微滴喷射高通量玻璃化细胞保存的实验研究

Abstract

There is a great demand for blood and stem cells in clinic. It is difficult to achieve high throughput and to increase the cooling rate at the same time during vitrification. In this paper, a micro-droplet spray system with a container collection device was fabricated, and HepG2 cells were sprayed by this system for high-throughput vitrification. First, the container collection device and a cryo-paper were used to receive micro-droplets in the spray vitrification system. The results showed that the cell survival rate and 24h adhesion rate in container collection vitrification group were significantly higher than those in cryo-paper collection group. Second, HepG2 cells were sprayed and vitrified at increased cell density, and it was found that the results of micro-droplet spray vitrification did not change significantly. Finally, micro-droplet spray vitrification is compared with slow freezing. Cell processing capacity in the vitrification group increased, meanwhile, the cell survival rate and 24h adhesion rate in the vitrification group were significantly higher than those in slow freezing group. The results indicated that the micro-droplet spray vitrification system with container collection device designed in this paper can achieve high-throughput cell vitrification, which is of great significance for mass preservation of small cells.

引言

临床上存在着多种需要大体量保存的细胞系统，如血液、干细胞等。举例来说，在急性失血、手术期输血及慢性贫血状况下，常需进行红细胞输血，比如当发生孕妇妊娠后的失血量大于血容量的 20%（1 000 mL）时，应输注红细胞，最终使患者血红蛋白浓度提高到 80～100 g/L^[1]。又比如，血小板在止血和凝血过程中发挥重要作用，输注血小板可达到快速止血的目的。当在进行脑部手术、输尿管修复手术时，需将血小板浓度提高到 100 × 10⁹ 个/L。在自然灾害、军事冲突和临床环境中，成人单次需要的输血量一般达到 200～400 mL^[1]。而干细胞作为一种尚未充分分化、有很大潜能的细胞，具有可再生各种组织器官、进行骨髓移植、抗衰老、辅助药物筛选、进行干细胞治疗等多种用途。当进行造血干细胞移植时，单次造血干细胞悬浮液的需求量是 50～100 mL^[2]。诸如此类的细胞还有很多，因此普遍面临着临床需求量大、细胞严重短缺、保存期有限、需大批量保存等问题。目前，需要大体量保存的细胞系统，常采用的低温保存技术是慢速冷冻法。比如红细胞与血小板的低温保存技术都是采用程序降温的方法，将 200～400 mL 的红细胞或血小板悬浮液慢速降温至− 80℃ 后，保存在− 80℃ 冰箱中^[3]。而造血干细胞常用的冷冻技术也为慢速冷冻法，将 50 mL 造血干细胞悬液放入− 80℃ 低温冰箱慢速降温至− 80℃ 后存储在液氮中^[4]。但慢速冷冻法存在着一些缺点：一方面，在降温和复温过程中易形成冰晶，冰晶会对细胞造成损伤，细胞回收率不高；另一方面，复温后的细胞需要洗脱低温保护剂后方能使用，程序较繁琐。如红细胞与血小板复温后的细胞回收率只有 70%，且红细胞在洗脱保护剂过程中容易产生溶血率高的现象^[3]；造血干细胞复温后的存活率也仅为 80%^[4]。

另一种细胞低温保存技术是玻璃化法，玻璃化法是以极快的降温速率将液体在短时间内直接转化为非晶态的固体。玻璃化法与慢速冷冻法相比需要更高的降温速率（约 10⁵ ℃/min）和更高的保护剂浓度（6～8 mol/L）^[5]。在合理地控制降温速率和适宜的保护剂浓度下，采用玻璃化法可以有效避免胞内外冰晶的形成，低温保存效果良好。提高保护剂浓度以及提高冷却速率都可有效实现玻璃化，但细胞会因为高浓度的保护剂而造成不可逆的毒性损伤和渗透损伤，单纯靠提高保护剂浓度的方法进行细胞低温保存有较大的局限性^[5]。而提高降温速率一般采用两种方法：一是提高传热系数，例如优化载体的传热特性或是将微滴直接喷入液氮中^[6]，即可达到提高传热系数的目的；二是降低微滴体积，有研究显示，当微滴尺寸缩小到约为 0.1 μL 时，通过调控其从微滴表面到微滴中心的降温速率都超过 10⁵ ℃/min 时，即可成功实现玻璃化^[7-9]。目前，玻璃化法保存多用于卵母细胞、胚胎等单个生物样本的保存，如需将其应用于大体量细胞系统的保存，尚面临着一系列挑战，尤其是在提高降温速率与实现高通量之间存在一定的矛盾。

