigated. The method was then validated by investigating the neuronal responses to the axonal HFS in the hippocampal CA1 region of rats. Results show that the new design of raster plot is able to illustrate the dynamics of indexes (such as phase-locked relationship and latency) of single unit activity (i.e., spikes) during periodic pulse stimulations. Furthermore, the plots can intuitively show changes of neuronal firing from the baseline before stimulation to the onset dynamics during stimulation, as well as other information including the silent period of spikes immediately following the end of HFS. In addition, by adjusting resolution, the raster plot can be adapted to a large range of firing rates for clear illustration of neuronal activity. The new raster plot can illustrate more information with a clearer image than a regular raster plot, and thereby provides a useful tool for studying neuronal behaviors during high-frequency stimulations in brain.

引言

深部脑刺激（deep brain stimulation，DBS）已经在帕金森病、肌张力障碍等神经系统疾病的治疗上取得了令人瞩目的成效；并且，在难治性癫痫、强迫症等疾病的治疗中也展现了良好的应用前景^[1-2]。然而，其作用机制至今尚无定论^{[1, 3]}。

临床 DBS 通常使用直径为 1 mm 左右的细电极将电脉冲施加于刺激位点，脉冲频率通常高于 100 Hz，被称为高频刺激（high frequency stimulation，HFS）。考察刺激目标区域的神经元动作电位发放是研究 DBS 作用机制的重要方法。许多研究结果表明，HFS 的作用并不仅限于直接抑制或兴奋电极周围神经元胞体的活动，还可以激活电极周围的传出轴突纤维^[4-5]。此兴奋作用沿着轴突传导出去，可以调制下游广泛区域内的神经元活动，并且这种调制是动态变化的，在 HFS 初始阶段尤为明显^[6-8]。因此，考察刺激下游神经元动作电位发放的动态变化可以深入揭示 DBS 的作用机制^[9]，并且可以为 DBS 新型刺激模式的开发提供依据。例如，闭环刺激（或自适应刺激）会频繁地开启和关闭刺激，从而诱发动态（暂态）过程。而目前对于 DBS 期间的神经元发放的研究多为稳态过程，对于动态过程的研究较少，且缺乏描述方法。为此，本文将为研究神经元活动动态过程提供一种光栅图描述方法。

DBS 期间神经元锋电位（即胞外记录的动作电位）的发放率以及锋电位与刺激脉冲之间的关系（如潜伏期和锁相性等）是揭示 DBS 机制的重要考察指标，它们可以反映刺激诱导的神经元输出的变化^[10-11]。其中，发放率反映神经元兴奋性的强弱^[12]；潜伏期是锋电位与其前导脉冲的时间距离，可以反映刺激诱发的兴奋的传导速度^[13-14]；锁相性表示锋电位与刺激脉冲之间是否存在一定的相位关系，可以反映刺激对于锋电位发放的调制作用的强弱^{[10, 15]}。

光栅图常被用于描述神经元动作电位发放的时间关系，具有较好的直观性^[16]。本文以大鼠海马 CA1 区轴突高频刺激期间下游神经元锋电位发放的描述为例，将光栅图用于呈现高频刺激期间锋电位发放的动态变化，实现上述发放率、潜伏期和锁相性等指标的图示化，并分析不同的光栅图分辨率对于各个指标图示效果的影响。该图示化方法为研究各种神经元在电刺激期间的动态响应提供了一种新工具，对于深入揭示 DBS 的机制具有重要意义。

1. 方法

1.1. 二维光栅图的设计

一维光栅图常被用于描述神经元发放的锋电位在单个时间坐标轴上的位置。为了同时显示锋电位在周期性的脉冲刺激间期（inter-pulse-interval，IPI）的发放位置，本文增加一个 IPI 时间坐标轴，从而构成具有两个时间坐标轴的二维光栅图。并且，两个坐标的分辨率可调，光栅点的大小随着此分辨率的改变而变化。光栅点较大时可以代表多个锋电位，其锋电位个数用灰度或颜色来表示。这种二维光栅图利用 MATLAB 程序制作，其中使用的关键作图函数是“imagesc （）”。光栅图的细节见下文结果部分的论述。

