牛心包液氮冷冻减薄后性能研究

Abstract

本文研究了牛心包液氮冷冻并减薄后的性能变化，并与猪心包进行了对比。采用苏木精-伊红（HE）染色的方法进行组织学微结构观察，并通过拉伸试验评价了冷冻和减薄对心包力学性能的影响，组织学观察和力学性能评价均采用猪心包作为对照。结果表明牛心包在液氮冷冻后性能未见区别；冷冻减薄后，割线模量和极限强度与猪心包基本相当，弹性模量略高于猪心包。研究表明，牛心包减薄容易获得理想的厚度和预期的性能，其可作为经导管瓣膜瓣叶材料的一种选择。

引言

经导管瓣膜植入术因其创伤小、恢复快等特点，自 2002 年 Cribier 等^[1]完成首例植入后，发展迅速，对不可外科手术或外科手术存在高风险的患者已经取得了良好的术后效果^[2-3]。但经导管瓣膜植入前需要将瓣膜压缩进小直径的输送鞘管，以降低瓣膜植入引起的血管并发症的发生率^[4-6]。因此，经导管瓣膜瓣叶必须很薄，才能装入小直径的输送鞘管，但同时又要有足够的厚度，以承受工作时产生的各种应力。

牛心包作为生物瓣膜的瓣叶已有 40 多年的历史^[7]，虽然具有与天然心脏瓣膜相似的力学性质和良好的可获得性，但其较厚，因此部分经导管瓣膜选用更薄的猪心包作为瓣叶以满足较小的输送直径^[8-9]。但是，瓣膜瓣叶对心包的厚度和一致性有一定要求，猪饲养期较短，其心包通常因为太薄而不能满足使用要求，获取一定厚度的猪心包需要额外增加猪的饲养期，会导致成本的增加，并存在一定的难度。生物瓣膜瓣叶的实际生产中，也会因心包厚度问题浪费掉大量心包。考虑到牛心包作为瓣叶材料已被几十年的临床应用认可，因此如果能够将牛心包减薄，适应小输送直径的经导管瓣膜需要，同时提高生物瓣膜瓣叶心包的使用率，降低生产成本，则具有重要的经济价值。

有研究提出使用激光或切削等方式来减薄牛心包^[10-12]，但心包很软，常规的切削加工存在很大的难度。为便于切削加工，Kutty 等^[13]提出在−20 ℃ 下冷冻，然后将心包在冷冻状态下进行切削以减薄。但前述研究只提出了相应的心包减薄的方法，未见到对减薄后心包性能的研究，更未见到相似厚度猪心包和牛心包对比研究的报道。

液氮作为一种常见的冷冻技术，已被广泛用于异体瓣膜的冷冻和保存^[14-16]，因此本研究采用液氮对牛心包进行冷冻，在冷冻状态下对其进行减薄，获得预定厚度的心包。本文首先研究冷冻前后的牛心包微结构的变化，然后以定量方式评价牛心包在冷冻和减薄前后的弹性模量、割线模量和拉伸强度等力学参数的变化，并与类似厚度的猪心包进行比较。本研究将为小输送直径的经导管瓣膜瓣叶提供一种新的材料选择，并提高现有生物瓣膜牛心包的使用率，降低生产成本。

1. 材料和方法

1.1. 样品准备

本研究中所用的牛心包由金仕生物科技（常熟）有限公司提供。牛心包首先从牛屠宰场获得，保存在磷酸盐缓冲液中，然后将心包上附着的脂肪清除，用 Hanks 溶液清洗，最后用 0.4% 的戊二醛磷酸缓冲溶液固定。将固定后的心包平整铺在戊二醛保存液中保存备用。

通过透射光观察心包，选择无明显缺陷的牛心包，在心包片上相邻位置按图1a 所示，选取长 45 mm、宽 5 mm 的 2 条矩形心包条作为一组。然后用精度为 0.01 mm 的厚度测量仪按图1b 所示，测量心包条上 A-E 共 5 点的厚度，选取各点厚度在（0.4 ± 0.05）mm 的牛心包条作为试验样品，然后取各测量点厚度的平均值作为每条心包条的厚度。然后按照同样的方法选取长 45 mm、宽 5 mm、各点厚度在（0.2 ± 0.05）mm 的矩形猪心包条作为对照组。

图 1.