微滴喷射玻璃化保存，是利用喷嘴装置将细胞悬浮液离散成微滴后直接喷入液氮中实现玻璃化保存。Demirci 等^[10-13]曾提出一种微滴喷射装置，该装置利用声学驱动微机械喷射器可产生尺寸极小的微滴，但喷射液体浓度过大时，喷嘴极易堵塞无法实现高通量。Rami 等^[14]提出了一种单喷嘴共流微滴喷射玻璃化保存系统，并将此系统应用于红细胞的保存。该系统由氮气输送喷嘴、细胞悬浮液注射装置、聚乙烯薄片收集装置三部分组成。进行喷射时，氮气输送喷嘴输出氮气流，并与细胞悬浮液形成共流，氮气流将细胞悬浮液离散成微滴并直接喷射至直径为 8.5 cm 的聚乙烯薄片上，薄片用镊子夹取后立即放入液氮中进行玻璃化。然而，该系统尚存在不足处，其缺陷在于直径为 8.5 cm 的薄片每次仅能接收 80 μL 加载有冷冻保护剂（cryoprotectant, CPA）的红细胞悬浮液，其中红细胞密度约为 5 × 10¹² 个/L。若长时间接收，微滴极易堆积造成体积增大，不利于玻璃化保存，因此保存量也非常有限。Samot 等^[15]对此系统进行优化，提出了多喷嘴共流微滴喷射玻璃化保存系统，该系统改单喷嘴为多喷嘴阵列，有限地提高了单次细胞的保存量。但该系统无法控制喷嘴阵列喷射的同时性和喷射的具体范围，并且仍采用薄片式接收方式会存在操作繁琐、细胞污染与丢失等问题。与此对应的，Zhang 等^[16]利用微滴喷射玻璃化系统对卵母细胞进行保存时，就出现了细胞极易丢失的问题。

本文针对小体积细胞系统的大体量玻璃化保存问题，将微滴收集装置调整为容器式收集装置，首先，比较容器式收集装置与薄片式接收方式接收微滴喷射的玻璃化保存效果；其次，增加悬浮液中的细胞密度，研究细胞密度对微滴喷射容器式收集玻璃化保存效果的影响；最后，将微滴喷射玻璃化法保存与慢速冷冻法进行比较，对细胞回收率及细胞活性进行统计，验证微滴喷射高通量玻璃化保存系统的有效性。微滴喷射高通量玻璃化保存有望解决小体积细胞的大体量保存问题。该技术方法可以广泛用于保存其他细胞类型，包括外周血干细胞、天然杀伤细胞、淋巴细胞、成纤维细胞，肝细胞，心肌细胞等，在基于细胞的癌症治疗、再生和移植医学方面都有广阔的应用前景。

1. 材料与方法

1.1. 材料与设备

本文所用材料包括：人肝癌细胞（human hepatocellular carcinomas, HepG2）（上海赛百慷生物技术股份有限公司）；胎牛血清 (fetal bovine serum, FBS)（Biosera 公司，法国）；杜氏改良伊格尔培养基 (Dulbecco’s modified Eagle’s medium, DMEM)（HyClone 公司，美国）；胰酶（Sigma 公司，美国）；D-hanks 平衡盐缓冲液（上海励瑞生物科技有限公司）；台盼蓝染色液（2×）（碧云天生物技术公司）；二甲基亚砜（dimethyl sulfoxide, DMSO）（AppliChem 公司，德国）；海藻糖（Sigma 公司，美国）。