1.2. 大鼠海马区 HFS 期间神经元锋电位信号的获取

本文使用的神经元锋电位信号取自 Sprague-Dawley 麻醉大鼠的急性实验。大鼠购自中国浙江省医学科学院实验动物中心，其使用遵循浙江大学实验动物管理的相关规则。动物手术、电极植入、电信号采集和电刺激实施等方法与已报道的相似^[17-18]，此处不再复述。简而言之，将 16 通道微阵列记录电极植入大鼠海马 CA1 区，将同芯双极刺激电极植入到记录位点上游的输入通路 Schaffer 侧支，并施加 HFS 用于激活下游神经元（图 1a 左上）。HFS 为脉宽 0.1 ms 的双相电流型脉冲波，电流强度为 0.3 mA，脉冲频率为 100 Hz，持续时间为 2 min。

图 1.

A regular two-dimension (2D) raster plot illustrating the dynamics of neuronal firing during HFS

利用常规二维光栅图显示 HFS 期间神经元发放的动态变化

a. schematic diagrams of the electrode locations and an example of a MUA signal during 2 min 100 Hz HFS; b. 2D raster plot (below) of the spike sequence in (a) with the curve of firing rate (above) and the curve of PSTH (right)

a. 电极位置示意图和持续 2 min 的 100 Hz HFS 期间的 MUA 信号；b. 为（a）信号中神经元锋电位的常规二维光栅图（下）、发放率曲线（上）和 PSTH 曲线（右）

在 HFS 期间及前后记录海马 CA1 区的电信号，原始记录信号的频带为 0.3～5 000 Hz，采样率为 20 kHz（采样周期为 0.05 ms）。锋电位信号的检测和分类方法详见已有的报道^[17-18]。简述如下：首先，应用线性插值法去除原始宽频带信号中的刺激伪迹；然后，进行高通滤波（截止频率为 500 Hz），获得多单元锋电位信号（multiple unit activity，MUA）；再应用阈值法检测相邻 4 个通道 MUA 信号中包含的锋电位，并提取锋电位的幅值等特征值进行聚类分析，获得各个不同神经元的单元锋电位信号，并将锋电位的负峰时间点作为动作电位的发放时刻，用于制作二维光栅图。

2. 结果

2.1. 利用二维光栅图描述神经元锋电位发放随时间的变化

在海马 CA1 区 Schaffer 侧支施加 100 Hz 的 HFS 时，在刺激的初期会诱发下游神经元群体产生同步的动作电位发放，即群峰电位（population spike，PS），之后 PS 消失，而 MUA 持续存在（图 1a 右上）。此现象与已有的报道一致^[18]。

图 1a 下方的 3 个小段信号的放大图分别为 HFS 前（橙色）、HFS 前期（蓝色）和 HFS 后期（红色）的同一个神经元的锋电位信号。其中，一维光栅图显示了该神经元锋电位的发放序列。将这种光栅序列按照 HFS 的 IPI 依次排列而构成二维光栅图，就可以显示锋电位在 100 Hz 的 HFS 每个 IPI（10 ms）中分布的变化（见图 1b）。每个光栅点表示一个锋电位。由图中可见，HFS 前的基线记录期间，锋电位在虚拟的 IPI 中均匀分布（橙色箭头所示）。而在 HFS 开始后，锋电位却集中在 IPI 的 6～8 ms 区间（蓝色箭头所示），平均潜伏期约为 7 ms。这表明 HFS 期间，锋电位与刺激脉冲之间存在明显的相位关系。而且，随着 HFS 的持续，锋电位的发放呈现逐渐迁移的动态过程，在 HFS 后期，锋电位发放的潜伏期逐渐后移至约 9 ms 处，且集中趋势逐渐减弱，部分锋电位发放迁移至下一刺激脉冲之后（如图 1a 右下的放大图中，锋电位的潜伏期可为 11.3 ms，大于 10 ms 的 IPI 长度），在二维光栅图中表现为向右下角迁移（红色箭头所示）。将 IPI 均匀分为 50 个区间，区间宽度设为 0.2 ms，统计各区间内光栅点的总个数，得到图 1b 右侧的刺激后时间直方图（peri-stimulus-time histogram，PSTH），其波峰分布进一步反映了锋电位的相位关系。将刺激持续时间均匀分为 130 个区间（区间宽度设为 1 s），统计各区间内光栅点的总个数，得到图 1b 上方的发放率曲线。可见，HFS 后期神经元的发放率较平稳，刺激的 40～120 s 期间，平均发放率为 66.6 个/s，明显高于刺激前的基础发放率（平均值为 38.2 个/s）。

