一种非溶出广谱抑菌型聚己内酯/明胶-有机硅季铵盐纳米纤维膜用于伤口敷料

Abstract

本研究采用 5～20 wt% 的三甲氧基硅基丙基十八烷基二甲氧氯化铵（QAS）改性聚己内酯（PCL）/明胶复合材料（PG-Q），再通过静电纺丝技术制备出一种非溶出广谱抑菌型纳米纤维膜。扫描电镜和透射电镜观察表明 QAS 能促使明胶和 PCL 的相分离。动态水接触角结果证明 QAS 能够提高膜的表面憎水性，有利于敷料与伤口剥离。傅里叶变换红外光谱结果证明 QAS 与 PCL 及明胶之间存在着氢键及化学交联作用，有利于长效抑菌。此外，PG-Q 膜具有良好的细胞亲和性。其中 QAS 占 15 wt% 及 20 wt% 的样品 12 h 后对金葡菌及绿脓杆菌的抑制率均超过 99%。该 PG-Q 膜可作为一种抑菌型伤口敷料用于创面护理。

引言

皮肤对于病原体具有天然的屏障作用，大量文献报道伤口破损容易引发病原体在创面的聚集从而造成伤口感染^[1]。一旦发生难愈合的伤口感染，将会给患者造成极大的痛苦以及医疗负担^[2]。因此，制备抗感染的伤口敷料对于保护伤口以及抑制伤口感染具有极其重要的意义。

伤口敷料具有吸收渗出液、防止水分流失以及防止细菌侵入伤口的作用。利用抗菌型敷料对感染伤口进行处理可以提高细胞内皮化速率及促进伤口愈合^[3]。溶出型抗菌敷料的抑菌原理是在基体材料中加载一种或多种抑菌剂，如抗生素^[4-6]、银纳米粒子^[7-9]及季铵盐（trimethoxysilylpropyl octadecyldimethyl ammonium chloride，QAS）^[10]等，抑菌物质逐渐溶出释放到敷料周围从而杀灭细菌。然而，基于药物释放的溶出型伤口敷料存在一些缺陷，如：① 随着药物的释放，敷料的机械性能下降且完整性被破坏；② 药物释放时间短且难以控制；③ 难以做到可控释放，短暂大量突释会对周围组织产生毒性。而非溶出型敷料却可以克服以上不足，从而达到长效持久抑菌的效果。

QAS 具有广谱抑菌效果及高效抑菌活力，能够有效杀灭革兰阳性菌、革兰阴性菌及真菌。QAS 是一种具有双官能团的新型有机硅季铵盐，该季铵盐分子结构中含有一个硅氧键，能够在温和的条件下与羟基发生反应；此外，其长链烷基上含有带正电荷的季铵基团能够提供抑菌活性^[11]。据文献报道，QAS 可能的抗菌机制有两种：QAS 表面的阳离子基团与细菌膜表面的负电荷发生反应，导致细菌膜表面电荷分散不均从而造成膜破裂和细菌死亡；长链烷基穿透细菌膜进入细菌内部从而改变细菌膜的理化性能，引发细菌内容物泄漏从而杀灭细菌^[12]。

目前，QAS 已经作为消毒材料被广泛应用于纺织工业、医疗消毒以及包装材料。QAS 还被用于二氧化硅纳米粒子的表面改性且表现出优异的抗菌性能^[13]。Andresen 等^[14]利用 QAS 通过简单的吸收-固化法改性了纤维素膜表面，并指出该改性的纤维素膜对于伤口修复具有良好的效果。许多天然及人工合成高分子材料表面含有大量羟基和羧基，随着温度升高，大多能与 QAS 上的硅氧键发生反应并将 QAS 以化学键结合在膜表面，从而在基体表面形成一种抑菌的网络结构。并且，Si-O-Si 基团的稳定性很强，因而能够实现长效抑菌的功效。

静电纺丝是最直接有效制备微纳尺度纤维膜的方法。由于静电纺丝膜具有高比表面积、贯穿孔以及高孔隙率，因此非常适合作为伤口敷料用来止血、透气、保持水分及排出渗出液。与其他常见可降解高分子材料比较，如胶原、聚乳酸及聚乙醇酸等，聚己内酯［poly（ε-caprolactone），PCL］具有无免疫原性、降解过程不产生酸堆积、生物相容性好、柔韧性强、力学强度高、共混相容性好等诸多优点，使其在生物医用领域有着广泛的应用^[15]。因此，本研究拟采用 PCL 作为基体材料制备纤维膜。但是由于 PCL 在体内的吸收时间为 2～3 年^[16]，这对于可吸收隔离膜来说过于缓慢。此外，PCL 属于疏水性聚合物，不利于细胞黏附。因此，为了改善 PCL 的降解性能及生物相容性，需要将 PCL 与其他降解速率快且亲水性能好的聚合物共混或共聚。明胶是胶原的水解产物，不但降解吸收速率快、无免疫原性，而且明胶分子上保留了大量有助于细胞黏附、分化及增殖的氨基酸序列^[17]，因此，本研究选用明胶与 PCL 共混制备复合纳米纤维膜从而提高膜的相容性及降解速率。