本文所用设备包括：二氧化碳培养箱（MCO-18AC，松下医疗器械有限公司，日本）；程序降温盒（5100-0001，Thermo Fisher 公司，美国)；液氮罐（YDS-50B-125，成都金凤有限公司，中国）；超低温冰箱（DW-8GL388A，青岛海尔特种电器有限公司，中国）；光学显微镜（CFI60，尼康，日本）。

1.2. 微滴喷射玻璃化系统

微滴喷射玻璃化系统主要由氮气流输送装置、细胞悬浮液注射装置、喷嘴、容器式收集装置共 4 部分组成。如图1 所示，氮气流输送装置包括氮气瓶、双表头减压阀和流量计，氮气瓶提供氮气流，流量计调节氮气流速，通过流量计出口端的氮气输出管将氮气输送至喷嘴敞口端；细胞悬浮液注射装置主要由微注射泵和微注射器组成，微注射泵推动微注射器，细胞悬浮液通过微注射器出口针头所连接的悬浮液输送管输送至插入喷嘴的不锈钢针管；喷嘴由 200 μL 的移液器枪头和 25 G/30 G 尖口针头制作而成。将移液枪枪头顶端切除 2 mm，取下针头的不锈钢针管，将针管从距枪头尖端 2 cm 处侧面插入，直至针管露出枪头尖端 2 mm，将喷嘴固定于铁架台上。

图 1.

Schematic diagram of micro-droplet spray vitrification system

微滴喷射玻璃化保存系统图

如图2 所示，为容器式收集装置示意图，它由两部分组成，一部分是用于盛液氮的 350 mL 不锈钢杯，另一部分是用于收集细胞的筛网装置，细胞筛网尺寸与不锈钢杯尺寸相匹配，可贴壁放入不锈钢杯内。细胞筛网是将双层 500 目的尼龙网固定于塑料框架上。一般来说，目数 500 目的筛网，孔径约 28 μm，筛网用双层尼龙网制作而成，所以筛网孔径约 15 μm，这可保证筛网孔径比细胞直径小，从而起到过滤、收集细胞的作用。

图 2.

Schematic diagram of the container collection device

容器式收集装置构成示意图

整个系统的工作原理是：由输出的氮气流和已加载好保护剂的细胞悬浮液构成共流，利用氮气流将含有细胞的悬浮液离散成微滴并直接喷入盛有液氮的容器式收集装置。因产生的微滴体积足够小，降温速率会明显提升，微滴与液氮直接接触实现玻璃化。待喷射完毕，将筛网取出，直接放入 37 ℃ DMEM 培养基中进行复温。

氮气流量、悬浮液注射速度、针头型号、接收位置距喷嘴距离等因素对微滴喷射效果都有很大影响，本课题组张宵敏^[17]通过喷射液滴大小、喷射后细胞的损伤程度等对微滴喷射参数进行了优化。基于张宵敏^[17]的研究结果，本文采用的优化喷射参数为：氮气流量为 3.2 L/min，悬浮液注射速度为 200 μL/min，30 G 针头作喷嘴，接收位置为距喷嘴 6 cm 处。

1.3. 细胞存活率及 24 h 贴壁率测定方法

本文采用台盼蓝染色法测定细胞存活率，其原理在于：台盼蓝染料可以穿过损伤或死亡细胞的细胞膜，并与已解体的 DNA 结合使其上色，但却无法进入活细胞内染色。具体操作方法是：吸取 100 μL 重悬的细胞到离心管内，加入 100 μL 台盼蓝染色液 (2×)，混合均匀，染色 3 min。再吸取 10 μL 经过染色后的细胞悬液，用细胞计数板计数蓝色细胞数和细胞总数，如式（1）所示计算细胞存活率。