The schematic diagram of samples preparation

样品准备示意图

a. the selection of two bovine pericardium samples in each group; b the positions of the bovine pericardium sample for thickness measurement

a. 每组两个心包条的选取方式；b. 心包条厚度测量点位置

1.2. 冷冻和减薄

取 10 组准备好的牛心包条，一条作为对照样，不作任何处理；另一条平铺在加工胎具内的凹槽中，加工胎具凹槽的深度略小于预期减薄后的厚度，在心包条上放置盖板，防止牛心包在冷冻过程中变形。然后整体将牛心包条、胎具和盖板放入液氮内冷冻 5 min 后取出，去掉盖板，在室温下解冻，解冻后测量并记录心包各点厚度，然后放置到戊二醛保存液中保存。此 10 组样品用于评测心包冷冻前后性能的差异。

再取 10 组准备好的牛心包条，一条作为对照样，另一条按照前述方式进行冷冻，冷冻后取出，去掉盖板，如图2 所示，将加工胎具固定到切削机床的台面上，调整刀具到台面的距离，确保心包条减薄后厚度满足（0.2 ± 0.05）mm 要求。启动切削设备将多余的部分切削掉，减薄到预定的厚度。此 10 组样品用于评测牛心包减薄前后性能的差异。

图 2.

The schematic diagram of the thinning process for bovine pericardium

牛心包减薄过程示意图

1.3. 组织学观察

取 1 组牛心包条，一条作为对照样，另一条按照前述方式进行冷冻减薄。然后将两个心包条经 4% 甲醛溶液固定后进行石蜡切片，在标本纵向切面切成 5 μm 厚切片。进行苏木精-伊红（hematoxylin-eosin，HE）染色，然后在光学显微镜下放大观察。另取 1 条猪心包条，按照同样方式进行样品制备和观察。

1.4. 单轴拉伸测试

为了研究心包冷冻前后以及冷冻减薄前后的力学性质，采用美斯特工业系统（中国）有限公司的 CMT6502 单轴拉伸力学试验机，分别对 10 组冷冻前后、10 组冷冻并减薄前后的牛心包条，以及 10 条猪心包条进行了拉伸测试。心包条两端各夹持 ^[13]5 mm 的高度，拉伸试验机的拉伸速率设为 5 mm/min，将心包条拉伸直至断裂，记录拉伸数据并观察每个心包条的拉伸过程。

1.5. 力学数据分析

图3 是单轴拉伸获得的典型的牛心包应力—应变图。根据文献[17]，其分为伸长阶段 OA 段、线弹性阶段 AB 段、断裂阶段 BC 段三个阶段；OA 段斜率定义为割线模量，AB 段斜率定义为弹性模量，BC 段斜率定义为破坏模量。图中 C 点处的应力值定义为极限强度。根据拉伸试验取得的数据画出心包条的应力—应变曲线，得到割线模量、弹性模量、极限强度等力学参数，计算各组心包条的平均割线模量、弹性模量和平均极限强度及比值，评估牛心包冷冻减薄后的性能。利用 SPSS 统计学软件，采用双样本 t 检验对数据进行统计学分析，P < 0.05 为差异具有统计学意义。另外，为便于直观对比冷冻减薄对牛心包性能的影响，对牛心包冷冻前后的厚度以及冷冻和减薄前后心包所承受的最大拉力也作了相应的对比。

图 3.

Typical stress-strain curves of the bovine pericardium for longitudinal fiber orientation

典型的纵向牛心包材料应力—应变曲线划分

2. 结果

2.1. 组织学观察

图4 为牛心包冷冻前和冷冻减薄后以及未冷冻猪心包 HE 染色后的切片，图中未见牛心包在冷冻前和冷冻减薄后微结构上有任何差异。可以看出牛心包和猪心包的粗糙面，即浆膜侧形态略有不同，可能是纤维编织的方式不同所致，牛心包粗糙面和光滑面更容易辨识。牛心包和猪心包内胶原纤维均呈波浪状排列，猪心包的纤维较疏松，无明显紊乱，纤维间明显可见有细胞分布；牛心包的纤维排列更致密，能明显看出两者截面内纤维排布的差异性。

图 4.