虽然这种常规二维光栅图能够反映锋电位与刺激脉冲之间的关系，但是，用于描述数分钟 HFS 期间的锋电位发放时，由于 IPI 的数量太多（对于 100 Hz 刺激每分钟有 6 000 个 IPI），图中数以万计的光栅太细小，不利于观察。特别是较稀疏的锋电位发放难以考察（如图 1b 红色箭头所示）。为了解决此问题，本文将光栅图的横坐标“刺激持续时间”的分辨率从单个 IPI 的 10 ms 增至 1 s，同时将纵坐标“IPI 时间”的分辨率由 0.05 ms 的采样间隔增至 0.1 ms，从而增大每个光栅点的面积，并采用灰度或者彩色两种方法来体现各光栅点所包含时间范围内的锋电位数量。这种改进的二维光栅图可以突显锋电位发放率较高的时间区域。

2.2. 利用改进光栅图描述 HFS 期间的锋电位动态变化

以时长为 2 min 的 HFS 数据（图 2a）为例，虽然常规二维光栅图（图 2b）能够在一定程度上展现 HFS 期间锋电位的锁相性和潜伏期等特性，但光栅点过于细小。相比之下，改进光栅图（图 2c 所示的灰度图和图 2d 所示的彩色图）累计 1 s 的 IPI 数据用于作图，使得 2 min 的 100 Hz 刺激期间光栅列数从常规图的 12 000 列下降至 120 列，大大增加了各列光栅点的宽度；同时，IPI 的分辨率降低也增加了光栅点的高度。这样，通过调节两个坐标的分辨率，改进的光栅图增大了光栅点的面积，使得光栅图所包含的信息更丰富且更清晰。

图 2.

Newly designed raster plot illustrating the dynamics of neuronal firing during HFS

利用改进光栅图显示 HFS 期间锋电位发放的动态变化

a. MUA signal during a 2-min 100 Hz HFS; b. regular raster plot; c. newly designed raster plots with gray-scale; d. newly designed raster plots with color-scale

a. 持续 2 min 的 100 Hz 高频刺激期间的锋电位信号；b. 常规二维光栅图；c. 改进的二维灰度光栅图；d. 改进的二维彩色光栅图

与常规二维光栅图（图 2b）相比较，灰度光栅图（图 2c）和彩色光栅图（图 2d）都能够较为明显地呈现图中右下角稀疏的锋电位（空心箭头所示）；而且，也能够反映锋电位的密集程度（实心箭头所示），HFS 前和 HFS 结束后自发的稀疏锋电位也变得清晰可见。图中的灰度或彩色表示锋电位的个数。

此外，改进光栅图的分辨率降低并不会损失锋电位发放的动态信息。图 2c 和图 2d 都直观地呈现了 HFS 期间的锋电位发放与刺激之间的明显锁相关系，潜伏期从初始的 7～8 ms 逐步增加并稳定于 8～10 ms 之间，且有部分稀疏的锋电位发放迁移至光栅图的右下角。这些动态趋势都与常规光栅图（图 2b）的显示结果一致，且紧随 HFS 结束后的锋电位发放静息期等其他信息的显示也更清晰。

2.3. 调节光栅图的分辨率可以改善图示效果

已有的研究表明，HFS 期间多数神经元的发放率都远小于刺激频率^[18]。当神经元的发放率较低时，光栅图的显示效果较差。此时可以通过调节两坐标轴分辨率来改善显示效果。如图 3 所示为 2 min、100 Hz 的 HFS 下记录到的发放率较低（5.3 个/s）的神经元锋电位光栅图。其中的 9 张子图的两个坐标的分辨率各不相同（见图上方和右侧标注）。可见，随着光栅图横、纵坐标的分辨率逐渐降低（两坐标轴分辨率的取值逐渐增大），锋电位发放的整体变化趋势逐渐明朗；但当分辨率过低时，面积过大的光栅点也会导致细节信息的丢失，造成视觉假象，影响判断。

图 3.

