靶向捕获内皮祖细胞磁性纳米粒子的生物学修饰及其细胞相容性评价

Abstract

Immobilization of CD34 antibody on ferroferric oxide magnetic nanoparticles was achieved by the traditional carboxyl-amine conjugation reaction. Fourier transform infrared spectroscopy (FT-IR), nanoparticle size analysis (dynamic light scattering and transmission electron microscope), and other testing methods were used to detect the surface modified magnetic nanoparticles. The endothelial progenitor cells (EPCs) were cultured with the surface modified magnetic nanoparticles to evaluate cell compatibility and the combination effect of nanoparticles on EPCs in a short period of time. Directional guide of the surface modified magnetic nanoparticles to EPCs was evaluated under applied magnetic field and simulated dynamic flow condition. The results showed that the magnetic nanoparticles were successfully modified with CD34 antibody, which had good cell compatibility within a certain range of the nanoparticle concentrations. The surface modified nanoparticles can combine with EPCs effectively in a short time, and those nanoparticles combined EPCs can be directional guided under the magnetic field in the dynamic flow environment.

引言

磁性纳米粒子（magnetic nanoparticles，MNPs）在生物学领域因其独特的磁响应性、良好的生物相容性、体内可降解性等，引起了研究者们的广泛关注，具有广阔的应用前景^[1]。近年来，以磁性纳米粒子为载体的特异性靶向已被广泛运用到心血管疾病的治疗和内皮损伤重建上^[2-5]。研究表明，通过在纳米粒子表面固定识别分子，可以实现对细胞的特异性捕获。Landázuri 等^[6]将聚乙二醇（polyethylene glycol，PEG）修饰的超顺磁性纳米颗粒（superparamagnetism nanoparticles，SPIONs）有效负载在人源间充质干细胞（human mesenchymal stem cells，hMSCs）上，发现对加载了 SPIONs 的 hMSCs 应用适当的磁场梯度，将有可能在特定的血管网络组织中定位 hMSCs。Vosen 等^[7]可以在外加磁场作用下将纳米粒子磁化后的细胞靶向到小鼠颈动脉受损部位从而促进受损部位内皮重组。

在本研究中，通过共价接枝的方法将 CD34 抗体接枝到 PEG 修饰的 Fe₃O₄ 磁性纳米粒子上，构建一种可以特异性靶向内皮祖细胞（endothelial progenitor cells，EPCs）的功能型纳米粒子，并对其稳定性及细胞相容性进行了评价，为后期开展更为深入的应用研究进行初步探索。

1. 实验部分

1.1. 实验试剂

1-乙基-（3-二甲基氨基丙基）碳酰二亚胺盐酸盐（EDC）、N-羟基琥珀酰亚胺（NHS）、结晶紫/PB 染色剂、CCK-8 指示剂购自美国 Sigma 公司；末端双羧基 PEG 修饰的四氧化三铁磁性纳米粒子（Fe₃O₄-PEG）购自北京万德高科技发展有限公司；Rat CD34 抗体购自美国 Gene Tax 公司；α-MEM 培养基购自美国 Hyclone 公司；胎牛血清购自美国 Gibco 公司。

傅里叶红外光谱仪购自美国 Thermo Fisher Scientific 公司，动态激光散射仪购自英国马尔文公司，电子显微镜购自日本 Jeol 公司，酶标仪购自美国 Bio-tek instrument 公司，光学显微镜购自荷兰 OLYMPUS 公司，PD-10 交换柱购自美国 GE 公司。

1.2. 纳米粒子制备

利用羧基和氨基官能团的缩合反应实现生物分子 CD34 抗体与双羧基 PEG 修饰 Fe₃O₄-PEG 纳米粒子的结合。具体操作步骤如下：首先将 2 mg Fe₃O₄-PEG 纳米粒子分散到 PBS 溶液（pH = 7.4）中，再依次加入 1.25 mg 的 EDC 和 NHS。室温下反应 1 h 后，采用 PD-10 交换柱对活化后的 Fe₃O₄-PEG 进行清洗。然后无菌条件下加入 15 μg CD34 抗体，在 37℃ 摇床上以 80 r·min^–1的速度反应 4 h 后进行磁倾析。用 PBS 溶液清洗 3 遍后，重新分散到 PBS 中，即得到 CD34 抗体修饰的磁性纳米粒子（Fe₃O₄-PEG@CD34）。

