胶质瘤微环境中髓源性抑制细胞的作用研究进展

Abstract

胶质瘤是人类大脑中最常见的原发性肿瘤，预后不良，由胶质瘤细胞引发形成的局部和全身免疫抑制环境使其能够逃避免疫监视。在人体的免疫抑制系统中，髓源性抑制细胞（MDSCs）是非常重要的组成部分，由早期髓系祖细胞和前体细胞共同组成，是一种异质性细胞群，这些细胞虽在表型和功能上具多样性，但是都表现出了很强的免疫抑制特点。在胶质瘤组织中，存在 MDSCs 的广泛浸润，它们在胶质瘤微环境中发挥着极为重要的免疫抑制作用，导致肿瘤的免疫疗效大大降低。本文将回顾总结脑胶质瘤微环境中 MDSCs 的表型特征及其在胶质瘤进展中的作用机制，对更好地了解胶质瘤的发病机制并探索有效的综合治疗方案具有积极的意义。

引言

胶质瘤是最为常见的原发性颅脑恶性肿瘤，其常规的临床治疗手段以手术切除为主联合放射治疗、化学治疗等，但总体治疗效果不佳^[1]。传统的肿瘤治疗策略主要着眼于直接杀伤肿瘤细胞，近些年的研究发现，在肿瘤的发生与发展过程中肿瘤微环境发挥着极为关键的作用，对肿瘤治疗效应也有深远的影响^[2]，靶向肿瘤细胞所处的微环境成为医治肿瘤的新途径。

髓源性抑制细胞（myeloid-derived suppressor cells，MDSCs）是一群由髓系祖细胞和多种处于不同分化阶段的粒细胞、巨噬细胞和树突状细胞（dendritic cells，DCs）等髓系前体细胞组成的表型异质性细胞。它广泛浸润肿瘤组织，在肿瘤微环境中发挥着重要的免疫抑制作用^[3]。本文回顾总结脑胶质瘤微环境中 MDSCs 的分子特征及其在胶质瘤进展中的作用等方面的研究成果，为研究胶质瘤的发病机理并探求新的治疗方案提供理论支持。

1. 脑胶质瘤微环境

胶质瘤细胞所处的微环境在肿瘤的发生与发展过程中扮演着极为重要的角色，肿瘤细胞、内皮细胞、免疫细胞及上述细胞所分泌的多种细胞因子共同组成了胶质瘤微环境，其中的巨噬细胞、小胶质细胞、调节性 T 细胞（regulatory T cells，Tregs）、MDSCs、粒细胞、T 淋巴细胞、自然杀伤细胞（natural killer cell，NK）等免疫细胞的存在以及它们与肿瘤细胞等之间相互作用，共同起到调控微环境内免疫效应的作用^[4]。

1.1. 脑胶质瘤微环境中的主要免疫细胞

近年来，学者们已对中枢神经系统是免疫豁免区域的这一认识加以了修正，认为中枢神经系统也是一种免疫活性器官，与免疫系统有着积极的相互作用。临床研究表明，脑胶质瘤组织中广泛浸润有大量髓系来源细胞，其中绝大多数是小胶质细胞和巨噬细胞，统称为脑胶质瘤相关的小胶质细胞和巨噬细胞（glioma associated microglia/macrophages，GAMs），在胶质瘤微环境中对肿瘤细胞的生长、侵袭等起着关键作用；另一方面，微环境也会影响 GAMs 的成熟。已有研究发现，恶性度较高的脑胶质瘤组织中 GAMs 的量要多于恶性度较低的脑胶质瘤组织^[5]，在浸润性胶质母细胞瘤（glioblastoma multiforme，GBM）中的 GAMs 具有免疫抑制活性^[6]，靶向 GAMs 能够加强机体的抗肿瘤免疫。巨噬细胞的生长与分化依赖于集落刺激因子 1，而胶质瘤细胞表达的集落刺激因子 1 受体可以促进 GAMs 的聚集并向 M2 型巨噬细胞极化。在胶质瘤小鼠模型中，使用集落刺激因子 1 受体抑制剂可以使肿瘤缩小并延长小鼠的生存时间^[7]。

