姜黄素/聚(α-氰基丙烯酸异丁酯)载药微球的制备及其药物释放

Abstract

Curcumin-loaded poly (α-isobutyl cyanoacrylate) microspheres (Cur-HP-β-CD-PiBCA) were prepared by one-step emulsification with α-isobutyl cyanoacrylate as materials, poloxamer 188 as emulsifier, and curcumin complex with hydroxypropyl-β-cyclodextrin (Cur-HP-β-CD) as drug prepared by kneading method. Effects of emulsifier and drug concentration on microspheres size and distribution, drug loading and encapsulation efficiency were investigated in detail. And the curcumin release of drug-loaded microspheres was also studied. Results showed that as the emulsifier concentration increased from 0.01% to 0.07%, particle size of the drug-loaded microspheres decreased while particle size distribution, drug loading and entrapment efficiency increased. The optimized concentration of surfactant was 0.05%. With increasing the concentration of drug from 0.03% to 0.07%, drug loading of Cur-HP-β-CD-PiBCA increased, but encapsulation efficiency decreased. Additionally, the results of drug release experiments revealed that the higher drug loading of Cur-HP-β-CD-PiBCA was, the lower cumulative release percentage was. Drug-loading of cumulative inclusions in HP-β-CD by PiBCA can improve its wettability, and increase the degree of dissolution and bioavailability.

引言

姜黄素（curcumin，Cur）为中药姜黄的主要成分，具有抗炎、抗氧化、抗肿瘤、抗肝细胞毒性、抗风湿、抗低血压、抑菌、降低胆固醇等药理作用^[1]，在酸性环境下稳定，但在中性、碱性和光照条件下不稳定^[2]，且在水中溶解度极低，限制了其广泛应用。通过将其制备成脂质体^[3]、纳米混悬剂^[4]或利用聚合物进行负载^[5-7]，虽可在一定程度上提高其生物利用度，但又存在脂质体储存稳定性低^[3]、纳米混悬剂表面修饰难^[4]、聚合物负载后有机溶剂残留等问题^[7]。利用亲水性的 β-环糊精空腔对疏水性姜黄素进行包合，可使包合物的润湿性增加，达到改善药物溶出和提高生物利用度的目的^[8]。聚（α-氰基丙烯酸酯）由于其良好的生物相容性、生物降解性以及较低的毒性，在药物载体方面具有广泛的应用前景^[9-10]。若能先用 β-环糊精将姜黄素包合，再以聚（α-氰基丙烯酸酯）为载体材料进行负载，则可直接利用乳化法制备姜黄素的缓释微球，在提高姜黄素生物利用度的同时，解决有机溶剂或未反应单体的残留，该方法简单、经济，目前未见文献报道。本研究先通过捏合法^[8]制备了羟丙基-β-环糊精包合的姜黄素（curcumin-（2-hydroxypropyl）-β-cyclodextrin，Cur-HP-β-CD）以提高姜黄素的水溶性，然后进一步用乳化法制备了姜黄素/聚（α-氰基丙烯酸异丁酯）纳米载药微球（curcumin-（2-hydroxypropyl）-β-cyclodextrin poly（α-isobutyl cyanoacrylate），Cur-HP-β-CD-PiBCA），避免了使用大量有机溶剂，单体反应完全，整个过程绿色环保。

1. 实验部分

1.1. 主要原料和试剂

Cur（纯度 ≥ 95%），上海源叶生物科技有限公司；Cur 对照品（纯度 ≥ 98%），中国药品生物制品检定所；HP-β-CD（纯度 ≥ 97%），上海阿拉丁生化科技股份有限公司；泊洛沙姆 188，医药级，北京索莱宝科技有限公司；α-氰基丙烯酸异丁酯（α-isobutyl cyanoacrylate，iBCA），医用级，秦皇岛市科峰医疗器械有限公司。

1.2. Cur-HP-β-CD 包合物的制备

按照 HP-β-CD 与 Cur 物质的量之比为 1∶1，分别称取一定量 HP-β-CD 与 Cur 加入到研钵中，加入少量的无水乙醇，然后在研磨的情况下间歇加入少量去离子水，在悬浮液状态下研磨 1 h ，然后将浆体在 45℃ 真空干燥箱中干燥至恒重后，收集过 80 目筛，保存备用。

1.3. Cur-HP-β-CD-PiBCA 载药微球的制备

在含有 50 mL 去离子水的三口瓶中加入一定量泊洛沙姆 188，室温搅拌溶解。用 0.1 mol/L HCl 调节体系 pH 至 2.0 后，加入一定量的 Cur-HP-β-CD 包合物，搅拌 15 min 后缓慢逐滴加入一定量 iBCA，750 r/min 搅拌 3 h；然后用 0.1 mol/L NaOH 溶液调节体系 pH 至 6.5 ± 0.5，继续搅拌 0.5 h 后结束反应。将反应得到的悬浮液用 1.0 μm 微孔滤膜过滤，滤液高速冷冻离心 1 h（4℃，15 000 r/min，下同）后用去离子水洗涤 3 次，真空冷冻干燥得 Cur-HP-β-CD-PiBCA 冻干微球。同理，不加 Cur-HP-β-CD 制备的微球为 PiBCA 空白微球。