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24 h 贴壁率的测定方法是：将细胞培养瓶放入 CO₂ 培养箱培养 24 h 后，用离心管收集上清液，并用 2 mL 的 D-hanks 液清洗细胞两次，清洗液也收集至离心管中，离心，弃上清，加 1 mL DMEM 培养基重悬细胞，此时未贴壁细胞位于 DMEM 培养基重悬液中，等待计数。而贴壁细胞仍在细胞培养瓶中呈贴壁状态，将其用胰酶消化后，移入离心管中，离心，去上清，将细胞沉淀重悬至 1 mL，等待计数。接下来，用细胞计数板分别数出贴壁细胞数及未贴壁细胞数。同时观察细胞的生长情况和形态变化，如式（2）所示计算细胞 24 h 贴壁率。

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1.4. 不同接收方式对微滴喷射玻璃化的影响

本文采用微滴喷射玻璃化系统对 3 mL HepG2 细胞悬液进行喷射实验，以 5% DMSO + 0.3 mol/L 海藻糖作为低温保护剂，分别采用薄片接收和容器式收集装置接收的方式实现微滴喷射玻璃化保存细胞。

实验分为 3 组，分别是：① 对照组，HepG2 细胞仅用 DMEM 培养基培养，其余不做任何操作，检测细胞存活率及 24 h 贴壁率。② 薄片接收组，喷射实验产生的微滴用直径 9 cm 的聚乙烯薄片正反面接收，薄片单面接收时间为 5 s。然后将薄片迅速浸入液氮玻璃化。37 ℃ DMEM 培养基中复温，并用 DMEM 培养基将薄片上的细胞洗脱下来，离心管收集洗脱液。离心弃上清，重悬细胞，检测细胞存活率及 24 h 贴壁率。③ 容器式收集装置接收组，喷射实验产生的微滴直接喷入容器式收集装置，实现玻璃化，且细胞均落在筛网上。喷射完毕，取出筛网，将其浸入 37 ℃ 培养基中复温，并用 DMEM 培养基洗脱细胞，离心管收集细胞悬液。离心弃上清，重悬细胞，检测细胞存活率及 24 h 贴壁率。

1.5. 细胞密度对微滴喷射玻璃化的影响

将新鲜的 HepG2 细胞悬液的密度调整为 2.0×10⁶ 个/mL，然后依次稀释为 1.0×10⁶个/mL、0.5 × 10⁶ 个/mL。以 5% DMSO + 0.3 mol/L 海藻糖作为低温保护剂，采用微滴喷射玻璃化系统对不同密度的 HepG2 细胞悬液进行喷射。喷射完毕，取出筛网，将其浸入 37 ℃ 培养基中复温，并用 DMEM 培养基洗脱细胞，离心管收集细胞悬液，离心弃上清，重悬细胞，检测细胞存活率及 24 h 贴壁率。

1.6. 微滴喷射高通量玻璃化与慢速冷冻法保存效果比较

采用接收方式为容器式收集装置的微滴喷射玻璃化系统对 30 mL HepG2 细胞悬液进行玻璃化保存，并与常规慢速冷冻法的保存效果进行比较，比较内容包括冻存细胞量、细胞回收率、细胞存活率及 24 h 贴壁率。具体操作如下：

（1）慢速冷冻法：取含 10% DMSO 低温保护剂的细胞悬液 1 mL 放入冻存管中，冻存前测细胞密度。在− 80 ℃ 低温冰箱中冻存一周后，37 ℃ 水浴快速复温。离心去上清，再加入 DMEM 培养基重悬细胞至 1 mL，检测复温后的细胞密度，然后如式（3）所示计算细胞回收率。