MDSCs 为不成熟的异质性髓样细胞群，通过影响 Tregs、NK 细胞、DCs 和 T 细胞等的功能^[8]，参与肿瘤介导的免疫逃逸。研究发现，胶质瘤患者外周血中 MDSCs 数量明显多于正常对照组，肿瘤组织中浸润的 MDSCs 随肿瘤级别的增加而增加，并能抑制 T 细胞功能^[9-10]。而到达肿瘤部位的 MDSCs，要发挥其免疫抑制功能还需要经过进一步的扩增和活化过程。其中，肿瘤细胞、活化 T 细胞和间质细胞所产生的环氧化酶 2（cyclooxygenase-2，COX-2）、血管内皮生长因子、白细胞介素 6（interleukin-6，IL-6）、前列腺素、巨噬细胞集落刺激因子（macrophage colony stimulating factor，M-CSF）等，通过 Janus 激酶 2/信号转导和转录激活子 3（Janus kinase 2/signal transducer and activator of transcription 3，JAK2／STAT3）等信号通路促进 MDSCs 的增殖^[11]，促炎性因子 S100A8、S100A9、IL-10、COX-2 和前列腺素 E2 等在髓源性细胞分化受阻形成 MDSCs 过程中也起重要作用^[12-13]。胶质瘤细胞会分泌大量的细胞因子招募 MDSCs 在肿瘤部位积聚，它们与肿瘤细胞之间通过复杂的、多步骤的相互作用而形成免疫抑制微环境以利于肿瘤的扩增。

在正常人体内只存在较少的 Tregs，但在几乎所有肿瘤中 Tregs 的数量均大大增加。肿瘤微环境中的 Tregs 可正向调控肿瘤细胞、肿瘤相关成纤维细胞、M2 型巨噬细胞和 MDSCs 等免疫抑制细胞，负向调节细胞毒性 T 淋巴细胞和 NK 细胞等免疫刺激细胞。研究发现脑胶质瘤组织中同样存在大量的 Tregs，肿瘤组织中 Tregs 的浸润程度与肿瘤的来源和病理分级等密切相关^[14]。Tregs 在脑胶质瘤微环境中的募集和激活会对抗肿瘤免疫应答产生不利影响，例如：Maes 等^[15]采用抗 CD25 单抗治疗荷瘤小鼠，结果导致脑浸润性 Tregs 减少而 CD8⁺T 细胞增加并可以加强对肿瘤细胞的细胞毒性作用；Sampson 等^[16]的临床试验研究也得出了类似的结果，表明 Tregs 在胶质瘤微环境中发挥极其重要的免疫抑制作用，靶向清除 Tregs 或许可为胶质瘤的临床治疗带来新的希望。

在脑胶质瘤免疫抑制微环境中，GAMs、MDSCs、Tregs 等细胞发挥着至关重要的作用，针对这些细胞开展治疗研究，有望提高胶质瘤的疗效。除了上述细胞，CD4+辅助性 T 细胞、CD8+细胞毒性 T 细胞、NK 细胞等免疫细胞也存在于胶质瘤微环境中，但这些细胞的功能往往受到肿瘤细胞、MDSCs、Tregs 等细胞的抑制，不能发挥正常的免疫功能^[17-19]。