1.3. 材料学表征

1.3.1. 傅里叶变换红外光谱学（Fourier transform infrared spectroscopy，FT-IR）

采用傅立叶变换红外光谱仪检测 CD34 抗体接枝前后纳米粒子的化学基团变化，测量范围设定为 4 000～400 cm^–1。

1.3.2. 动态光散射（dynamic light scattering，DLS）

采用动态激光散射仪分析 Fe₃O₄-PEG 和 Fe₃O₄-PEG@CD34 两种样品的粒径分布及电位变化。

1.3.3. 透射电子显微镜（transmission electron microscope，TEM）

用透射电子显微镜观察 Fe₃O₄-PEG 和 Fe₃O₄-PEG@CD34 的尺寸和形貌变化。

1.4. 细胞学评价

1.4.1. Fe₃O₄-PEG@CD34 对 EPCs 增殖能力影响

用 CCK-8 评价 CD34 抗体修饰后的纳米粒子对 EPCs 增殖活性的影响。将 EPCs 与不同浓度 Fe₃O₄-PEG@CD34（0、50、100、150、200 μg·mL^–1）共混培养 1 d 和 3 d。在测试时间点前 4 h 将培养基吸出，每孔加入含有 10% CCK-8 的 α-MEM 培养基 500 μL，置于 37℃、5% CO₂ 细胞培养箱中孵育 4 h。吸取 CCK-8 工作液于 96 孔板中，在波长 450 nm 处读取吸光度值。

1.4.2. Fe₃O₄-PEG、Fe₃O₄-PEG@CD34 与 EPCs 的静态结合

用 α-MEM 培养基分别将 Fe₃O₄-PEG、Fe₃O₄-PEG@CD34 稀释至 100 μg·mL^–1后加入 1 mL 至 12 孔板内，与培养了 24 h 的 EPCs 在 37℃、5% CO₂ 细胞培养箱中共同孵育 3 min，对照组只加入新鲜细胞培养基。弃去悬液，用生理盐水反复清洗 5 次，10% 多聚甲醛溶液固定 20 min 后，加入普鲁士蓝与结晶紫染色剂分别对磁性纳米粒子和细胞进行染色，用光学显微镜观察。

1.4.3. 外加磁场下磁性纳米粒子对 EPCs 的定向引导

为了评价 Fe₃O₄-PEG@CD34 在磁场辅助下能否快速靶向 EPCs 并且聚集到磁场施加位置，分别评价了动态短期施加磁场（3 min）和长期施加磁场（6 h）下，Fe₃O₄-PEG 和 Fe₃O₄-PEG@CD34 对 EPCs 的捕获情况。具体操作如下：在 80 r·min^–1动态情况下，将 Fe₃O₄-PEG 和 Fe₃O₄-PEG@CD34（100 μg·mL^–1）分别与细胞密度为 5×10⁴个/cm²的 EPCs 悬液共混后加入 1 mL 至 12 孔板内，在孔板底部施加磁场，磁场强度为 250 mT，一组在培养板底部动态连续施加磁场 3 min 后，弃上清，重新加入培养基后在 37℃、5% CO₂ 细胞培养箱里培养 6 h，另一组连续施加磁场培养 6 h。对照组只加入 EPCs 悬液，其余操作同上。生理盐水清洗多次后，10% 多聚甲醛溶液固定 20 min，再用普鲁士蓝与结晶紫染色，观察培养板上的细胞情况。采用 SPSS 软件进行方差分析，检验水准 α = 0.05。

