基于细胞的指数富集配体系统进化技术的肺癌细胞核酸适配体的筛选及其在肿瘤诊治中的应用

Abstract

Nucleic acid aptamer is an oligonucleotide sequence screened by the exponential enrichment ligand system evolution technology (SELEX). Previous studies have shown that nucleic acid aptamer has a good application prospect in tumor diagnosis and treatment. Therefore, we reviewed the selection and identification of nucleic acid aptamer of lung cancer cells in recent years, and discussed the effect of aptamer as targeting drugs and targeting vectors on the diagnosis of tumors, which provide a new idea for early diagnosis and treatment of tumor.

引言

恶性肿瘤是危害人类健康的重大疾病之一，其中肺癌的发生率居恶性肿瘤之首，是我国死亡率最高的恶性肿瘤，并且其发生率和死亡率仍在逐年增长^[1]。尽管通过城市早筛早治项目、手术、放疗、化疗及分子靶向治疗等技术对肺癌的控制与治疗现已取得一定的成果，但是大多数患者（≥ 70%）确诊时已经是中、晚期，失去了最佳治疗机会。目前临床上常用的肿瘤疾病的诊疗手段主要有肿瘤细胞的形态学检查、彩超、电子计算机断层扫描（computed tomography，CT）或是磁共振成像（magnetic resonance imaging，MRI）。但这些检查手段尚无法实现肿瘤疾病的早期诊断，即在机体开始发生肿瘤病变时不能有效地进行检测。随着科学技术的发展，适配体筛选检测进入人们的视野，指数富集配体系统进化技术（systematic evolution of ligands by exponentail enrichment，SELEX）是一项新的体外筛选方法，其是 90 年代初由美国两个研究组最早提出的一项筛选和扩增技术。它应用大容量的随机寡核苷酸库，并结合聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，PCR）体外扩增技术，经过几轮或数十轮的筛选，可获得高亲和力、高特异性的核酸配体（aptamer）。该技术对靶物质无特殊要求，现已筛选出多种靶物质的适配子，包括金属离子、有机染料、药物、氨基酸、核苷酸、多肽等。此外，适配子的靶蛋白还有：酶、生长因子、抗体、基因调控因子、细胞黏附因子以及外源凝集素等^[2-3]。因其具有靶分子范围广、亲和力高、特异性强等特点，筛选到的适配子能够特异地与疾病发生发展中起重要作用的靶分子结合，阻断或封闭靶分子的功能，从而达到治疗疾病的目的。基于此，核酸适配体作为一种新型的分子探针在药物筛选、疾病诊断、临床治疗等方面显示出广阔的应用前景，对肿瘤的诊断和治疗具有重要意义。

本文对基于细胞的指数级富集配体系统进化技术（systematic evolution of ligands for cell exponential enrichment technology，Cell-SELEX）的肺癌细胞核酸适配体的筛选及其适配体在肿瘤诊断治疗中的应用进行初步探讨，以期为肿瘤的早期诊断及早期治疗提供新思路。

1. 核酸适配体

核酸适配体是一小段单链脱氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）或核糖核酸（ribonucleic acid，RNA）分子，通常是经过 SELEX 技术体外筛选得到。1990 年，Tuerk 等^[4]和 Ellington 等^[5]首次应用 SELEX 技术成功筛选出第一个 RNA 适配体。此后，核酸适配体一直在不断发展，已成为新一代的分子识别元件。单链寡核苷酸因序列不同，可形成构象不同且热力学上稳定的二级和三级结构，如发卡、口袋、假结、G 四聚体等。由于随机序列的存在，文库中的单链寡核苷酸因序列各异而形成多样且独特的空间构象，适配体能够通过碱基配对、范德华力、氢键和静电等作用力和靶标结合，主要是通过特异性茎环识别靶标，实现与靶分子高特异性、高亲和力的结合。另外，低分子量的适配体容易合成与修饰，可以识别天然状态下细胞表面的靶向蛋白质，正是这些特点使核酸适配体在肿瘤的早期诊断、靶向治疗中具有重要的作用^[6]。

