关节软骨修复机制中相关信号分子的研究进展

Abstract

After the articular cartilage injury, the metabolic level is increased during the progressive degeneration, the chondrocytes secrete a variety of inflammatory factors, and the original cell phenotype is gradually changed. For a long time, a large number of researchers have done a lot of researches to promote anabolism of chondrocytes and to maintain the stability of chondrocyte phenotype. There are many molecular signaling pathways involved in the process of promoting cartilage repair. This review focuses on the key signaling molecules in articular cartilage repair, such as transforming growth factor-beta and bone morphogenetic protein, and reveals their roles in the process of cartilage injury and repair, so that researchers in related fields can understand the molecular mechanism of cartilage injury and repair widely and deeply. Based on this, they may find promising targets and biological methods for the treatment of cartilage injury.

引言

关节软骨损伤是骨科临床常见疾病，由于软骨自我修复能力有限，软骨损伤几乎不能修复，尽管目前有手术、移植、组织工程等治疗方法，但临床治疗效果仍不能令人满意。人类关节软骨是由软骨细胞和大量软骨基质组成的高度分化的无血管组织。在健康的成人软骨中，软骨细胞处于合成和分解代谢相对平衡的稳定状态，而在炎症、创伤及其他病理因素引起的软骨损伤中，这种稳定状态被打破，分解代谢水平上调，且在生理负荷的作用下逐渐发生骨关节退行性病变，最终导致关节失用。退行性病变的关节软骨有两个主要特点：① 是多种炎性细胞因子浸润，如：白细胞介素 1（interleukin-1，IL-1）、肿瘤坏死因子（tumor necrosis factor，TNF）^[1]以及细胞胞外基质降解酶［如：基质金属蛋白酶（matrix metalloproteinase，MMP）］等，可导致软骨基质减少；② 是软骨细胞表型会发生肥大性分化^[2]，表达一些终末分化标志物，如 Runt 相关转录因子-2（runt-related transcription factor 2，RUNX-2）、X 型胶原（collagen X）、MMP-13 和印度刺猬因子（indian hedgehog，IHH）。

研究者们长期以来希望通过刺激软骨基质再生、维持软骨细胞表型来促进软骨损伤修复，而这两方面都受到多种复杂的信号分子，如：转化生长因子 β（transforming growth factor-β，TGF-β）、成纤维生长因子（fibroblast growth factor，FGF）、骨形态发生蛋白（bone morphogenetic protein，BMP）和 Wnt 信号分子等相互作用和调节。因此，揭示这些分子机制对于人们理解软骨损伤修复的生理病理过程、确定关键致病因素有重要的意义。本篇综述重点围绕软骨退变和修复过程中关键的信号分子 TGF-β、BMP、FGF、缺氧诱导因子（hypoxia inducible factor，HIF）、Wnt、核因子 κB（nuclearfactor-kappa B，NF-κB）、丝裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinases，MAPK）和 IHH 等展开介绍，以期望有助于相关领域研究者了解软骨损伤修复过程中的分子机制，并在此基础上寻找软骨修复治疗靶点和更优的生物学治疗方法。

1. 生长因子类信号分子

生长因子是一类由多种细胞分泌的多肽类物质，可以与特异性、高亲和力的细胞表面受体结合，经复杂的细胞内信号转导，调节细胞的增殖、分化及稳态维持。在软骨损伤与修复过程中，多种生长因子类信号分子，如：TGF-β、BMP、胰岛素样生长因子（insulin-like growth factors，IGF）、FGF 等，参与细胞的调控和代谢变化。