Histologic photos of pericardiums

HE 染色后心包微结构照片

2.2. 冷冻前后力学性能

图5 为牛心包冷冻前后的力学性能对比结果。试验共测试 10 组样品，获得 8 组有效数据。从应力应变曲线和冷冻前后的厚度上可以看出，牛心包液氮冷冻后，与未冷冻相比两者未见明显区别。冷冻后割线模量略低于冷冻前，但差异无统计学意义。在弹性模量、极限强度和承受的最大拉力方面，冷冻后心包略高于未冷冻的心包，但差异也无统计学意义。

图 5.

The mechanical properties of bovine pericardium before and after liquid nitrogen freezing (*P < 0.05)

牛心包冷冻前后的力学性能（*P < 0.05）

2.3. 减薄前后力学性能

图6 为牛心包冷冻并减薄后前后的力学性能对比结果。试验共测试 10 组样品，获得 10 组有效数据。从应力应变曲线可以看出，液氮冷冻并减薄后的牛心包以及未作任何处理的猪心包，与未冷冻减薄的牛心包相比，曲线形式上未见明显区别，但可承受的极限应力明显低于未减薄的牛心包，两组间差异具有统计学意义（P < 0.05）。对于割线模量、极限强度，未减薄的牛心包最高，猪心包略低，减薄后的牛心包最低，三者差异均无统计学意义。对于弹性模量，未减薄的牛心包最高，减薄后的牛心包次之，猪心包最低，虽然存在差异，但差异无统计学意义。整体来看，除极限应力外，其他性能差异均无统计学意义，但减薄后牛心包对应指标略低于减薄前，割线模量、弹性模量和极限强度大体降低为减薄前的 80%。相对于猪心包，割线模量、弹性模量和极限强度上的差异虽均无统计学意义，但牛心包弹性模量的值相对较高。

图 6.

The mechanical properties of bovine pericardium before and after thinning in comparison with porcine pericardium (*P < 0.05)

心包减薄前后力学性能及与猪心包的对比（*P < 0.05）

3. 讨论

3.1. 冷冻前后性能比较

牛心包在液氮冷冻后微结构无可见区别，这点与之前报道的采用液氮冷冻人体自然瓣膜的研究结果一致，该研究也表明采用液氮冷冻后瓣膜的组织结构与冷冻前相似^[14-16]。表明液氮可以应用于牛心包的冷冻，不会对心包的微结构产生改变。

力学性能方面可以看出，采用液氮冷冻后的牛心包与未冷冻的相比，其割线模量、弹性模量和厚度差别不大，差异均无统计学意义。这也从侧面印证了冷冻前后心包的微结构未产生可见的变化。极限强度的差异虽无统计学意义，但其值有所增加。这可能是因为虽然选取的每组心包条中的两个心包条位置接近，但因为心包纤维走向多变^[18-19]，在选择时虽特别注意保持两个心包条的纤维走向的一致性，但难免有所差异，心包纤维走向的差异会对心包力学性能产生明显影响^{[17, 20-22]}。从散点图上测试点的离散情况也可以看出，有两个测试点冷冻后明显离散较大。

3.2. 减薄前后性能比较

采用液氮冷冻并减薄后的牛心包与未冷冻减薄的牛心包相比，应力应变曲线形式上未见明显区别，只是承受的极限应力明显降低。说明心包减薄只对应地去除了心包的一层承力层，并未对心包结构和其他性能产生严重影响。

关于割线模量、弹性模量和极限强度，其主要取决于心包的内在结构，如果心包厚度方向各部位结构性能一致，减薄只引起整体承力能力的变化，相应模量和强度指标不应有变化。减薄后弹性模量和极限强度相对于减薄前其差异虽无统计学意义，但也均减小到约 80%，因此可能需要更大数据量进一步确认其差异的统计学意义。减薄去除掉的是贴近心包粗糙面的部分，可能牛心包贴近粗糙面部分的刚性更大，承力能力更强，导致减薄后弹性模量和极限强度降低。通常瓣叶类生物材料的承力主要依赖于胶原纤维^[7]，从图4 可以看出牛心包粗糙面波浪形态的胶原纤维较明显。割线模量对应的主要是心包变形伸长阶段^[17]，当胶原纤维去除较多时，承力层减少，心包拉伸变形时前期伸长则会明显增加，因此割线模量会有所降低，这从应力应变曲线上也可以看出。