2. 结果及分析

2.1. FT-IR

由图 1 可见，PEG 修饰的 Fe₃O₄ 磁性纳米粒子在 599 cm^–1处出现了纳米粒子 Fe₃O₄ 的 Fe-O 特征伸缩振动峰，2 877 cm^–1和 1 150～1 060 cm^–1处出现 PEG 的-CH₂-CH₂ 伸缩振动峰和较强的-C-O 的伸缩振动峰。经 CD34 抗体修饰后的纳米粒子分别在 1 542 cm^–1和 1 400 cm^–1处出现酰胺Ⅱ带和酰胺Ⅲ带吸收峰。酰胺峰位的出现表明 CD34 抗体成功修饰到原磁性纳米粒子上。另外，Fe₃O₄-PEG 中在 1 000～750 cm^–1处出现的明显透过峰可能是羧基上的氢氧变形振动峰，当 PEG 上的羧基与 CD34 抗体上的氨基发生脱水缩合后，氢氧变形振动峰就消失了，所以这两个峰在 Fe₃O₄-PEG@CD34 并未出现。

图 1.

FT-IR spectra of Fe₃O₄-PEG (a) and Fe₃O₄-PEG@CD34 (b) magnetic nanoparticles

Fe₃O₄-PEG（a）和 Fe₃O₄-PEG@CD34（b）纳米粒子的 红外光谱图

2.2. 纳米粒子表征

通过 DLS 来测量 CD34 抗体修饰前后纳米粒子的粒径分布情况。由图 2 可知，Fe₃O₄-PEG 在 PBS 溶液中粒径主要分布在 30～100 nm，平均粒径约 47 nm。Fe₃O₄-PEG@CD34 的粒径主要分布在 100～200 nm，平均粒径为 123 nm。30 d 后二者的平均粒径分别变为 54 nm 和 210 nm。这可能是由于 CD34 抗体上的氨基很多，可能同时接在很多个纳米粒子上，所以修饰后的纳米粒子平均粒径更大，粒径分布范围更广。一般情况下，体内使用的纳米粒子粒径在 5～200 nm 之间，这样既能避免纳米粒子因粒径过小而被肾脏清除，又能避免因其粒径过大被脾脏过滤^[8-9]。所以，本文所制备的纳米粒子能用于体内。根据 TEM 显示，Fe₃O₄-PEG 形貌规则，多为球形分布，粒径为（12.1 ± 1.4）nm；而 CD34 修饰后的纳米粒子形貌变得较不规则，粒径增大到（14.2 ± 1.5）nm。这可能是由于 CD34 抗体表面的氨基官能团与 Fe₃O₄-PEG 纳米粒子上的羧基官能团发生脱水缩合，使多个纳米粒子交联所致，也从侧面反映了生物分子与纳米粒子的结合。Fe₃O₄-PEG 纳米粒子的 Zeta 电位为（–9.03 ± 0.57）mV，Fe₃O₄-PEG@CD34 的 Zeta 电位为（–13.67 ± 0.29）mV。水合粒径和 Zeta 电位的变化可以间接表明 CD34 抗体成功修饰到 PEG 包裹的四氧化三铁纳米粒子上。

图 2.

DLS and TEM of Fe₃O₄-PEG and Fe₃O₄-PEG@CD34 magnetic nanoparticles

Fe₃O₄-PEG 和 Fe₃O₄-PEG@CD34 纳米粒子的水合粒径和透射电镜分布图

2.3. 细胞增殖活性

由图 3 可知 EPCs 的活性随着培养时间的延长而增强。共同培养 1 d，不同浓度 Fe₃O₄-PEG@CD34 之间的细胞活性存在一定的差异，100 μg·mL^–1 浓度组具有相对较高的细胞活性。第 3 天细胞活性与第 1 天结果趋势相同，但整体细胞活性相比第 1 天呈现显著的增强，100 μg·mL^–1 浓度组的细胞活性最高。

图 3.