1.1. TGF-β

TGF-β 是一个包含多种成员的细胞因子超家族，能够通过调控细胞的生长、分化和增殖等过程，参与维持组织、器官的正常结构功能。在软骨组织中，TGF-β 能够刺激软骨细胞增殖和软骨基质的生成，从而促进合成代谢与软骨缺损的修复^[3]，但同时 TGF-β 也能够经细胞表面 TGF-β 受体Ⅱ介导加重骨关节炎（osteoarthritis，OA）患者软骨细胞的退行性病变^[4]。之所以产生这种矛盾，是因为 TGF-β 选择性启动了不同的信号通路。Smad 蛋白家族是 TGF-β 下游重要的细胞内信号转导蛋白，目前普遍认为，Smad 蛋白依赖途径是介导 TGF-β 信号进入细胞核内的最主要方式。TGF-β 通过与细胞表面受体的结合启动激活素受体样激酶 1（activin receptor like kinase 1，ALK1）和激活素受体样激酶 5（activin receptor like kinase 5，ALK5）^[5]，可分别激活 Smad1、Smad5、Smad8 和 Smad2、Smad3^[6]，这是软骨细胞表型改变和分化进程中的两条主要调节通路。TGF-β 通过 Smad2、Smad3 途径可以促进软骨细胞相对稳态的维持，并诱导蛋白聚糖和Ⅱ型胶原的生成；而通过 Smad1、Smad5、Smad8 途径能够刺激软骨细胞生成 collagen X、MMP-13、骨桥蛋白、碱性磷酸酶、骨钙素以及血管内皮生长因子，促进软骨细胞的肥大性分化。

还有研究显示，在 OA 和退行性骨关节病的关节软骨中 ALK1/ALK5 比例显著增高，表明在退行性病变和 OA 患者的关节软骨细胞中 Smad1、Smad5、Smad8 介导的信号途径占相对优势，并由此促进了软骨细胞的肥大性分化和 MMP-13 产生，造成软骨损伤不断进展^[7]。

1.2. BMP

BMP 是属于 TGF 超家族中的一员。现已证明，BMP-7 有促进软骨损伤修复的作用，能够诱导软骨细胞外基质合成、抵抗由 IL-1、IL-6 和纤维连接蛋白诱导的促细胞分解代谢作用，并能够促进间充质干细胞向软骨细胞的分化^[8-10]。这些研究结果表明，BMP 通路是软骨修复过程中的关键因素，有望成为软骨再生医学领域临床治疗应用中的有效靶点之一。

尽管 BMP 被认为是软骨细胞的保护因子，在软骨再生过程中发挥着重要的作用，但研究者们也发现 BMP 有参与促进软骨细胞肥大性改变及软骨内成骨的作用。一项对 OA 软骨损伤的观察研究发现，BMP-2 能够通过 Smad1、Smad5、Smad8 介导蛋白激酶抑制剂 P57（一种细胞周期抑制物）的表达上调，从而诱导软骨细胞肥大性分化，造成软骨退变^[11]。

综上所述，TGF-β 和 BMP 诱导软骨细胞表型分化的效应，如诱导软骨细胞发生肥大性分化（以 collagen X 和 RUNX-2 表达为特点），或纤维软骨状分化（以 I 型胶原高表达为特点），是限制其进一步临床应用的主要因素^[12]。因此，如果能找到一种减少或降低这些不良影响的方法，将对开发一种有效的软骨修复组织工程技术手段至关重要。那么，能否通过选择性的阻滞 Smad1、Smad5、Smad8 信号途径以抑制软骨表型改变，调节软骨代谢平衡紊乱，最终达到促进软骨基质合成和软骨修复的目的，将是今后进一步需要研究的课题方向。

1.3. FGF

FGF 家族包含二十几个成员，具有高度同源性，其中的两个成员 FGF-18 和 FGF-2 在软骨生长与稳态维持等方面有举足轻重的作用。FGF-18 能够通过激活成纤维生长因子受体 3，诱导软骨细胞增殖和 Sox 基因家族成员 Sox-9 的表达上调，刺激软骨细胞产生更多的Ⅱ型胶原和细胞外基质^[13]，促进人体关节软骨细胞的合成代谢。Howard 等^[14]的研究表明，在羊关节软骨缺损后，通过微骨折手术联合缺损处 FGF-18 注射治疗，较单用微骨折手术治疗能够显著改善关节抗压能力，促进软骨基质生成，减少关节软骨退变。