本研究通过 QAS 改性 PG 复合材料，再通过静电纺丝技术将该复合材料（PG-Q）制备成纳米纤维膜，从而获得一种非溶出广谱抑菌且接触式杀菌型伤口敷料。本文研究了 QAS 的加入对于膜形态、表面亲水、抑菌活性以及细胞相容性的影响，将为制备新型的非溶出型抑菌敷料奠定基础。

1. 试剂和方法

1.1. 原料、试剂和主要仪器

QAS 购自英国 Fluorochem 公司；PCL（Mn = 70～90 kD)、明胶及 3-（4，5-二甲基噻唑-2）-2，5-二苯基四氮唑溴盐购自德国 Sigma-Aldrich 公司；四氟乙烯（tetrafluoroethylene，TFE）（纯度 99.8%）购自美国 Aladdin 公司；标准型光学接触角测定仪（SL200A）购自中国上海赛龙科技有限公司；扫描电子显微镜（scanning electron microscopy，SEM，Hitachi S-4700）、透射电子显微镜（transmission electron microscopy，TEM，JEM-2100F）购自日本日立公司。

1.2. 静电纺丝膜的制备

PCL-明胶（PG）溶液的配置是将 6 wt% 的 PCL/TFE 与 6 wt% 的明胶/TFE 以 70∶30 的质量比混合。将 PCL 与明胶总质量 5～20% 的 QAS 添加至 PG 溶液中。所有的溶液在 60℃ 下磁力搅拌 12 h。纺丝液挤出速率为 1.3 mL/h，电压 8～20 kV，接收铝箔滚筒转速为 300 r/min。接收滚筒距离为 20 cm，样品 PG、PG-Q5、PG-Q10、PG-Q15、PG-Q20 分别表示 QAS 含量占聚合物质量的 0%、5%、10%、15% 及 20%。

1.3. 表面形貌及纤维形貌

用 SEM 对样品 PG、PG-Q5、PG-Q10、PG-Q15、PG-Q20 的表面形貌进行形态观察。再用去离子水将膜反复清洗后，得到样品 PG’、PG-Q5’、PG-Q10’、PG-Q15’、PG-Q20’，再次用 SEM 观察膜的表面形貌。膜表面经过喷金处理。扫描电压 20 kV。

TEM 用来观察纺丝纤维的结构，观察样品为 PG-Q10。测试电压 200 kV，暗电流 95 μA，发射束流 126 μA。

1.4. 化学结构

傅里叶红外测试（Fourier transform infrared，FTIR）用来研究用于电纺丝的复合材料中各组分间（PCL、明胶及 QAS）的相互作用。采用 Bruker Tensor 27 分光仪，扫描范围是 400～4 000 cm^–1，分辨率为 2 cm^–1。测试样品分为：（a）不同季铵盐组分的纳米纤维膜（PG、PG-Q5、PG-Q10、PG-Q15、PG-Q20）；（b）单一组分（PCL、明胶、QAS）；（c）PCL 与 PCL-QAS 复合材料；（d）明胶与明胶-QAS。

1.5. 静态接触角

使用 SL200A-标准型光学接触角测定仪测量膜的静态接触角（water contact angle，WCA）。测试样品为含有不同季铵盐组分的纳米纤维膜 PG、PG-Q5、PG-Q10、PG-Q15、PG-Q20。拍照时间点分别为 0、1、2、5 及 10 s。

1.6. 细胞毒性试验

为了检测有机硅季铵盐以及材料中的有机溶剂对细胞毒性的影响，我们采用四甲基偶氮唑蓝（methyl thiazolyl tetrazolium，MTT）法来测试细胞毒性。

材料浸提液的制备：将大小 20 mm × 30 mm 的样品，用 75%（v/v）酒精清洗后按照 3 cm²/mL 浸泡在 37℃ 的 DMEM 中 24 h，再通过孔径 0.22 μm 的过滤器过滤获得测试样品的浸提液。

测试材料的分组情况分别为：组织培养板（tissue culture plate，TCP）以及含不同质量百分比的季铵盐的样品 PG、PG-Q5、PG-Q10、PG-Q15、PG-Q20。