1.2. 脑胶质瘤微环境中的主要细胞因子

胶质瘤细胞和基质细胞所产生的细胞因子构成胶质瘤微环境的重要组成部分，趋化因子 CC 模式 (chemokine C-C motif，CC) 配体 2（CC ligand 2，CCL2）是其中最重要的细胞因子之一，它通过与 CC 趋化因子受体（CC chemokine receptor，CCR）家族中的 CCR4 或 CCR2 结合，激活 JAK2／STAT3 等通路，靶向 MDSCs、Tregs、T 淋巴细胞、NK 细胞等。研究发现，胶质瘤细胞自身或诱导 GAMs 产生 CCL2，招募 Tregs 和 MDSCs 在肿瘤微环境中聚集^[20]。采用 CCR4 小分子抑制剂阻断 CCL2 与 CCR4 结合，可明显提高胶质瘤模型小鼠的中位生存期。免疫抑制因子 IL-10 和转化生长因子-β（transforming growth factor beta，TGF-β）在脑胶质瘤进展中也发挥重要作用。脑胶质瘤组织中呈现高表达 IL-10 和 TGF-β，并与肿瘤的恶性程度之间具有相关性，T 细胞介导的抗肿瘤免疫应答能被胶质瘤细胞分泌的 IL-10 和 TGF-β 所抑制^[21-22]。而 MDSCs 和 Tregs 中也同样高表达 IL-10 和 TGF-β，这些因子进一步可抑制其它免疫细胞的功能，如抑制 DCs 分化、降低 NK 细胞的细胞毒性、抑制 T 细胞的活化和杀伤功能等^[23-24]。除了上述免疫细胞因子之外，其它的一些细胞因子，如巨噬细胞迁移抑制因子（macrophage migration inhibitory factor，MIF）、钙结合蛋白 S100、B7 同系物 1（B7 homolog 1，B7-H1）、粒细胞—巨噬细胞集落刺激因子等也参与了胶质瘤免疫抑制微环境的形成过程^{[10, 25-27]}。总之，细胞因子是肿瘤微环境中肿瘤细胞、免疫细胞等各细胞组份之间传递信息的信号分子，有必要深入探讨它们与各种细胞之间的作用机制并进行干预研究，从而全面认识肿瘤免疫逃逸机制，为发展更有效的肿瘤综合治疗方案提供坚实的理论基础。

2. MDSCs 的表型及分子特征

MDSCs 在脑胶质瘤免疫抑制微环境中起着十分重要作用。在健康人体骨髓中，不成熟的骨髓细胞会快速分化为成熟的巨噬细胞、粒细胞以及 DCs 细胞，起免疫监视作用。但当人体处于病理状况时，这些髓系起源的前体细胞在多种细胞因子作用下成熟分化受到阻碍，停滞在各个分化阶段而成为 MDSCs，因此髓系祖细胞和多种处于不同分化阶段的粒细胞、巨噬细胞和 DCs 等髓系前体细胞组成的表型异质性细胞群体即为 MDSCs。对人及啮齿类动物的研究结果显示，MDSCs 主要有 2 种不同的类型，即多形核 MDSCs（polymorphonuclear MDSCs，PMN-MDSCs）和单核 MDSCs（monocytic MDSCs，M-MDSCs）。所有的 MDSCs 都起源于普通的骨髓祖细胞，而且它们的扩增可能受到相同因子的支配，如 M-CSF 等^[3]。M-MDSCs 的生成是由于单核细胞的基因重新编码所致，而 PMN-MDSCs 则可能是起源于中性粒细胞^[28]。

MDSCs 在不同种属中具有不同的表型特征。在大小鼠中，一般将表型为 CD11b⁺Gr-1⁺的细胞定义为 MDSCs，其中 CD11b、Gr-1 分别是髓系细胞表面标志物和粒细胞分化标志物，Gr-1 为淋巴细胞抗原 6 复合物（lymphocyte antigen 6 complex，Ly-6）家族成员。小鼠体内的 MDSCs 又可以按照 Ly-6G 和 Ly-6C 的相对表达量分为两种亚型，即表型为 CD11b⁺Gr-1^hiLy-6C^lowLy-6G⁺CD49d⁻的 PMN-MDSCs 和表型为 CD11b⁺Gr-1^intLy-6C^hiLy-6G⁻CD49d⁺的 M-MDSCs^[29]。而相比于啮齿类动物，人类 MDSCs 的类型则比较复杂，至今尚无一个明确的定论，目前被大家广泛接受的是将 CD11b⁺CD14⁺CD33⁺HLA-DR^−/lowCo-receptor^−/low细胞称为 M-MDSCs，将 CD11b⁺CD15⁺CD33⁺Lin⁻HLA-DR^−/low表型细胞称为 PMN-MDSCs，两类细胞均有骨髓标志物 CD33 和 CD11b 的表达，而缺乏一般细胞标志物和人类白细胞抗原 DR 抗原（human lymphocyte antigen DR，HLA-DR）的表达。此外，人 MDSCs 中还存在一种相对更不成熟的亚型，即 MDSCs 的早期类型。更有报道将 MDSCs 分为 MDSCs-1～MDSCs-6 共 6 种类型^[30]。由此可以看出，人类 MDSCs 比啮齿类动物具有更加丰富的表型，而且随着研究的不断深入，越来越多的证据显示，MDSCs 在不同肿瘤中的表型及作用也存在差异。所以，要探索 MDSCs 在各种肿瘤中的作用机制，确定肿瘤中 MDSCs 的亚型是首要工作。