与 FGF-18 促进软骨修复的作用不同的是，FGF-2 主要通过激活 FGF 受体 1，上调 MMP-1、MMP-13，解聚蛋白样金属蛋白酶（a disintegrin and metalloproteinase with thrombospondin-like motifs，ADAMTS）的表达，抑制软骨基质生成^[15]，并能介导炎性细胞的富集。此外，也有研究显示，对软骨缺损周围软骨下骨定向给与低剂量 FGF-2，能够上调 BMP-2、BMP-4 和 Sox-9 的表达，促进软骨缺损修复再生^[16]，FGF-2 似乎对软骨细胞还有较强的促进有丝分裂作用^[17]。但总的来说，目前人们对 FGF 通路的细胞内信号转导还缺乏细致的了解，对 FGF 与其他细胞通路之间的相互作用还没有深入的认识，未来人们仍需要在这方面做更深入的研究。

1.4. IGF

IGF 是一类低分子量肽，受生长激素的调控，主要分泌于骨和软骨中。它们能够经多种信号转导通路，如：细胞外信号调节激酶（extracellular signal regulated kinase，ERK）、p38 MAPK、c-Jun N-末端激酶（c Jun N terminal kinases，JNK）等介导，调节关节软骨细胞生理和病理条件下的代谢状态。

IGF-1 能够刺激软骨细胞增殖、促进蛋白聚糖和Ⅱ型胶原的合成、诱导间充质干细胞向软骨细胞分化，此外还能够维持软骨细胞表型^[18-19]。然而，软骨细胞对 IGF-1 作用的反应能力随年龄增长和 OA 的发生而降低^[20]，这一点或许会限制 IGF-1 的临床应用。但已有研究报道，在退行性病变的软骨中，IGF-1 和 TGF-β1 的联合应用相比较单独使用 IGF-1 更能促进软骨细胞增殖，增加总的软骨形成^[21]。此外，Uchimura 等^[22]的研究表明，IGF-2 也能够抑制 IL-1β 诱导的 MMP-13 蛋白的表达，从而促进软骨基质的合成。

2. IHH 分子

刺猬蛋白（hedgehog，HH）包括：Desert 刺猬蛋白（DHH）、Sonic 刺猬蛋白（SHH）和 Indian 刺猬蛋白（IHH），其中 IHH 信号通路密切参与软骨形成和生长板中软骨细胞的增殖分化过程。IHH 主要是由肥大前期的软骨细胞分泌，它的配体与补体 1 受体（patched1，PTCH1）结合，终止 PTCH1 对细胞表面受体 Smoothened（SMO）的抑制作用，进而导致 SMO 在软骨细胞纤毛中的富集，并诱导下游的转录因子 Gli 蛋白的启动，最后的结果是上调 RUNX-2（软骨细胞肥大分化过程中的的主要调节因子）的表达，进而诱导软骨细胞肥大性分化、成熟和骨化，最终导致骨赘形成^[23]。但 IHH 信号通路的激活似乎并不会导致软骨基质的分解。Thompson 等^[24]发现，IHH 信号通路激活后，软骨细胞的 Gli1 和 PTCH1 表达上调，但 Gli1 和 PTCH1 的表达上调并不会促进 ADAMTS-5 和 MMP-13 的分泌，也未影响软骨基质的生成，还能够轻微地降低 IL-1β 诱导的 ADAMTS-5 的表达。

此外，IHH 能够刺激早期的软骨膜和软骨细胞产生甲状旁腺激素相关蛋白（parathyroid hormone-related protein，PTHrP），PTHrP 能够保持软骨细胞的增殖和低分化状态，而这种低分化状态会降低 IHH 的产生。因此 IHH/PTHrP 信号通路构成了一种负反馈回路，调节着生长板软骨细胞增殖和软骨细胞的分化过程^[25]。

综上，IHH 信号通路与软骨损伤组织工程治疗结果有潜在的相关性。由于对 IHH 信号的抑制能够减少 OA 动物模型的疾病严重性，因此可以将 IHH/PTHrP 轴向调制作为潜在的治疗方法进一步研究。