3.3. 减薄后牛心包与猪心包性能比较

生物瓣膜时代，猪心包很少使用，最近十几年随着经导管瓣膜对小输送直径的需求，猪心包已被广泛地研究^[23-26]。从本研究看，减薄后的牛心包与猪心包相比，应力应变曲线非常接近，割线模量和极限强度略低于同等厚度的猪心包，但其差异无统计学意义。虽然两者弹性模量的差异也不具有统计学意义，但可以看出牛心包略高于猪心包，表明减薄后牛心包相对于猪心包弹性模量更大的特性被予以保留。Caballero 等^[23]的研究也表明牛心包相对猪心包具有更大的弹性模量，并指出此特点有利于提高瓣膜性能。

测试中发现猪心包的微结构与 McGregor 等^[25]的研究相近，其纤维相对细密，如图4 所示，试验中简单辨别其纤维走向不太容易，只是尽可能选择纤维走向与心包条长轴方向一致的心包。而对于牛心包条，为便于对比和从经济角度考虑，只要求减薄前后的两个心包条纤维走向尽可能一致，并未约定纤维走向与拉伸方向的关系。如纤维走向与拉伸方向一致，会明显提高心包的强度^{[17, 20-22]}，这点也可以从图6b 的数据中看出，纤维走向相对一致的猪心包，其偏差相对较窄，而未区分走向的牛心包，其误差线更长。因此如考虑纤维走向影响，减薄后的牛心包的强度可能会高于猪心包。

实际测试中发现猪心包很薄，挑选厚度在（0.2 ± 0.05）mm 的心包难度很大。猪心包的厚度多在0.1～0.15 mm，如要获得较厚的猪心包，可能需要额外增加猪的饲养周期，产生额外成本。因此虽然同等厚度的猪心包和减薄后的牛心包在极限强度上相当，但牛心包减薄后厚度可控制，很容易获得承力明显高于猪心包的稍厚的牛心包。对于经导管瓣膜，瓣叶厚度一般为 0.25 mm，研究表明较薄的经导管瓣膜瓣叶相对于较厚的生物瓣膜瓣叶，其耐久性会降低^[27]。而对于牛心包，其心包厚度通常在 0.3 mm 以上，因此，液氮冷冻后减薄可大幅提高牛心包的利用率，降低成本。生物瓣膜瓣叶也可采用此工艺减薄过厚牛心包，提高心包的使用率。

4. 结论与展望

本文对牛心包采用液氮冷冻前后以及冷冻减薄前后的性能进行了研究。对于牛心包，研究表明在冷冻前后其性能差异无统计学意义。将减薄前和减薄后的牛心包与未作任何处理的猪心包进行对比表明：对于割线模量、极限强度，未减薄的牛心包最高，猪心包略低，减薄后的牛心包最低，但三者的差异无统计学意义；弹性模量方面的差异虽也无统计学意义，但未减薄的牛心包最高，减薄后的牛心包次之，猪心包最低，牛心包弹性模量较猪心包略高的特性在减薄后得到保留；减薄后牛心包整体力学指标略低于减薄前，割线模量、弹性模量和极限强度大体降低为减薄前的 80%。

本研究表明牛心包液氮冷冻减薄可通过较低的成本，获得满足经导管瓣膜要求的低厚度且性能不低于同等厚度猪心包的瓣叶，因此本研究在探索经导管瓣膜瓣叶材料、提高生物瓣膜心包使用率，以及降低成本方面提供了一种较好的选择。

后续需要进一步研究评价不同减薄去除量、光滑面减薄、纤维走向等的影响，以便系统地给出牛心包减薄后的力学性能，更好地控制瓣叶减薄后的性能和质量，指导经导管瓣膜瓣叶的设计和生产。

利益冲突声明：本文全体作者均声明不存在利益冲突。

Funding Statement

国家重点研发计划重点专项子课题（2016YFC1102202）