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（2）微滴喷射玻璃化：取含 5% DMSO + 0.3 mol/L 海藻糖作为低温保护剂的细胞悬液 30 mL，喷射前测定细胞密度。放置 5 min，进行喷射实验，并用盛满液氮的容器式收集装置接收微滴，实现细胞的玻璃化。待 30 mL 悬浮液喷射完后，将筛网从液氮容器中取出，放入盛有约 350 mL 37℃ 培养基的烧杯中复温。离心管收集筛网中的细胞悬液，离心去上清。用 DMEM 培养基重悬细胞，测定重悬的细胞密度。如式（4）所示计算玻璃化保存的细胞回收率。

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1.7. 数据分析

采用统计产品与服务解决方案软件 SPSS Statistics 19.0 进行统计学分析，实验数据用平均值 ± 标准差的形式表示，两组间比较采用 t 检验，P < 0.05 为差异具有统计学意义。每组实验需重复 3 次以上。

2. 结果与讨论

2.1. 不同接收方式对微滴喷射玻璃化的影响结果

采用薄片式接收与容器式收集装置接收喷射实验产生的微滴，经玻璃化保存后的细胞存活率及 24 h 贴壁率的结果如表1 所示，采用容器式收集装置接收微滴时，细胞的存活率和 24 h 贴壁率均高于薄片式接收组，提示该种接收方式下细胞活性明显高于薄片式接收组，组间差异具有统计学意义。由此可见，采用容器式收集装置接收微滴时，玻璃化保存的细胞活性更高，保存效果更理想。分析原因可总结如下：一方面，采用容器式收集装置接收微滴，微滴与液氮直接接触，传热系数增加，降温速率明显提升，有助于实现玻璃化；另一方面，微滴直接喷入液氮玻璃化，相对于薄片式接收，避免了薄片对细胞造成的冲击力损伤。

表 1. Effect of collection methods on microdroplet spray vitrification.

不同接收方式对微滴喷射玻璃化的影响

组别	存活率	24 h贴壁率
*P<0.05，与对照组相比，差异具有统计学意义；#P<0.05，与薄片式接收组相比，差异具有统计学意义。
对照组	98.40% ± 0.10%	99.16% ± 0.38%
薄片式接收组	91.20% ± 1.47%*	93.84% ± 1.01%*
容器式收集组	93.38% ± 0.32%*#	95.55% ± 1.13%*#

2.2. 细胞密度对微滴喷射玻璃化的影响结果

喷射细胞密度依次为 0.5 × 10⁶、1.0 × 10⁶、2.0 × 10⁶ 个/mL 的细胞悬液，经玻璃化保存后的细胞存活率及 24 h 贴壁率如表2 所示。由表2 可知，当悬浮液注射系统中细胞密度成倍增加时，细胞的存活率及 24 h 贴壁率并没有明显变化，结果显示组间差异不具有统计学意义。说明当细胞密度在 0.5 × 10⁶～2 × 10⁶ 个/mL 范围内变化，微滴喷射玻璃化保存效果不随细胞密度的改变而改变。且细胞活性均达到 92% 上，玻璃化保存效果良好。因此，可以通过适量增加细胞密度来提高玻璃化保存细胞的数量，这将有助于解决小体积细胞高通量保存问题。

表 2. Effect of cell density on microdroplet spray vitrification.

细胞密度对微滴喷射玻璃化的影响

细胞密度/（个·mL−1）	存活率	24 h贴壁率
0.5 × 106	93.07% ± 2.79%	93.79% ± 1.23%
1.0 × 106	93.84% ± 1.81%	95.53% ± 1.32%
2.0 × 106	92.90% ± 0.69%	94.29% ± 0.43%