3. Wnt 信号分子

Wnt 信号分子在多种细胞的增殖、分化、生长等活动中起着关键性作用^[26]。经典的 Wnt 信号通路指的是 Wnt/β-catenin 信号通路，即通过 Wnt 信号分子的激活导致细胞质内 β-catenin 的稳定、富集和核转移，进而诱导目标基因的转录。

经典 Wnt 信号通路的作用主要在于抑制软骨形成和刺激软骨细胞肥大性分化。在软骨细胞中，Wnt1、Wnt4 和 Wnt8a 都能够激活 β-catenin 信号途径，进而刺激软骨细胞肥大和软骨内成骨，而过表达的 Wnt-5a、Wnt-5b 以及 Wnt 信号分子的拮抗分子 Frzb、Frp3、Sfrp3 等能够抑制这个过程；当然，Wnt 信号分子和 Wnt 调节分子对于 Wnt 信号通路的作用并不是绝对的，还取决于细胞的种类和其他细胞因子的共同作用^[27]。

目前开展的很多实验都证明对 Wnt/β-catenin 信号通路的抑制可以减轻 OA，促进软骨损伤修复。在鼠生长板软骨损伤修复过程中，Wnt/β-catenin 信号通路与软骨损伤后炎症、间充质干细胞浸润、损伤处骨组织形成和重塑密切相关，而对 β-catenin 通路的抑制能够增加软骨组织生成，减少异位骨生成^[28]。此外，Lietman 等^[29]的研究显示，Wnt 抑制剂 XAV-939 和 C113 能够减少滑膜成纤维细胞的增殖和Ⅰ型胶原的合成，通过抗分解代谢的作用促进 OA 造成的软骨损伤修复。

毫无疑问这些研究都有力地说明了 Wnt/β-catenin 信号通路在 OA 发病机制中的关键作用，且对此信号通路的调控可能成为潜在的软骨修复治疗方案。然而，由于 Wnt 信号分子和其他信号分子作用相互交错的复杂性，人们尚需进一步的研究以更好地描述软骨细胞中具体单个 Wnt 信号分子以及其抑制剂作用与软骨损伤及修复的相关性。

4. HIF 因子

健康的关节软骨是典型的无血管组织，主要从关节滑液和软骨下骨中汲取营养和氧气。这种低氧条件下软骨细胞的存活及其功能维持依赖于 HIF 家族成员介导的适应性机制。除低氧状态之外，炎性细胞因子（如 IL-1 和 TNF-α）、机械压迫等造成软骨损伤的关键因素也能刺激 HIF 的表达上调。

越来越多的研究显示，HIF 在软骨损伤与修复中起到了关键的作用。低氧状态下过表达的 HIF-1α 可以刺激人骨髓细胞向软骨细胞表型的转化，促进软骨形成，并抑制软骨肥大性分化^[30]；还能够上调两个主要基质成分Ⅱ型胶原和蛋白聚糖的表达，促进软骨基质的合成，从而抑制软骨损伤^[31]。HIF-2α 是 HIF 家族的另一个成员，与 HIF-1α 具有广泛的结构同源性。HIF-2α 已被确定为软骨内成骨过程的广泛调节因子^[32]，包括调节软骨细胞肥大性分化、软骨退行性病变和血管侵蚀。Hwang 等^[33]和 Li 等^[34]的研究清楚地表明了 HIF-2α 诱导软骨破坏的作用，它可以通过上调多种降解酶（MMP-1，MMP-3，MMP-13，ADAMTS-4）的表达，导致进行性软骨损伤。由此可见，软骨损伤应激后的 HIF 通路与调节软骨细胞代谢密切相关，但 HIF-1α 和 HIF-2α 作用却迥然不同，究竟二者在软骨损伤分子机制中谁占据主导作用。人们是否可以针对 HIF 通路找到稳定的促进软骨修复的方法，还需要更深入的研究。

5. MAPK

哺乳动物体内 MAPK 主要有三大类别：ERK、JNK 和 p38 MAPK，它们能够调控多种转录因子的磷酸化启动，控制着大量细胞外刺激向特定的细胞内反应的转化。