MTT 法检测细胞毒性：用 96 孔板培养小鼠成纤维细胞 L929，接种细胞浓度为 5 × 10⁴/mL，24 h 后吸去培养液，加入等量材料浸提液，阴性对照用含有 10% 胎牛血清（fetal bovine serum，FBS）的 DMEM 培养液，分别于 24、48 及 72 h，经 5 mg/mL MTT 和酸化异丙醇处理后，用酶联仪在 630 nm 波长测其吸光度值，取平均值。计算细胞相对增殖率（relative growth rate，RGR）：RGR =（试样 OD 值 – 空白 OD 值）/（阴性 OD 值 – 空白 OD 值）。

1.7. 抑菌性能

依据 GB15979-2002 国家标准《一次性使用卫生用品卫生标准》和接触性创面敷料试验方法，采用非溶出性抗菌产品抑菌性能动态摇瓶法来测定纳米纤维膜的抑菌性。菌种选用临床上易引起伤口感染的两种常见菌：金黄色葡萄球菌和绿脓杆菌。设置不同 QAS 含量的 PG-Q（PG-Q5、PG-Q10、PG-Q15、PG-Q20）纳米纤维膜与菌种共培养作为实验组，PG 膜与菌种共培养作为材料对照组，空白组为单独菌种培育。

将细菌培养于溶原性肉汤（lysogeny broth，LB）溶液中，置于 37℃ 恒温摇床中培养 24 h。此后再将两种菌液各 1 mL 转移至含 50 mL 新鲜 LB 溶液的烧瓶中。37℃ 恒温摇床中再培养 5 h，从而获得细菌悬液。此后，将两种细菌的悬液用无菌生理盐水稀释到 1 × 10⁶ CFU/mL（CFU：菌落形成单位，colony-forming units）。将直径为 2 cm²的膜浸在 10 mL 细菌悬液（含 1 mL 细菌悬液和 9 mL 生理盐水）并置于密闭容器中，再将容器置于 37℃、170 r/min 的恒温摇床中分别培养 3、6 及 12 h。在预设时间点将 100 μL 的 10 倍稀释菌液加入琼脂板上。琼脂板在 37℃ 下孵育 12 h，观察细菌的增殖。最后，对 CFU 计数，计算细菌杀死率。

1.8. 统计学处理

所有的实验数据以均值 ± 标准误表示，采用 SPSS 17.0 软件对实验结果进行统计学分析，两组间比较采用 t 检验，多组间比较采用方差分析。P < 0.05 认为差异具有统计学意义。

2. 结果与讨论

2.1. 表面形貌

静电纺丝纳米纤维膜的 SEM 图像如图 1 所示。与未加入 QAS 的 PG 膜相比，含 QAS 的 PG-Q 纳米纤维膜结构完整，纤维表面光滑连续，无串珠形成。这是由于带正电荷的 QAS 加入后，三甲氧基硅烷基团水解形成的硅羟基与 PCL 和明胶分子链上的羟基、羧基等发生脱水缩合，从而将带正电的季铵盐基团键合在纺丝基体上。

图 1.

The SEM images of the electrospun nanofibrous membranes containing different QAS components before and after washed with ultrapure water

水洗前及水洗后不同 QAS 含量的 PG-Q 静电纺丝膜的扫描电镜图片

the black arrows showed the subnet structure

黑色箭头表示亚网络结构

当电场中电压足够强时，带电射流会在电压作用下进一步延伸为单独的纤维或分丝成几根纤维。如图 1 中箭头所示，在 PG-Q5 和 PG-Q10 中存在少量的纤维直径在 10 nm 以下的亚网络结构纤维。我们推断这种亚网络结构是由于纺丝过程中明胶的相分离形成的。而当季铵盐含量高于 15% 时，亚网络结构消失，但出现直径为数十纳米的超细纤维。

为了证实这种亚网络结构的主要成分是分相后的明胶，我们对去离子水反复清洗后的纳米纤维膜进行了 SEM 表征，结果表明水洗后的纳米纤维膜中亚网络结构消失，但纤维膜的整体形貌未发生明显改变，该结果侧面证实亚网络结构的主要成分为易溶于水的明胶，而疏水的 PCL 则有利于纤维形貌结构保持完整。

如表 1 所示，随着 QAS 含量的增多，纤维直径及其分布都有所增大，水洗后纤维轻微溶胀，直径略有增加但直径分布变窄。纤维直径分布变窄是由于亚网络结构消失，纤维直径趋于均一化，这也从另一方面证实了亚网络结构是由具有良好亲水性的明胶分相后形成的。

表 1. Fiber diameter statistics of electrospun PG-Q memb ranes before and after washing.

