稳定表达人乳头瘤病毒 58 型（HPV58）E6E7 融合基因的人宫颈癌细胞株 C33A 的构建及验证

Abstract

The study was performed to construct a human cervical cancer cell line C33A which can stably express HPV58E6E7 fusion gene. Firstly, C33A cells were transfected with the recombinant lentivirus LV-HPV58E6E7 which contained HPV58E6E7 fusion gene, and the stably transfected cells (LV-HPV58E6E7/C33A) were screened out by flow cytometry. MTT was used to observe the growth of LV-HPV58E6E7/C33A cells and flow cytometry was carried out to detect the cell cycle. LV-HPV58E6E7/C33A cells were inoculated into the left armpits of nude mice. Then, the transcription and expression of HPV58E6E7 fusion gene was detected by qRT-PCR and Western blot, respectively. The results showed that HPV58E6E7 fusion gene can promote the proliferation of C33A cells. HPV58E6E7 fusion gene can be stably transcripted and expressed in vaccinated nude mice. The conclusion indicated that we successfully established a cervical cancer cell line LV-HPV58E6E7/C33A which can stably express HPV58E6E7 fusion gene. This cell line will provide an antigen cell line for the immune effect detection of HPV58 therapeutic vaccine.

引言

人乳头瘤病毒（human papillomavirus，HPV）已被证实是子宫颈癌及癌前病变发生的首要因素且为始动因素。既往研究证明，HPV E6 和 E7 蛋白从病毒开始感染到癌症的进展期，在肿瘤发展的所有阶段均有表达，同时，作为维持其恶性表型所必需持续存在的病毒抗原^[1]，E6 和 E7 蛋白能诱发机体产生并维持较强的以病毒抗原为靶分子的特异性细胞毒性 T 细胞（cytotoxic T cell，Tc 或 CTL）反应。因此，HPV E6 和 E7 蛋白成为宫颈癌治疗性疫苗研究和开发的主要特异靶抗原^[2]。

流行病学研究证明，HPV16 和 18 型的感染在世界范围内很普遍，没有明显的地区差异，而 HPV58 型的感染分布则具有明显的区域性，仅在东亚和南亚各国有很高的感染率，尤其是我国南方的一些地区，如广西、香港等区域，已超过 18 型而位居第二^[3]。由于 HPV 世界流行病学的分布，目前国内外 HPV 治疗性疫苗的研制主要集中在 HPV16 型、HPV18 型，缺少对 HPV58 型治疗性疫苗的研究^[4]，市面上更不存在 HPV58 型阳性的人宫颈癌细胞系，因此无法构建相关的动物模型，而稳定表达 HPV58 型 E6E7 融合基因的细胞系是后期 HPV58 型治疗性疫苗开发及评价其免疫效果研究所必须的。本研究在前期成功构建的表达 HPV58 型 E6E7 融合基因的慢病毒载体的基础上^[5]，通过构建稳定表达 HPV58 型 E6E7 融合基因的人宫颈癌细胞系，并建立荷瘤小鼠模型，为 HPV58 型阳性相关肿瘤及其癌前病变免疫相关疫苗的研究奠定基础。

1. 材料与方法

1.1. 材料

1.1.1 质粒、引物、菌株、细胞、动物　HPV58E6E7 融合基因上下游引物、GAPDH 上下游引物、重组慢病毒 LV-HPV58E6E7 和空载体病毒 LV-CON 均由本实验室构建并保存；HPV（–）的 C33A 细胞株购自中国科学院；雌性 BALA/C 裸鼠，4～6 周，16～18 g，购自广西医科大学动物实验中心并饲养于广西医科大学动物实验中心 SPF 级层流室内。

1.1.2 主要试剂、酶及抗体　培养基 RPMI-1640、胎牛血清、胰酶购自美国 Corning 公司；青链霉素双抗、RIPA（radio immunoprecipitation assay）裂解液、二哇琳甲酸（Bicinchoninicacid，BCA）蛋白定量提取试剂盒、MTT 购自碧云天公司；总 RNA 逆转录试剂盒购自美国 Thermo 公司；SYBR^® Premix Ex Taq II 购自宝生生物公司；鼠抗 β-actin 抗体、鼠抗人 His 标签单克隆抗体、HRP 标记的羊抗小鼠 IgG 购自北京博奥森生物技术有限公司；细胞周期测试盒购于凯基生物公司；ECL 化学发光试剂盒购自索莱宝公司。

1.2. 方法

1.2.1 重组慢病毒 LV-HPV58E6E7 感染 C33A 细胞将 HPV（–）的人宫颈癌细胞株 C33A 细胞置于含有 10% 胎牛血清、100 U/mL 的青霉素、100 μg/mL 链霉素的 RPMI-1640 完全培养液中，于 37℃、5% CO₂ 的恒温培养箱中培养。将对数生长期的 C33A 细胞接种到 6 孔板中，分三组：C33A 组：C33A 细胞，无处理，为空白对照组；LV-NC/C33A 组：转染空载体的病毒颗粒的 C33A 细胞，为阴性对照组；LV-HPV58E6E7/C33A 组：转染带 HPV58E6E7 融合基因的病毒颗粒的 C33A 细胞，为实验组。24 h 后待其汇合度达到 20%～30% 时，将包含 HPV58 型 E6E7 融合基因的病毒颗粒 LV-HPV58E6E7 及空载体病毒颗粒 LV-CON 分别转染 C33A 细胞，转染后将细胞置于 37℃、5% CO₂ 培养箱中培养。由于该慢病毒系统带有绿色荧光，因此 48～72 h 后可直接在倒置荧光显微镜下观察两组细胞的转染情况。