除了细胞起源和表型特征不同外，机体内 MDSCs 的增殖和作用机制也不同。首先，PMN-MDSCs 和 M-MDSCs 在不同肿瘤模型中所占的比例各不相同，PMN-MDSCs 的增殖速度要稍快于 M-MDSCs。其次，两种亚型细胞抑制 T 细胞功能的机制也不尽相同，其中，PMN-MDSCs 抑制 CD8⁺ T 细胞主要是通过产生活性氧发挥作用，而 M-MDSCs 则通过产生一氧化氮合酶 2、精氨酸酶（arginase，ARG）1 和活性氮抑制 CD4⁺ T 细胞功能^[31]。

3. MDSCs 在胶质瘤进展中的作用

3.1. 胶质瘤细胞在体外诱导正常单核细胞转化为 MDSCs

MDSCs 在正常人体内处于比较低的水平，参与维持自身免疫状态、缓解炎症反应，但在恶性肿瘤中则保护肿瘤细胞逃避免疫监视。研究显示，与胶质瘤细胞共培养后，正常的单核细胞在体外可发生转化而获得 MDSCs 样的特征。Rodrigues 等^[23]将健康人 CD14⁺单核细胞与人 GBM 细胞一起培养 48 h 后，用磁珠分选出其中的 CD11b⁺细胞，经分析发现这些细胞具有免疫抑制特性及 MDSCs 样的特征，能更强地诱导淋巴细胞凋亡，细胞中免疫抑制因子 B7-H1、IL-10、TGF-β 等表达增加。Kumar 等^[32]用胶质瘤细胞培养基培养正常人单核细胞也可以诱导出 MDSCs。体外研究结果提示，可通过单核细胞与胶质瘤细胞体外共培养来获得 MDSCs，这为研究 MDSCs 在胶质瘤进展中的作用提供了很好的体外实验模型。

3.2. 胶质瘤患者以及模型小鼠的血液和肿瘤组织中 MDSCs 数量增加

胶质瘤和其它侵袭性肿瘤类似，肿瘤患者的血液和肿瘤组织中 MDSCs 的数量显著增加，并且可能与肿瘤的恶性程度具有相关性。GBM 患者外周血单个核细胞（peripheral blood mononuclear cells，PBMCs）中总 MDSCs（CD33⁺HLA-DR⁻表型）的比例明显高于健康对照组^{[23, 33]}，而总 MDSCs 又可分为三个亚群，即 PMN-MDSCs（CD15⁺CD14⁻）、早期阶段 MDSCs（CD15⁻CD14⁻）和 M-MDSCs（CD14⁺CD15⁻），在肿瘤患者中三个亚群分别占 82%、15% 和 3%。GBM 患者外周血中 MDSCs 的积聚可能促进对 T 细胞的免疫抑制作用，而患者血浆中 ARG 活性和粒细胞集落刺激因子水平显著升高，可能与 MDSCs 的抑制功能及 MDSCs 的增殖有关^[32]。类似的结果可参见 Gielen 等^[9-10]的研究，胶质瘤患者外周血 PBMCs 中总 MDSCs 及其中的 M-MDSCs 和 PMN-MDSCs 两个亚群均显著高于健康对照组，并随肿瘤级别的升高而增加，而且两个亚群之间具相关性，这些 MDSCs 都表现出更强的活化特征，具有较强的抑制 T 细胞的功能。而胶质瘤组织中同样有 MDSCs 的浸润，并以 PMN-MDSCs 细胞亚群为主。胶质瘤患者 M-MDSCs 细胞内高表达 MDSCs 活化标志物 S100A8、S100A9，而 ARG 则在 PMN-MDSCs 中表达量较高。Dubinski 等^[34]研究了 52 例原发性 GBM 患者的 MDSCs 特征，也发现患者外周血 PBMCs 中 M-MDSCs 和 PMN-MDSCs 亚群比例明显增加，其中 PMN-MDSCs 以中性粒 MDSCs 为主，细胞同样具有较强的抑制 T 细胞的能力。而在肿瘤组织中以粒细胞亚群占多数，M-MDSCs 和中性粒 MDSCs 比例显著升高，M-MDSCs 强阳性表达 IL-4Ra 和 ARG1，PMN-MDSCs 与 CD4⁺效应记忆性 T 细胞之间具很强的相关性。结果提示，渗入到胶质瘤组织中的 MDSCs 会受肿瘤微环境所影响而被激活，其中以 M-MDSCs 更为突出。在 Raychaudhuri 等^[35]研究中，GBM 肿瘤组织中 MDSCs 约占 5.4%，其中 54% 为 Lin⁻细胞，PMN-MDSCs 和 M-MDSCs 分别约占 40% 和 6%。可能是受研究的样本量、获取肿瘤组织中 MDSCs 的方法以及不同的亚群分析等因素的影响，各研究团队所测得的 MDSCs 比例不尽相同，但都可以说明胶质瘤患者外周血和肿瘤组织中存在不同表型的 MDSCs，并随着患者病情的进展而逐渐积聚增多。