PG-Q 电纺纤维膜水洗前和水洗后纤维直径的参数统计

样品名称	QAS(wt%)	水洗前直径/μm	水洗后直径/μm
PG-Q5	5	0.16 ± 0.04	0.17 ± 0.02
PG-Q10	10	0.17 ± 0.04	0.17 ± 0.02
PG-Q15	15	0.18 ± 0.05	0.19 ± 0.03
PG-Q20	20	0.22 ± 0.08	0.23 ± 0.02

对 PG-Q10 进行 TEM 观察（见图 2），可以清晰地看到纤维内部出现相分离结构，由于密度和衬度不同，纤维内层颜色较深的为 PCL，纤维外部颜色较浅的为明胶，这与图 1 中 PG-Q5 和 PG-Q10 中出现的亚网络结构相对应，再一次证实了亚网络结构是由明胶分相后形成的。

图 2.

The TEM image of the PG-Q10 containing 10 wt% QAS

QAS 质量分数为 10% 的 PG-Q10 样品的 TEM 图片

此外，从图 1 中可见不同样品纳米纤维膜的孔径为 0.5～4 μm，远小于临床现有敷料的孔径，从而能够更有效地阻止细菌的透过，同时还有利于气体的交换。

2.2. 不同组分间相互作用

图 3a 是含有不同 QAS 组分的有机硅季铵盐聚己内酯明胶纳米纤维膜的红外谱图。如图 3b 所示，PCL 的红外谱图中，2 800～2 900 cm^–1是 CH₃ 和 CH₂ 的伸缩振动峰，1 725 cm^–1是羰基峰；1 650、1 550 cm^–1是明胶中酰胺Ⅰ和酰胺Ⅱ键（1 650 cm^–1是酰胺Ⅰ键，反对称-COOH 或 C=O 振动；1 550 cm^–1为酰胺Ⅱ键，C-N 伸缩或 N-H 弯曲振动）；1 088 cm^–1是 QAS 中的 Si-O 键。

图 3.

Infrared spectrums of different samples

不同样品红外谱图的对比

a. nanometer fiber membranes containing different QAS components; b. single component; c. PCL and PCL-QAS composites; d. gelatin and gelatin-QAS composites

a.含有不同季铵盐组分的纳米纤维膜；b.单一组分；c. PCL 与 PCL-QAS 复合材料；d.明胶与明胶-QAS 复合材料

如图 3c 所示，PCL 谱图中 1 725 cm^–1中的 C=O 伸缩振动峰在加入 QAS 后向 1 647 cm^–1低波数偏移，是由于硅羟基和羰基酯键形成氢键，使羰基电子云密度平均化，从而使伸缩振动频率降低，证明了 PCL 与 QAS 之间确实存在着强相互作用。

为证实明胶与 QAS 之间的作用，用 QAS 的良溶剂甲醇清洗纳米纤维膜来去除纤维膜中以物理共混状态存在的 QAS，当清洗后的溶液中经 FTIR 检测无残留 QAS 后，对清洗后的纤维膜进行 FTIR 表征（见图 3d），结果表明在 2 946、2 868 cm^–1处仍然出现 QAS 长链烷烃中的 CH₃ 和 CH₂ 振动峰，1 088 cm^–1处出现 Si-O-Si 基团，证明 QAS 和明胶之间发生了化学交联反应，QAS 化学键合在聚合物基体上。此外，QAS 分子间相互作用脱水缩合也能形成 Si-O-Si 键，能够在材料表面形成一层 Si-O-Si 的抗菌网络层，并且由于 Si-O 键能高因而性质稳定，不易从基体上脱落，因此赋予了材料持久长效的抗菌效果。这种特殊的结构使得 PG-Q 膜与现有临床应用较多的含银离子的抗菌敷料相比，更能长期有效地抑制杀灭细菌。

2.3. 亲水性

纤维膜表面 WCA 结果如图 4 所示，随着 QAS 含量从 0% 增至 20%，纤维膜表面 WCA 逐渐增大，分别是 100.12°、104.47°、112.23°、118.84°、122.66°，说明膜的疏水性增大。这一结果是由于 QAS 中含有疏水性很强的十八烷基，其与纺丝基体结合后使纤维亲水性下降。由于疏水的纤维表面不利于纤维细胞的附着，因此可以防止伤口部位与敷料之间发生粘连，更换敷料时就不会引起患者的二次创伤，从而有利于伤口的愈合。

图 4.