2. Cell-SELEX 技术

2.1. Cell-SELEX 技术概述

虽然 SELEX 技术已经筛选到许多高特异性的适配体，但实际应用到生物体内之后，在生理条件下可能发生翻译后修饰或三维构象的改变，使得利用体外 SELEX 技术筛选得到的适配体无法识别该靶标在细胞膜表面的天然构象。与传统 SELEX 技术不同的是，Cell-SELEX 的靶标是完整的活细胞，可以筛选出细胞表面分子的适配体，该技术最大的优点是在筛选过程中能够同时以多种呈天然构象的膜蛋白为靶标分子，并且不需要预先了解细胞表面蛋白的种类及其表达水平。Cell-SELEX 技术筛选的靶标主要是癌细胞，还有正常细胞和炎症细胞等，涉及到的器官和组织有脑、肺、肝、胰腺、乳腺和卵巢等^[7]。2006 年，Shangguan 等^[8]首次建立了 Cell-SELEX 筛选模型。该课题组以急性淋巴细胞白血病细胞系（CCRF-CEM）为靶细胞，以来自人 Burkitt 淋巴瘤的 AB 细胞系 Ramos 为对照细胞，筛选出了 10 条与靶细胞 CCRF-CEM 特异性结合的核酸适配体。利用 Cell-SELEX 技术能够筛选出特异识别一类癌细胞而不与正常细胞或其他癌细胞结合的核酸适配体，而且筛选过程是在具有多种蛋白质受体的活细胞上进行的，所以可以得到一系列适配体探针。这些探针在肿瘤的基础研究与分子成像^[9]、靶向药物传送^[10]和临床早期诊断^[11]中具有重要的作用。

2.2. 筛选方法

细胞是由多种生物大分子和小分子组成的生命体，代谢过程复杂，其细胞膜组成成分也很复杂，包括蛋白质、糖链和脂类等多种物质，因此以细胞为靶标进行筛选时，有一定的难度。本文简述其筛选过程主要包括以下 5 个步骤，即：① 初始文库与靶细胞的结合（正向筛选）、② 洗去未与靶细胞结合的序列、③ 结合序列与反筛细胞的结合（反向筛选）、④ 洗去与反筛细胞结合的序列，并保留未结合的序列、⑤ 构建次级文库用于下一轮筛选^[12]。重复上述步骤进行 10～20 轮的筛选^[13-14]，就可以获得与靶细胞特异性结合的核酸适配体。为了提高适配体的特异性，在第三轮时，加入反向筛选，即与靶细胞结合后的文库与反筛细胞结合，其目的是减少背景，提高核酸适配体的特异性。所选择的反筛细胞与靶细胞相关，培养条件与靶细胞相同。具体筛选过程如图 1 所示。

图 1.

The screening process of Cell-SELEX

Cell-SELEX 技术筛选流程

3. 肺癌细胞核酸适配体的筛选

肺癌死亡率高，对人们的健康造成严重的危害^[15]。对各种癌细胞的核酸适配体的筛选有很多，目前已经筛选出了几种肺癌细胞核酸适配体，如表 1 所示。Chen 等^[16]利用 Cell-SELEX 技术筛选出了能够特异性结合人小细胞肺癌细胞（NCI-H69）的核酸适配体，但很少结合其他肺癌亚型或其他类型的癌症（例如：白血病或肝癌）。Kunii 等^[17]为了检测小细胞肺癌细胞表面潜在的生物标志物胃泌素释放肽前体（pro-gastrin-releasing peptide，pro-GRP），筛选出了能够与小细胞肺癌细胞（SBC3）高特异性结合的核酸适配体，这种适配体与对照细胞以及其他肺癌细胞的结合力不高，说明该适配体的特异性很强。而另一项研究中，Zhao 等^[18]筛选出了能够特异性结合肺腺癌细胞（A549）的核酸适配体。

表 1. Aptamers of Lung cancer cell screened.