胶质瘤动物模型中获得的实验结果也验证了对临床样本的分析结论，MDSCs 在正常小鼠脑组织中数量较少，但在外周血和脑胶质瘤组织中比例升高。Raychaudhuri 等^[35]从小鼠 GBM 模型中制备肿瘤组织悬浮液，经流式细胞术分析发现组织中 MDSCs 约占 8.1%，其中 M-MDSCs 亚群较多，其次是 PMN-MDSCs，而且肿瘤组织中 M-MDSCs 的比例显著高于非荷瘤鼠脑组织。用舒尼替尼药物处理荷瘤小鼠后，PMN-MDSCs 和 M-MDSCs 在肿瘤组织中的浸润均减少，PMN-MDSCs 在外周血中的数量降低，从而延长了小鼠的生存期。该研究表明，舒尼替尼可能是通过减少 MDSCs 而促进其抗肿瘤免疫作用。将小鼠胶质瘤细胞接种至小鼠颅内致肿瘤生长，如同时接种正常单核细胞可使肿瘤生长加快，肿瘤中 MDSCs 增加，同时小鼠脾脏和骨髓中 MDSCs 的比例也升高^[36]。由此可见，肿瘤微环境可将正常单核细胞转化为 MDSCs，这也验证了体外实验研究的结果^{[23, 32]}。

3.3. 靶向 MDSCs 的肿瘤免疫治疗

MDSCs、Tregs 等免疫抑制细胞可在胶质瘤细胞的作用下在肿瘤微环境中集聚和活化，导致肿瘤细胞逃避免疫监视，因此针对 MDSCs 进行干预或许可为肿瘤治疗打开新的局面。目前，研究人员通过动物实验已取得了一些成果，有研究显示，胶质瘤干细胞可通过分泌 MIF 选择性驱动肿瘤微环境中 MDSCs 所介导的免疫抑制，从而促进 GBM 免疫逃逸，间接驱动 GBM 的进展^[25]。增加 MIF 可提高 MDSCs 中的 ARG1，靶向抑制肿瘤来源的 MIF 可增加肿瘤内细胞毒性 T 细胞反应，赋予荷瘤小鼠生存优势。而正常 CD14⁺单核细胞培养于人胶质瘤条件培养基中可转化为 MDSCs，采用 MIF 抑制剂萝卜硫素处理后，可抑制该转化过程的发生^[32]。酪氨酸激酶抑制剂舒尼替尼可通过减少荷瘤小鼠 MDSCs，而促进抗肿瘤免疫^[35]。Fujita 等^[37]发现 COX-2 通路可通过促进全身性 MDSCs 的增殖及在肿瘤微环境中的聚集，抑制细胞毒性 T 细胞的浸润，从而促进胶质瘤的进展，抑制该通路则可缓解 MDSCs 介导的免疫抑制从而抑制肿瘤的生长。采用慢病毒载体转染小 RNA 以降低肿瘤来源的半乳糖凝集素 1，可以降低小鼠脑中浸润巨噬细胞和 MDSCs 的数量，显著延长荷瘤小鼠生存期。靶向胶质瘤来源的半乳糖凝集素 1 可为胶质瘤患者提供一种辅助治疗手段^[19,38]。Zhang 等^[39]用过继转移的抗原特异性 T 细胞处理荷瘤小鼠并全身注射 Toll 样受体 1/2（Toll-like receptor 1/2，TLR1/2）激动剂，该激动剂可保持荷瘤鼠大脑中 T 细胞的存活、增殖和抗肿瘤效应，通过上调 CD8⁺ T 细胞和下调 MDSCs 来改造肿瘤微环境，从而使小鼠获得免疫保护，生存期延长。