The CCK-8 results of EPCs incubated with different concentrations of the magnetic nanoparticles (*P < 0.05, ** P < 0.01)

不同浓度 Fe₃O₄-PEG@CD34 纳米粒子与 EPCs 共同培 养的 CCK-8 结果（*P < 0.05，** P < 0.01）

由 CCK-8 结果可知随 Fe₃O₄-PEG@CD34 浓度的增加，细胞活性先呈现上升的趋势，在浓度为 100 μg·mL^–1时细胞的活性最强，随后随着 MNPs 的浓度增加，细胞活性呈现下降的趋势。这可能是由于 CD34 抗体的引入可加强 Fe₃O₄-PEG@CD34 与细胞间的特异性结合作用，因而 Fe₃O₄-PEG@CD34 能改善细胞相容性，进而促进细胞的增殖；但随着 Fe₃O₄-PEG@CD34 浓度的逐步增加，纳米粒子的尺寸效应对细胞生长的抑制作用也逐渐凸显，因而细胞活性有所下降。

2.4. 磁性纳米粒子与 EPCs 的静态结合

将 Fe₃O₄-PEG 和 Fe₃O₄-PEG@CD34（100 μg·mL^–1）分别与 EPCs 短时间孵育 3 min，并通过普鲁士蓝染液检测铁离子的存在。结果如图 4 所示，Fe₃O₄-PEG@CD34 组 EPCs 中出现蓝染，而 Fe₃O₄-PEG 组则没有，说明在短时间内 Fe₃O₄-PEG@CD34 能够特异性结合 EPCs。

图 4.

Prussian blue and crystal violet stained microphotographs of EPCs incubated with magnetic nanoparticles (bar = 50 μm)

普鲁士蓝与结晶紫对磁性纳米粒子与 EPCs 结合后染色光镜结果（bar = 50 μm）

2.5. 外加磁场下磁性纳米粒子对 EPCs 的定向引导

由图 5、6 可知，施加 3 min 短期磁场后，对照组和 Fe₃O₄-PEG 组只有少量细胞，而 Fe₃O₄-PEG@CD34 组细胞数量显著增加。由此可见，Fe₃O₄-PEG@CD34 具有短期内识别 EPCs 并将其快速运输到磁场施加部位的能力。在动态施加磁场 6 h 后，对照组和 Fe₃O₄-PEG 均有一定量的细胞黏附，且 Fe₃O₄-PEG 组多于对照组，这可能是已经有部分 Fe₃O₄-PEG 纳米粒子进入细胞内，将其运送到磁场施加部位。但 Fe₃O₄-PEG@CD34 组 EPCs 数量显著高于其他两组，说明长时间磁场作用下，Fe₃O₄-PEG@CD34 对 EPCs 具有良好的识别捕获能力。

图 5.

The EPCs capture results in different times by Fe₃O₄-PEG and Fe₃O₄-PEG@CD34 magnetic nanoparticles in dynamic magnetic field

动态磁场作用下，Fe₃O₄-PEG 和 Fe₃O₄-PEG@CD34 在不同时间内对 EPCs 的捕获结果

图 6.

The number of captured EPCs in different times by Fe₃O₄-PEG and Fe₃O₄-PEG@CD34 magnetic nanoparticles in dynamic magnetic field (**P < 0.01, *** P < 0.001)

动态磁场作用下，Fe₃O₄-PEG 和 Fe₃O₄-PEG@CD34 在 不同时间内对 EPCs 的捕获计数（**P < 0.01，*** P < 0.001）

3. 总结

本文在 PEG 修饰的四氧化三铁磁性纳米粒子表面使用 CD34 抗体对其进行进一步的生物分子修饰，成功制备出了具有 CD34 抗体修饰的磁性纳米粒子。红外结果显示 CD34 抗体成功修饰到 Fe₃O₄-PEG 纳米粒子上。CD34 抗体修饰后的纳米粒子水合粒径为 100～200 nm，透射电镜粒径为（14.2 ± 1.5）nm，可满足后期体内实验需求。

Fe₃O₄-PEG@CD34 纳米粒子与 EPCs 共同培养中展现出了很好的细胞相容性，在浓度为 100 μg·mL^–1时细胞的活性最强。静态 Fe₃O₄-PEG@CD34 纳米粒子与 EPCs 结合的实验结果表明随着 CD34 抗体的引入，提高了磁性纳米粒子对 EPCs 识别结合的能力。进一步地，在外加磁场和动态环境下，可实现 Fe₃O₄-PEG@CD34 纳米粒子对 EPCs 的快速捕获和定向引导。这为生物功能化的磁性纳米粒子在生物医学材料领域的应用奠定了基础。

Funding Statement

国家自然科学基金（81271701，31300792）