Improving visualization by adjusting the resolutions of coordinate axes of raster plots

调节光栅图的双轴分辨率以改善视觉效果

The nine insets are raster plots for identical firing of a neuron with a low firing rate (5.3 spikes/s) during 100 Hz HFS. RS is the resolution of stimulation time. RI is the resolution of IPI time

9 个子图描述同一发放率较低的神经元（5.3 个/s）在 100 Hz HFS 期间的发放。RS 表示刺激持续时间轴的分辨率，RI 表示 IPI 时间轴的分辨率

例如，当 IPI 时间分辨率（纵轴）取采样周期（0.05 ms）、刺激持续时间的分辨率（横轴）取为 100 倍 IPI（1 s）时（见图 3a），各光栅点过于细小。而在图 3i 中，两坐标轴的分辨率均降低至图 3a 的五分之一（IPI 分辨率取 0.25 ms，刺激持续时间分辨率取 5 s），各光栅点的面积明显增大，图像清晰且可以判定发放较集中的区域（红棕色部分），但过大的光栅点容易被误解为多个锋电位的密集发放，造成发放率高且集中的假象。而分辨率适中的图 3e 则表现出良好的图示化效果，可以正确反映发放率并呈现锋电位发放的动态变化。

由此可见，调节并选择合适的分辨率可以获得更好的光栅图显示效果。

3. 讨论

本文设计了一种具有叠加特性且分辨率可调的改进二维光栅图，用于描述周期性刺激期间神经元动作电位发放的锁相性和潜伏期等指标随时间的动态变化。应用此光栅图显示海马神经元对于轴突 HFS 的响应，清晰地显示了神经元锋电位锁相性逐渐减弱以及潜伏期逐渐延长的过程。这种光栅图具有如下优点：

（1）能够同时显示多种信息。以神经元对于 HFS 的响应为例，改进的光栅图可显示如下信息：锋电位与刺激脉冲之间的锁相性、潜伏期及其动态变化；锋电位在刺激周期内发放的概率分布（表现为光栅点的密集程度和颜色/灰度的深浅）。此外，将刺激前与结束后的自发发放按照虚拟脉冲周期一起作图（见图 2），还可以更明确地显示刺激的作用，以及紧随刺激结束后锋电位发放的抑制期和恢复过程^{[10, 18]}。结合锋电位发放率的变化曲线和 PSTH（见图 1b），则可以更全面地呈现 HFS 引起的锋电位发放的动态变化，并对锋电位发放率和潜伏期等动态信息进行定量分析。这些信息对于研究刺激对于神经元的作用机制至关重要^[10-11]。

（2）具有较广的应用范围。这种改进的光栅图不仅适用于周期性的电刺激，如频率固定的脉冲刺激或者正弦波刺激等；也可用于描述其他周期性的外界刺激（如视觉闪光、体感刺激等）对于神经元活动的作用的研究^[19-20]。而且，通过调节光栅图的分辨率，可以适应锋电位的不同发放率。在描述发放率较低（< 10 个/s）的神经元活动时，也可以正确、清晰地呈现其整体变化趋势（见图 3）。

（3）方法简单易用。本文使用 MATLAB 函数绘制光栅图，可以采用位图和矢量图两种方式，其中位图方式能够极大地减少制图、编辑和输出时的计算机处理时间，分辨率的降低也节省了数据的存储空间^[16]。

此外，这种光栅图的使用需要注意选择合适的光栅分辨率。分辨率过高，则光栅点难以观察；分辨率过低，会导致细节信息的丢失，容易造成视觉假象。分辨率的选择与锋电位发放率、IPI 时长、刺激持续时长、图像尺寸大小等多种因素相关，需要人工辅助判断和调节参数得到合适的方案。光栅图的色条对比度也可以人工设定。不过，本文以锋电位的最大累计数为基准，采用自适应的色调对比度，无需人工调节，也可以根据不同发放率获得清晰的图像。

总之，本文所设计的二维光栅图具有制作简便、参数可调、适用范围广等优点，可直观反映刺激过程中神经元锋电位发放的动态变化。为研究 DBS 以及其他各种外加刺激对神经系统的作用机制提供了一种有效的数据分析方法。此外，本文利用改进光栅图显示的大鼠海马轴突刺激期间神经元锋电位发放时刻的动态变化特性，反映了刺激引起的作用，有待于进一步的深入研究，可以揭示有关轴突传导阻滞、突触传递失败等 DBS 的重要机制^{[10, 15, 18]}。

Funding Statement

国家自然科学基金项目（30970753）