按目前的标准方案治疗胶质瘤，特别是 GBM，患者生存率仍然很低。肿瘤细胞可通过诱导 MDSCs 聚集等多种途径形成免疫抑制微环境，因此要产生有效的抗肿瘤反应需要多管齐下。胶质瘤细胞 GL261 和 U87 因高表达趋化因子 CCL2 可招募 Tregs 细胞（CCR4⁺）和 MDSCs（CCR2⁺）到肿瘤微环境中^{[20, 40]}，用抗 CCL2 抗体处理荷瘤小鼠可延长小鼠的生存期，肿瘤中 MDSCs 和 GAMs 的数量减少，而联合使用化疗药物替莫唑胺进行综合治疗疗效更好^[40]。这为联合以单抗为基础的免疫治疗和替莫唑胺化疗综合治疗胶质瘤提供了实验依据。在肿瘤浸润免疫细胞中 MDSCs 占比大于 40%，细胞表达 IL-4 受体 α 链、诱导型一氧化氮合酶、程序性死亡配体 1（Programmed death ligand 1，PD-L1）、ARG 和 CD80 等分子参与对 T 细胞的抑制作用。Kamran 等^[41]研究发现，去除 MDSCs 可增强胸苷激酶/Fms 样酪氨酸激酶配体基因治疗所诱导的肿瘤特异性 T 细胞（CD8⁺）应答，从而延长荷瘤小鼠生存期，而结合阻断 PD-L1 或细胞毒 T 淋巴细胞相关抗原 4 也可提高 TK/Flt3L 基因治疗的疗效。总之，阻断 MDSCs 所介导的免疫抑制联合基因治疗有望提高 GBM 的治疗效果。

4. 结语

肿瘤微环境对于肿瘤的发生与发展十分重要，因此如今有愈来愈多的研究者加入到深入探索肿瘤微环境的队伍中，研究者希望研制出通过调控肿瘤微环境从而抑制肿瘤生长的治疗方案。肿瘤的免疫抑制诱导肿瘤的发生与发展，同时也阻碍了抗肿瘤治疗，特别是免疫治疗。打破肿瘤介导免疫抑制的平衡使之倾向于肿瘤免疫排斥，是目前正在进行的各种免疫治疗的理论基础。作为免疫抑制的重要组成部分，MDSCs 在肿瘤免疫治疗中的作用也备受关注。MDSCs 可以广泛浸润到肿瘤组织中，通过介导 T 细胞、巨噬细胞、NK 细胞、DCs 和 Tregs 等免疫细胞抑制机体免疫反应，促进肿瘤的进展，并且 MDSCs 在形态、表型和功能等方面具有多样性，在不同肿瘤中所发挥的作用也不相同，由此也给靶向 MDSCs 的免疫治疗研究带来了挑战。目前尚无确定的分子标志物用来描述人类 MDSCs 及其亚群细胞，研究显示，不同研究团队所分析的胶质瘤临床样本中 MDSCs 及亚群的比例都存在较大差异，这可能与胶质瘤本身及 MDSCs 的异质性都有关。胶质瘤细胞通过各种免疫抑制因子招募 MDSCs 和 Tregs 等细胞在肿瘤微环境中积累形成免疫抑制以驱动肿瘤进展，其机制目前尚不明确，哪些因子所起的作用更为关键，各种细胞成分之间是如何相互联系、相互作用的，都有待于深入探讨。因此，深入了解胶质瘤 MDSCs 的分子特征、亚群分类，探讨 MDSCs 在胶质瘤微环境中增殖、激活、积聚等方面的机制，对开发有效的胶质瘤治疗方案有着较为深远的意义。

Funding Statement

苏州市科技计划项目（SYS201627）