1.4. Cur 检测波长的测定

取一定量经 1.0 μm 微孔滤膜过滤后的空白微球悬浮液至离心管中，高速冷冻离心 1 h 后，取其上清液用生理盐水/无水乙醇混合溶剂（6∶4，v/v，下同）稀释 10 倍，然后以之为溶剂配置浓度为 10.0 μg/mL 的姜黄素溶液，利用紫外可见分光光度计（上海美谱达仪器有限公司，UV-6100 S，下同），在波长 300～800 nm 之间对配置的姜黄素溶液进行扫描，确定 Cur 在该波长范围内的最大吸收峰。

1.5. Cur 标准曲线的绘制

以生理盐水/无水乙醇混合溶剂配制质量浓度分别为 0.3、0.5、1.0、1.5、2.5、5.0、10.0 μg/mL 的一系列 Cur 对照品溶液，用紫外可见分光光度计在 Cur 的最大吸收峰处的波长下测定吸光度 A，以吸光度 A 对 Cur 的质量浓度做回归曲线，即得 Cur 标准曲线。

1.6. Cur-HP-β-CD 包合物溶解度测定

称取 25 mg Cur-HP-β-CD 包合物于 25 mL 蒸馏水中，25℃ 振荡 48 h 后形成 Cur-HP-β-CD 包合物过饱和溶液，经 1 μm 微孔滤膜过滤后，滤液用生理盐水/无水乙醇混合溶剂稀释 10 倍，然后用紫外可见分光光度计在 Cur 的紫外最大吸收波长处测定吸光度 A，代入 Cur 标准曲线回归方程，以此计算 Cur 的溶解度，并根据包合物中两种物质的量之比推算包合物的溶解度，为载药微球制备中包合物的溶解提供数据支撑。

1.7. 载药微球包封率和载药率的测定

取经过 1 μm 微孔滤膜过滤、滤液高速冷冻离心 1 h 后的空白微球悬浮液的上清液，并用生理盐水/无水乙醇混合溶剂稀释 10 倍后做参照液。同理，Cur-HP-β-CD-PiBCA 载药微球的上清液用生理盐水/无水乙醇混合溶剂稀释 10 倍后，常温超声（40 kHz，200 W）5 min，将负载的 Cur 溶出；4 000 r/min 下离心 15 min，将超声后的空白微球沉淀到底部；测定其上清液的吸光度 A。代入 Cur 标准曲线回归方程，以此计算未被负载的 Cur 浓度，从而得到未被负载的 Cur 质量，从而计算包封率（entrapment efficiency，EE） = （m₁–m₂）/m₁ × 100% 和载药率（drug loading，DL） = （m₁–m₂）/m₃ × 100%，其中 m₁ 是添加的 Cur 有效质量，m₂ 为载药后未被负载的 Cur 质量，m₃ 为最终得到的微球总质量。

1.8. 载药微球的药物释放

Cur-HP-β-CD-PiBCA 微球的体外药物释放研究采用透析袋（8～14 kD）法^[11]。将 5 mL Cur-HP-β-CD-PiBCA 悬浮液置于透析袋中，50 mL 生理盐水/无水乙醇混合溶剂作为介质加入到烧杯中，37℃ 下 150 r/min 磁力搅拌下进行透析。每隔一定时间取 3 mL 溶解介质用紫外可见分光光度计测试吸光度 A，同时往烧杯中添加 3 mL 生理盐水/无水乙醇混合溶剂。以生理盐水/无水乙醇混合溶剂为空白参照，根据 Cur 标准曲线回归方程，计算溶出的 Cur 浓度，并计算 Cur 在不同时间的累积释放百分率（cumulative release percentage，记为 Q）。

1.9. 微球粒径及其分布测定

将空白 PiBCA 微球或 Cur-HP-β-CD-PiBCA 载药微球经过 1 μm 微孔滤膜过滤后的悬浮液用去离子水稀释 5 倍后，用激光散射粒度分析仪（Zeta PALS/BIC 90 PALS，美国布鲁克海文仪器公司）测试微球粒径（diameter，d）及粒径分布（particle size distribution index，PDI）。

2. 结果与讨论

2.1. Cur 的标准曲线

绘制 Cur 的标准曲线之前，先需知其在生理盐水/无水乙醇混合溶剂（6∶4，v/v）中的最大紫外吸收波长。图 1 是在 300～800 nm 波长之间对配置的 Cur 溶液进行扫描的结果。从图 1 可知，仅在 426 nm 处出现最大吸收峰，且生理盐水和无水乙醇在此位置无吸收，表明 Cur 在生理盐水/无水乙醇混合溶剂中的最大吸收峰的波长为 426 nm，因此后续实验将选择在 426 nm 处检测溶液中的 Cur。

图 1.