MAPK 信号通路能够调节软骨形成、成熟和软骨内骨化等过程，它们的改变（特别是 p38 和 ERK）对 OA 发病和进展过程中软骨细胞功能障碍有非常突出的作用。研究表明，对 P38 信号通路的阻滞能够抑制 OA 软骨中软骨细胞凋亡，并减少炎性细胞因子 IL-1β、IL-6 和 TNF-α 的表达，延缓软骨损伤^[35]。此外，Chen 等^[36]在软骨细胞肥大区观察到强烈的 ERK 信号通路的启动，他们发现通过对 ERK 通路的抑制能够延缓软骨细胞在软骨内成骨过程中的终末分化，表明了 ERK 在软骨内成骨的过程中发挥了关键性作用。

MAPK 信号通路作为细胞外刺激向细胞内反应的转导中枢，受到多种信号分子作用的影响，如参与 IL-1 等诱导的 OA 软骨细胞中 MMP 表达上调^[37]。由此可见，软骨损伤过程中 MAPK 信号通路的始动因素复杂多样，仍需要针对其与各种损伤因素或分子之间的作用关系开展大量的研究工作。

6. NF-κB

NF-κB 转录因子是一类广泛表达的细胞因子，软骨损伤过程中 NF-κB 信号通路能够被纤维连接蛋白片段、促炎因子（如 TNF-α、IL-1β 等）、机械应力和软骨基质降解物等多种因素激活，之后 NF-κB 独自或和其他信号通路［如：5'-磷酸腺苷依赖蛋白激酶（adenosine 5'-monophosphate activated protein kinase，AMPK）、Wnt 等］共同作用，阻碍软骨细胞的合成代谢反应，并刺激多种软骨基质降解酶的分泌，最终导致关节软骨破坏^[38]。

NF-κB 分子还可以通过诱导 collagen X 和前列腺素 E2、一氧化氮、一氧化氮合酶和环氧合酶 2 的生成，促进 OA 软骨细胞分解代谢相关细胞因子的合成、软骨炎症的进展和软骨细胞凋亡^[39]。OA 软骨细胞 NF-κB 信号的长期启动还会影响其他调节转录因子，如 E74 样因子 3、HIF-2 和 RUNX-2，这些转录因子能刺激多种 MMP 的产生，阻碍Ⅱ型胶原和蛋白聚糖的生成^[40]。因此许多研究者希望通过阻断 NF-κB 信号的方式来寻找软骨修复的潜在方法。如 Xu 等^[41]的研究显示，丹参能够通过阻滞 NF-κB 信号通路降低 OA 软骨细胞中 MMP-9 和 MMP-13 的表达和活性，并上调 Bcl-2 蛋白（能够抑制细胞凋亡）的表达，减少细胞凋亡率，从而减缓关节软骨损伤。

7. 讨论

综上，几乎所有关节软骨损伤的过程都涉及促炎介质的浸润，软骨基质降解及软骨细胞表型的改变，而这些软骨合成、分解代谢之间的稳态变化是由多种信号分子共同驱动的^[42]。它们或是促进软骨修复，或是抑制，或是协同作用，几乎都得到了广泛深入的观察研究，对于人们进一步理解损伤软骨的代谢变化，寻找软骨修复治疗靶点起到了关键性的作用。

然而，随着研究的深入，人体复杂的代谢环境下各信号分子作用之间存在着显著的串扰，它们彼此之间的关系尚需进行充分的研究以便阐释清楚；单个信号分子触发多种下游信号通路的复杂过程还需要进一步实验研究探明。此外，还可以利用高通量检测技术对软骨损伤过程中的代谢变化进行测定，以更加详尽地了解各种信号分子交互作用的调节网络，使人们在针对软骨损伤的治疗上有的放矢。

此外，目前很多研究都是通过干预单一信号分子作用促进软骨修复，而忽略了软骨损伤及修复过程中其他信号通路的共同作用，那么是否可以通过刺激多种信号通路共同作用达到更加稳定、可控的治疗效果，有待未来进一步研究去探索发现。

Funding Statement

国家自然科学基金面上项目（81673995）；江苏省自然科学基金青年基金项目（BK20151007）；江苏省研究生科研创新计划（KYCX17_1308）