筛选出的肺癌细胞核酸适配体

肺癌种类	靶细胞	对照细胞	适配体	参考文献
小细胞肺癌	NCI-H69	NCI-H661	HCA12，HCCO3	[16]
	SBC3	RERF-LC-MA	16-1	[17]
	A549	HLAMP	S1，S11e，S15	[18]
非小细胞肺癌	术后分离组织细胞	普通肺癌细胞和淋巴细胞	LC-17 LC-18 LC-110 LC-183 LC-224	[19]
	Anip973	AGZY83-a	W1-5	[23]

另外，在复杂的生物环境中（如：人类血液）适配体也具有很强的结合力。以循环肿瘤细胞（circulating tumor cell，CTCs）为例，其包含了完整的遗传信息，与此相关的研究发展迅猛。如：Zamay 等^[19]经过 11 轮筛选之后，获得了与肺腺癌细胞特异性结合的核酸适配体。采用流式细胞术鉴定后发现，该适配体具有较高的特异性，不与正常细胞和淋巴细胞结合，此类特异性的适配体探针能够检测到血液中的 CTCs，这不仅可以用于肺癌的无创化诊断，也对评估肺癌治疗效率有一定的帮助^[20]，为实现肺癌的精准化治疗奠定了基础。

量子点（quantum dot，QDs）由于其独特的强荧光性和光稳定性，广泛应用于生物检测领域^[21]。Wu 等^[22]研发了一种 QDs—适配体复合系统用于检测 A549 细胞，该方法既便捷、灵敏度又高，同时还避免了 QDs 的空间位阻对适体构象的影响，提高了适配体的特异性。具体操作为：首先利用链霉亲和素和生物素分别标记 A549 细胞的核酸适配体 S11e 与 QDs，然后将 QDs—S11e 复合系统同时与 A549 细胞和人舌癌细胞（Tca）孵育。结果显示，A549 细胞中检测到很强的荧光，而 Tca 细胞中没有检测到荧光，这为癌细胞的体外诊断提供了一种新方法。目前，关于肺癌细胞核酸适配体筛选的研究还有很多，相信未来可以在肺癌的早期诊断治疗中发挥重要作用。

4. 适配体的表征

基于 Cell-SELEX 技术的核酸适配体在生物医药、临床疾病的诊断和治疗方面具有潜在的应用价值，因此研究靶细胞与适配体之间的相互作用关系对生物医学的发展具有至关重要的作用。尽管核酸适配体可以折叠成三维结构，并通过氢键、疏水作用、范德华力与靶细胞结合，但是其具体的结合行为还不是很明确，尤其适配体与细胞分子水平之间的结合关系尚不明朗^[24]。目前主流技术是通过流式细胞术、荧光共聚焦显微镜、单分子力普技术（single-molecule force spectroscopy，SMFS）等检测细胞与适配体之间的结合情况。

4.1. 流式细胞术

流式细胞术可以监测筛选过程中文库的富集程度以及检测适配体与靶细胞的结合程度，其优势是能够计算出适配体与靶细胞结合的平衡解离常数。将不同浓度梯度的带异硫氰酸荧光素（fluorescein isothiocyanate，FITC）标记的核酸适配体分别与靶细胞孵育，测定适配体与靶细胞结合的荧光强度，以判断结合效果。荧光强度越强，适配体与靶细胞的亲和力越高，反之越小^[25]。使用科学图表绘制软件 SigmaPlot 12.0（Sigma，中国），通过方程 Y = B_max·X/（K_d + X）计算出平衡解离常数 K_d^[26]（Y：荧光强度；X：不同浓度的核酸适配体的具体浓度；B_max：所测得的最大荧光强度；K_d：平衡解离常数）

4.2. 荧光共聚焦显微镜

将 FITC 标记的核酸适配体分别与靶细胞和对照细胞孵育，检测被 FITC 标记的细胞数量。如果荧光标记的靶细胞数量明显多于对照细胞的数量，就可证明筛选出了能够与靶细胞特异性结合的的核酸适配体^[27]。

4.3. SMFS 技术

SMFS 技术能够检测靶细胞与适配体的结合位点，更重要的是可以清楚地显示分子之间的相互作用^[28]。基于 SMFS 技术的原子力显微镜是一种探究分子内或分子间相互作用的强有力的工具，利用好这项技术对适配体探针的设计具有很大的意义。