Ultraviolet scanning spectrum of Cur

Cur 的紫外扫描图谱

在确定了 Cur 的最大紫外吸收波长后，通过配制一系列浓度梯度的 Cur 的生理盐水/无水乙醇混合溶液，在 426 nm 处测定其吸光度 A，以溶液的吸光度对 Cur 溶液的质量浓度做回归，得到标准曲线回归方程为 A = 0.167 7 C + 0.013 8（见图 2），其相关系数 R² = 0.999 7，其中 C 为质量浓度。

图 2.

Standard curve of Cur absorbance and concentration

Cur 吸光度与浓度标准曲线

此外，通过标准曲线，计算出了 Cur-HP-β-CD 包合物过饱和溶液中溶解的 Cur 含量为 134.6 μg/mL。由于 Cur 和 HP-β-CD 包合物的物质的量之比为 1∶1^[8]，进一步推算出 Cur-HP-β-CD 包合物的溶解度为 697.6 μg/mL。

2.2. 乳化剂的影响

由于 Cur-HP-β-CD-PiBCA 载药微球是以泊洛沙姆 188 为乳化剂经乳化法制得^[12]，因此乳化剂的用量将对微球的粒径及粒径分布和 DL、EE 有极大的影响。图 3 是在 Cur-HP-β-CD 药物浓度为 0.07%（w/v）的条件下，考察了泊洛沙姆 188 浓度对载药微球粒径/粒径分布、DL 和 EE 的影响。

图 3.

Effect of poloxamer 188 concentration on size and its distribution, drug loading and encapsulation efficiency of microspheres

泊洛沙姆 188 浓度对微球粒径及其粒径分布、DL 和 EE 的影响

从图 3 左图可以看出，随着泊洛沙姆 188 浓度从 0.01% 增加到 0.07%，Cur-HP-β-CD-PiBCA 载药微球粒径随之下降（从 194.9 nm 下降到 109.7 nm），微球粒径分布随之变大（从 0.05 增加到 0.30）；但是当泊洛沙姆 188 浓度超过 0.05% 后，载药微球粒径变化不大，但微球粒径分布急剧变宽。实验过程中还发现，泊洛沙姆 188 浓度较小（< 0.04%）时，体系存在微球沉淀现象；而泊洛沙姆 188 浓度较高（> 0.06%）时，体系起泡现象比较严重，增加了后续分离和洗涤的难度。出现上述实验结果的原因可能是：泊洛沙姆 188 的临界胶束浓度（critical micelle concentration，CMC）^[13]为 1.25 × 10^–3 mol/L，即相对含量为 1.14%。本研究中所用的泊洛沙姆 188 的用量最大为 0.07%，此时尚未达到其 CMC，在体系中形成新胶束或新乳胶粒的概率较低，因此理论上在 CMC 以下微球粒径分布较窄。但是 iBCA 乳化成粒过程不同于传统的乳液聚合成粒过程，因为 iBCA 聚合后聚合物的链末端为羟基，其本身具有自乳化成粒倾向，且生成的粒状聚合物的亲水性比单体本身大，故水中的泊洛沙姆 188 以及原来吸附在单体 iBCA 液滴上的泊洛沙姆 188 将重新分配，即单体液滴上的乳化剂泊洛沙姆 188 会向水中迁移，加之单体引发聚合后可形成新的乳胶粒，因此整个体系乳化剂一直处于动态分布过程，最终导致生成的微球粒径变小，但粒径分布变宽。随着泊洛沙姆 188 用量增加，起泡现象严重，也是由于形成的聚合物粒子亲水性增加，导致对乳化剂吸附力下降，进而乳化剂泊洛沙姆 188 向水相扩散，在水相的浓度增加，导致起泡现象加重。