The WCA images of nanometer fiber membranes containing different QAS components

不同 QAS 含量的纳米纤维膜表面 WCA 变化

2.4. 细胞毒性试验

如图 5b 所示，将 L929 细胞与纤维膜的浸提液共培育 24、48、72 h 后，L929 细胞基本呈现出梭形、三角形及长方形，具有良好的生长状态，且随着时间延长细胞呈现良好的增殖状态。图 5a 表明 48、72 h 后，所有载药型 L929 细胞的 RGR 均接近甚至高于 100%，对照组和各实验组之间以及含不同 QAS 的 PG-Q 纳米纤维膜之间的 RGR 均无明显差异（P > 0.05），即使 QAS 含量增至 20%，实验组和空白组的细胞增殖、分化程度仍相似，实验组材料培育的细胞 RGR 均在 95% 以上。这一结果证实 QAS 的加入以及纺丝过程中溶剂的使用均不影响材料的细胞毒性，该 PG-Q 膜具有良好的细胞亲和性。

图 5.

The cytotoxicity of the PG-Q membranes containing different QAS components

不同 QAS 含量的 PG-Q 膜的细胞毒性

a. the RGR results; b. fluorescent photographs of cells

a.细胞 RGR；b.细胞荧光照片

2.5. 体外抑菌性能

将 PG-Q 纳米纤维膜与菌种培育不同时间后进行平板计数，菌落增殖照片如图 6 所示。PG-Q 纳米纤维膜的抑菌性源自于 QAS 上带正电荷的 N⁺阳离子，其可通过静电力吸引带负电荷的细菌，破坏细菌菌膜上的电荷平衡，使细菌内容物泄露，从而达到抑菌杀菌的效果。不含 QAS 的 PG 膜与金黄色葡萄球菌共培育 3、6、12 h 后，始终未表现出抑菌性。而含 QAS 的 PG-Q 纤维膜均表现出抑菌性，且抑菌率随 QAS 含量的增加而逐渐增大。其中 PG-Q15 和 PG-Q20 与金黄色葡萄球菌共培育 3 h 后，抑菌率就分别达到 61.37% 和 72.67%，6 h 后均可杀灭 99.99% 的金黄色葡萄球菌。因此我们选择 PG-Q15 和 PG-Q20 作为革兰阴性菌的抑菌试验对象。PG-Q15 和 PG-Q20 与绿脓杆菌共培育 3 h 后的抑菌率分别为 47.20% 和 51.71%，培育时间 6 h 时抑菌率分别为 68.41% 和 90.37%，培育 12 h 后抑菌率达 99.51% 和 99.88%。因此 PG-Q 膜对革兰阳性及革兰阴性菌均有良好的抑菌效果，且对革兰阳性菌的抑菌作用更明显。

图 6.

The CFU photograph of S. aureus and P. aeruginosa on electrospun PG-Q membranes containing different QAS components

金黄色葡萄球菌及绿脓杆菌在不同 QAS 含量的 PG-Q 膜上的生长情况

本研究首次将有机硅季铵盐 QAS 用于制备抗菌敷料的研究，PG-Q 膜不仅对于导致伤口感染的常见细菌具有明显的抗菌效果，同时也具有相对快速的杀菌速率。由于银离子敷料存在安全隐患，该 PG-Q 膜具有补充并替代现有抗菌敷料的发展潜力。

3. 结论

本研究采用 QAS 来改性 PCL-明胶复合材料，通过静电纺丝法制备出不同 QAS 含量的具有微纳结构的纤维膜。结果表明 QAS 的加入能够促进 PCL 与明胶的相分离，还能提高膜的憎水性，有利于膜与伤口的剥离。QAS 与 PCL-明胶之间存在着物理和化学交联作用，有助于 QAS 发挥长效抑菌作用。此外，QAS 的加入对于细胞毒性以及细胞在膜上的黏附及增殖没有显著影响。QAS 含量为 15 wt% 及 20 wt% 的样品对金黄色葡萄球菌及绿脓杆菌都有明显的抑制作用。通过添加 QAS 抗菌剂，赋予了静电纺丝纳米纤维膜以广谱抗菌的特点，且 QAS 通过化学交联作用与纺丝基体结合在一起，具有非水溶性、不会随着体液循环进入人体内部以及长期抗菌的优点。此外，相比于负载抗生素等载药纳米纤维膜，PG-Q 膜的阳离子接触式杀菌机制不会引起菌种耐药性。综上所述，PG-Q15 和 PG-Q20 纤维膜具有作为抑菌型伤口敷料的临床应用潜能。

Funding Statement

国家自然科学基金（51673029，81330043，81071499）；北京市科技新星计划（Z131102000413015）；北京市优秀人才青年拔尖项目(2016000021223ZK34)