5. 核酸适配体在肿瘤早期诊断治疗中的应用

核酸适配体是高度结构化的单链寡核苷酸，其特异性和亲和力在复杂的生物环境中仍然具有很强的作用，因此将其作为一种新型的分子探针，在疾病的临床诊断和治疗方面具有较高的潜在应用价值^[29]。

5.1. 核酸适配体在肿瘤诊断中的应用

5.1.1. 用于生物传感器

大多数的生物传感器是基于抗体—抗原结合的原理来设计的^[30]，利用两种不同类型的抗体来检测靶分子，但是由于这些抗体的亲和力不同，对于将生物传感器用于疾病诊断带来了困扰。与抗体相比，核酸适配体具有很多优良特性，更重要的是与靶分子结合后，其构象会发生变化，这为设计独特、可变传感器提供了可能，如表 2 所示。因此，核酸适配体作为一种具有前景的生物传感器，已被用于与肿瘤相关的生物标志物传感器的设计中，包括：光适体传感器、电化学传感器等。

表 2. Property comparison of aptamer and antibody.

核酸适配体与抗体的性质比较

类别	本质	筛选方式	亲和力	免疫原性	温度敏感性	化学修饰	稳定性	逆转性
核酸适配体	核酸	体外	高	有	无	无限	稳定	有
抗体	多肽	体内	高	无	有	有限	不稳定	无

5.1.2. 用于肿瘤的体内外成像

由于核酸适配体具有分子量小、容易合成与修饰等优点，可以与荧光染料或纳米材料结合，用于体内外组织或细胞的成像，这对提高肿瘤预后具有非常重要的作用。Kunii 等^[17]利用 FITC 修饰的 DNA 适配体对小细胞肺癌细胞进行识别和成像。结果表明，靶细胞表面具有很强的荧光性，而其他类型的细胞表面没有检测到荧光。Zhao 等^[18]研发了一种新型适配体探针，利用四甲基罗丹明（tetramethylrhodamine，TAMRA）标记的荧光适配体将腺癌细胞从正常的肺组织或其他类型的肺癌中区分出来，这对非小细胞肺癌的诊断和治疗具有非常重要的意义。Yin 等^[31]将新型纳米材料与 DNA 适配体 AS1411 结合，用于肿瘤细胞成像。此研究表明，纳米材料—适配体复合物同时具有荧光成像能力与磁共振成像能力，可以显示出针对靶癌细胞的特异性诊断图像，可用于监测疾病的发展进程。

5.1.3. 用于肿瘤标志物的检测

肿瘤标志物是肿瘤发生、增殖、扩散或转移过程中，由癌细胞生物合成、分泌的一类分子，大多数是核酸与蛋白质^[32]。了解肿瘤发展的生物机制以及准确识别标志物的类型，对肿瘤的准确诊断、治疗具有至关重要的作用。核酸适配体作为新型的分子识别元件，已检测到了与肺癌相关的几种标志物，如波形蛋白（vimentin，VIM）^{[19, 21]}、组蛋白 H2B（histone-H2B）、微管蛋白（tubulin，TUB）和肌动蛋白（actin，ACT）等^[21]。Glod 等^[33]研发了一种基于慢速适配体（slow off-rate modified，SOMAmer）的蛋白质阵列技术，可以大规模地检测少量样品中的蛋白质组谱。与普通适配体相比，该适配体具有较强的疏水性，更容易与蛋白质结合，对新型生物标志物的检测有一定的帮助。

5.2. 用于肿瘤的治疗

很多放化疗药物会给患者带来很大的副作用，从而限制了其在临床上的应用。因此，如何将药物传送到癌细胞或组织中成为治疗过程中的关键问题。核酸适配体不仅可以用于肿瘤的诊断，还在肿瘤的治疗过程中发挥作用。

5.2.1. 作为载体

核酸适配体可以与靶分子特异性结合，为靶向药物的传送提供了良好的平台。核酸适配体还可以与化疗剂、纳米材料、脂质体、QDs 等载体结合，将药物直接传送到肿瘤细胞中，一方面提高了治疗的效率，另一方面减少了对正常细胞的伤害。