从图 3 右图中可知，泊洛沙姆 188 浓度从 0.01% 增加到 0.03%（w/v），微球的 DL 和 EE 急剧增加，微球 DL 从 7.69% 增加到 9.88%，EE 从 45.5% 增加到 58.5%；但是当泊洛沙姆 188 浓度从 0.03% 增加到 0.07%（w/v），微球的 DL 和 EE 变化不大，趋于平衡。这可能是在较低的乳化剂浓度下，微球的表面不能被乳化剂分子完全覆盖，iBCA 接触到水相的 HO^–随即发生快速阴离子聚合，造成微球表面呈现多孔结构，负载的药物也比较容易从微球表面扩散出来到介质中，从而导致 EE 和 DL 较低；随着乳化剂浓度的增加，微球表面被乳化剂分子覆盖，易形成较致密的结构^[14]，负载的药物损失量较小，DL 和 EE 增加。但是进一步增加乳化剂的用量，微球 DL 和 EE 却并未持续增加，而是保持在一个相对恒定的水平。这可能是因为随着乳化剂浓度增加，微球表面变得光滑，因此在合成的时候药物的损失量逐渐减小；与此同时，随着乳化剂浓度增加，粒径减小，从而导致总颗粒表面积的增加，药物损失总量增加。这两种对立的因素相互抵消，微球 DL 与 EE 则相应地趋于稳定。

综合微球粒径及其分布、微球 DL 和 EE 的变化规律，本研究中泊洛沙姆 188 的浓度选择以 0.05% 较为适宜。

2.3. 药物浓度的影响

在泊洛沙姆 188 浓度为 0.05%（w/v）的条件下，制备了 Cur-HP-β-CD-PiBCA 载药微球，考察了 Cur-HP-β-CD 药物的浓度对 Cur-HP-β-CD-PiBCA 微球的 DL 与 EE 的影响，结果如图 4 所示。

图 4.

Effect of Cur-HP-β-CD concentration on drug loading and encapsulation efficiency of microspheres

Cur-HP-β-CD 药物浓度对微球 DL 与 EE 的影响

从图 4 可知，当 Cur-HP-β-CD 药物浓度从 0.03% 增加到 0.07% 时，微球 DL 逐渐升高（从 5.50% 上升至 9.96%），而 EE 下降（从 76.1% 下降至 59.4%）。出现这种现象的原因，可能与药物负载方式有关，药物除了在微球表面的吸附之外，还有一部分药物随着 iBCA 聚合的进行被包裹进微球内部。增加药物浓度，微球内部包裹的药物虽然有所增加，但是由于微球上药物的吸附逐渐趋于饱和，药物的吸附和脱附最终达到平衡状态^[15]。药物浓度越大，负载到微球上的药物量越多，但是相应地未负载的药物也越多，并且占投入药物的比例增大，故出现了这种现象。

2.4. 载药微球的体外释放

本文以生理盐水/无水乙醇混合溶剂作为空白参照液，用紫外可见分光光度计对 Cur-HP-β-CD-PiBCA 载药微球的体外药物释放进行了研究。图 5 是载药率分别为 5.50%、7.84%、9.96% 的 3 种 Cur-HP-β-CD-PiBCA 载药微球，在 37℃ 下的生理盐水/无水乙醇混合溶剂中的体外释放曲线。

图 5.

In vitro cumulative drug release of microspheres

载药微球的体外释放曲线

从图 5 中可以看出，3 种不同 DL 微球的药物释放曲线相似，都是在前 20 h 的药物释放较快，DL 分别为 5.50%、7.84%、9.96% 的 3 种 Cur-HP-β-CD-PiBCA 载药微球的药物累积释放百分率 Q 值，在 20 h 时分别达到 91.1%、83.5%、76.3%，在 20 h 后药物释放减缓；DL 为 5.50% 的微球在 32 h 后趋于平衡，DL 为 7.84% 和 9.96% 的微球在 48 h 后趋于平衡；在整个药物释放周期内，上述载药微球最高累积释放百分率分别维持在 92.9%、89.9%、86.0%，即 DL 越高的微球，累积释放百分率越低。这是由于微球负载的药物，不仅有一部分包裹在微球内部，还有一部分吸附在微球表面。快速释放阶段，大部分是吸附在微球表面的药物进行释放以及包裹在微球表层的药物通过多孔通道进行释放；缓慢释放阶段主要是粒子内部的药物逐渐释放出来。另外由于部分药物深埋在微球内部，往往需要在载体材料降解后进行释放，而载体材料的降解需要一定的时间^[14]。

3. 结论

本文以 iBCA 为原料，泊洛沙姆 188 为乳化剂，HP-β-CD 与 Cur 经捏合法制备的 Cur-HP-β-CD 包合物为负载药物，通过一步乳化法成功制备了 Cur-HP-β-CD-PiBCA 载药微球，不仅有效改善了 Cur 的亲水性，而且提高了其溶出度，为提高其生物利用度奠定了基础。研究发现：

（1）乳化剂用量增加，载药微球粒径下降，粒径分布变宽，DL 和 EE 均增加。

（2）药物浓度增加，微球 DL 升高，EE 下降。

（3）载药微球 DL 越高，累积释放百分率越低，前 20 h 的药物释放较快，从而为姜黄素等脂溶性的药物的负载与释放提供了技术基础。