2.3. 微滴喷射高通量玻璃化与慢速冷冻法保存效果比较结果

采用微滴喷射容器式收集装置玻璃化保存方法，并与慢速冷冻法保存结果进行比较，结果如表3 所示。对细胞处理量进行分析，发现慢速冷冻法单次能够保存处理的悬浮液体积为 1 mL，传统的薄片式接收微滴喷射玻璃化保存系统单次能够处理的悬浮液体积可达 30 mL，而本文提出的容器式收集微滴喷射玻璃化保存系统的单次处理量远不止 30 mL，能够继续加大到 200 mL，达到临床实用的体积量，说明该系统具有高通量的特点。同时，采用容器式收集装置接收微滴时，细胞回收率达 89.70% ± 1.36%，尽管相对于慢速冷冻的回收率 98.15% ± 0.53%还有一定差距，但相对于 Rami 等^[14]提出的薄片式接收方式，容器式收集装置不易造成细胞丢失，细胞回收率较高。此外，对细胞活性进行分析发现，相较于慢速冷冻法，采用容器式收集装置玻璃化保存细胞时细胞存活率和 24 h 贴壁率均明显较高，说明容器式收集装置玻璃化保存效果更好。且复温后，无需去除低温保护剂的步骤，程序简单。

表 3. Comparison of high-throughput vitrification by micro-droplet spray and slow freezing.

微滴喷射高通量玻璃化与慢速冷冻法的比较

保存方法	悬浮液体积/mL	回收率	存活率	24 h贴壁率
P<0.05，玻璃化组与慢速冷冻法相比，差异具有统计学意义。
慢速冷冻法	1	98.15% ± 0.53%	89.40% ± 1.29%	92.22% ± 0.75%
微滴喷射玻璃化法	30	89.70% ± 1.36%*	93.16% ± 0.15%*	94.98% ± 1.13%*

3. 讨论与展望

本文提出的微滴喷射玻璃化装置能有效实现细胞玻璃化保存。相对于薄片式接收，容器式收集装置有以下几点优势：① 薄片式接收每次仅能接收 80 μL 细胞悬浮液，保存量非常有限，容器式收集装置单次能够处理的细胞量大，能够达到临床实用量。② 薄片式接收是平面收集，长时间接收会造成细胞的堆积或丢失问题，容器式收集装置是立体容器式，细胞悬液喷进液氮中悬浮，细胞不会产生堆积且接收完全、无丢失。③ 薄片式接收是先在薄片上接收然后投入液氮中冷冻，增加了细胞与接收材料的接触损伤，并且由于接收材料的热传递系数低，降低了细胞的玻璃化程度。容器式收集是将细胞悬液喷进液氮中，没有接触损伤且以超高的冷却速率实现了细胞的玻璃化保存。

高数目尼龙网在玻璃化冷冻保存技术中已有应用。例如 Nakashima 等^[18]就曾用目数 300 目，孔径约为 48 μm 的尼龙网进行人类胚胎的玻璃化保存；后又有 Yamanaka 等^[19]将目数 270 目，孔径约 57 μm 的尼龙网作为玻璃化载体，冷冻保存直径为 101～150 μm 的大鼠胰岛细胞。人类胚胎和大鼠胰岛细胞都属于体积较大的单个样本保存，使用单层平面尼龙网就可以实现。红细胞、血小板、干细胞和本文中所用的 HepG2 细胞体积很小且需要大体量保存。若采用单层 300 目或是 270 目尼龙网保存小体积细胞，极易造成细胞丢失现象，因此，本文采用 2 层 500 目尼龙网叠加使用，同时将尼龙网制成立体容器式结构，提高了细胞的处理量。

相对于慢速冷冻法，本文提出的微滴喷射玻璃化保存系统所得细胞活性更高，且具有高通量的特点，有望解决小体积细胞的大体量保存问题。为了使该技术在大体量细胞冻存中更有效、便捷，还可以在以下几个方面开展研究：① 是保护剂加载方式的优化，可采用微流控法加载低温保护剂替代目前的一步法，减小玻璃化溶液对细胞造成的渗透损伤和毒性损伤；② 是采用仿生型低温保护剂，降低 DMSO 的浓度或者代替 DMSO；③ 是采用封闭式的收集装置，便于玻璃化冻存细胞的长期保存。

利益冲突声明：本文全体作者均声明不存在利益冲突。

Funding Statement

国家自然科学基金（51376132）[National Natural Science Foundation of China]