阿霉素（doxorubicine，DOX）是一种广泛使用的化学抗癌药物，其抗癌原理是插入 DNA 片段之后，导致 DNA 的复制和转录中断。因此，可以通过特异性适配体将 DOX 递送到肿瘤细胞中来阻断 DNA 链的复制，从而阻止肿瘤细胞的扩散和转移^[34]。Almasi 等^[35]利用核酸适配体与前列腺癌细胞（LNCaP）上的特异性膜抗原（prostate specific membrane antigen，PSMA）的高特异性，将 DOX 输送到 LNCaP 细胞中，与没有 PSMA 表达的前列腺癌细胞 PC3 相比，针对 LNCaP 细胞的处理达到了明显的治疗效果。结果证明，DOX 和核酸适配体的复合物可以对肿瘤细胞进行靶向治疗，同时减少了对非靶细胞的副作用。

小干扰 RNA（small interfering RNA，siRNA）是短 RNA 分子，可以通过参与 RNA 干扰导致基因沉默。因此，siRNA 已被广泛应用于很多疾病的治疗，在肿瘤的治疗中具有很大的应用前景，但是如何把 siRNA 传递到细胞中以及高效地发挥作用，一直是个难题。由于核酸适配体具有较好的稳定性、特异性高、亲和力强，并易于修饰等优点，可以将修饰的适配体与 siRNA 偶联，有利于解决 siRNA 的靶向传递问题。Lai 等^[36]通过核仁蛋白（nucleolin，NCL）介导的内吞作用，将核仁蛋白适配体—siRNA 嵌合体（aptNCL-SLUGsiR 和 aptNCL-NRP1siR）传送到肺腺癌细胞（CL1-5）中。结果表明，aptNCL-siRNA 嵌合体使 CL1-5 细胞中的 Snail 家族锌指转录因子（snail family zinc finger 2，SLUG）和神经纤毛蛋白-1（neuropilin-1，NRP1）的表达量明显降低，从而阻断了参与肺癌转移的关键信号通路，抑制了肿瘤侵袭、血管生成和循环肿瘤细胞的数量，达到了靶向治疗的目的。Perepelyuk 等^[37]将适配体—新型纳米材料缀合成递送系统，选择性地将微小 RNA-29b（miRNA-29b，miR-29b）传送到表达粘蛋白-1（mucin 1，MUC1）的 A549 细胞中，使 DNA 甲基化转移酶 3b（DNA methyltransferase3b，DNMT3b）和髓细胞白血病基因-1（myeloid cell leukemia-1，MCL1）的表达量显著下调，减缓了 A549 细胞的增殖，同时诱导了细胞的凋亡，从而提高了肺癌的治疗效率。

5.2.2. 作为药物

核酸适配体由于其无免疫原性，并具有较好的组织渗透性和化学稳定性，容易进入细胞，因此可用于细胞生命活动的调节。所以核酸适配体除了在临床诊断和靶向载体方面具有重要作用外，还可以作为治疗剂来治疗疾病。其原理是作为药物结合肿瘤细胞中的相关分子来影响细胞代谢途径，从而使细胞凋亡或杀伤细胞，进一步阻止了肿瘤细胞的扩散和转移，达到治疗疾病的目的^[38]。2004 年，第一个适配体基础药物（Macugen）被美国食品药品监督管理局批准上市，用于治疗黄斑病变（age-related macular degeneration，AMD）性疾病，Macugen 上市之后，其他适配体药物相继进入研发或临床试验阶段。相信随着技术的发展，核酸适配体药物在未来将会有更广阔的应用前景。

6. 展望

虽然以细胞为靶标的核酸适配体筛选技术已经达到成熟的阶段，但尚存在许多不足，仍有很多方面需要进一步完善。细胞与文库的比例、孵育时间、孵育温度、洗涤力度、洗涤液浓度、PCR 条件以及次级文库的制备方法等都需要逐步探索。核酸适配体作为一种新型的分子探针，在很多疾病的治疗中起着重要的作用，然而基于适配体诊断和治疗的方法仍处于早期阶段，要把核酸适配体应用于临床还需要进一步确定其有效性和安全性^[39]。因此，研究者需要不断优化和解决这些问题，才有利于今后将核酸适配体广泛应用于疾病的诊断和治疗中。

Funding Statement

国家自然科学基金资助项目（81360333）