1.2.2 流式细胞仪分选细胞及转染效率的检测　收集对数生长期的上述三组细胞，用含有 2% 血清的 PBS 重悬细胞，配成浓度为 1×10⁷ 个/mL 的细胞悬液；300 目筛网过滤重悬的细胞，移入流式专用管上流式机分选。将分选后的细胞进行扩大培养，传代至第 20 代时再次用流式细胞仪检测荧光表达率。

1.2.3 重组慢病毒 LV-HPV58E6E7 对 C33A 细胞生长及其周期的影响　（1）MTT 法检测三组细胞生长曲线的测定：分别收集细胞汇合度达 80%～90% 的 LV-HPV58E6E7/C33A、LV-NC/C33A 及 C33A 组细胞，制成单细胞悬液，按每孔 5×10³ 个细胞接种于 96 孔板，每孔总体积均为 200 μL，于 5% CO₂、37℃ 培养。细胞培养 24、48、72、96、120 h，每种细胞任选 5 个孔进行实验：每孔加入 MTT 溶液 20 μL（5 mg/mL），37℃ 孵育 4 h 后弃去上清加入 DMSO（二甲基亚砜）150 μL，充分混匀使甲臜充分溶解；用酶标仪测定各孔的 A490 吸光度值，记录结果。以时间为横轴，取 5 个相同生长天数及携带相同载体的光吸收值均值作为该类细胞的某天吸光值，并作为纵轴绘制细胞生长曲线。计算各组细胞的倍增时间：倍增时间=两倍原始细胞计数点（与吸光度相关）对应时间—初始细胞计数点对应时间。

（2）流式细胞仪检测三组细胞生长周期变化：分别收集细胞汇合度达 80%～90% 的 LV-HPV58-E6E7/C33A、LV-NC/C33A 及 C33A 组细胞，制成细胞密度为 1×10⁶ 个/mL 的细胞悬液，将 1 mL 细胞悬液缓慢加入至预冷的 4 mL 无水乙醇中，轻柔吹打后混匀后放于 4℃ 过夜。第二天将细胞混合液 2 000 r/min 离心 5 min 去除上清，用 PBS 洗涤细胞 2 次后加入 RNAse 100 μL 重悬细胞，于 37℃ 水浴 30 min。每管加入 400 μL 新配的碘化丙啶（propidium iodide，PI）液，于 4℃ 避光孵育 30 min 后筛网过滤，上流式细胞仪检测细胞周期。

1.2.4 稳定表达 HPV58E6E7 融合基因的荷瘤裸鼠模型的建立及鉴定　（1）建立裸鼠皮下成瘤模型：将 4～6 周、体重为 16～18 g 的 12 只雌性 BALB/C 裸鼠随机分成三组，每组 4 只。接种 C33A 细胞者为空白对照组，接种 LV-NC/C33A 细胞者为阴性对照组，接种 LV-HPV58E6E7/C33A 细胞者为实验组。分别取对数生长期的 LV-HPV58E6E7/C33A 组、LV-NC/C33A 组及 C33A 组细胞，制备单细胞悬液，调整细胞浓度为 1×10⁷ 个细胞/mL，于小鼠左腋下皮下接种 0.1 mL 细胞悬液，即 1×10⁶ 个细胞/只。

（2）观察裸鼠皮下成瘤情况：接种细胞后，定期观察裸鼠皮下成瘤情况并记录。待肿瘤生长一定天数时，腹腔注射 0.1 mL 3.5% 水合氯醛溶液麻醉裸鼠，将裸鼠固定后置于暗箱平台，利用动物活体成像系统拍摄裸鼠皮下肿瘤及荧光表达情况。

（3）检测裸鼠皮下肿瘤组织中 HPV58 型 E6E7 融合基因表达情况。

A. qRT-PCR 检测三组裸鼠皮下瘤组织中 HPV58E6E7 融合基因负载量：种瘤三周后，处死小鼠，手术分离出瘤组织，用 Trizol 法提取每组裸鼠皮下瘤组织的总 RNA，逆转录合成 cDNA，以各组细胞 cDNA 为模板，运用 HPV58 E6E7 融合基因、GAPDH 上下游引物进行荧光定量 PCR（real-time fluorescence quantitative PCR，qRT-PCR），检测各瘤组织中 HPV58E6E7 融合基因的含量。反应体系 20.0 μL：SYBR Premix Ex Taq II 10.0 μL；PCR Forward Primer（10 μmol/L）0.75 μL；PCR Forward Primer（10 μmol/L）0.75 μL；模板 1.0 μL；ddH₂O 7.5 μL。反应条件：94℃ 预变性 5 min；94℃ 变性 30 s、56℃ 退火 30 s、72℃ 延伸 30 s，共 30 个循环；72℃ 延伸 10 min。产物 4℃ 保存。

由 MX-3000P PCR 仪程序软件，直接得出两个标准品中三个样本 DNA 中 HPV58E6E7、GAPDH 的 Ct 值、扩增效率，然后根据倍比稀释的标准品的 Ct 值绘制出标准曲线，最后根据样本 DNA 的 Ct 值及标准曲线，计算出相对应的基因拷贝数。

B. Western blot 检测三组裸鼠皮下瘤组织中 HPV58E6E7+HIS 标签蛋白的表达：用 RIPA 法提取三组裸鼠皮下瘤组织总蛋白，并用 BCA 法测定三组蛋白浓度。将各组蛋白调整至同一浓度后，进行 SDS-PAGE 电泳（80 V 电压跑浓缩胶，整个过程 30～40 min，后转至 120 V 跑分离胶，总时间约 2 h），电转移至 PVDF 膜上（100 mA 转膜 1.5 h），5% 脱脂蛋白 TBST 封闭液室温振荡 2 h，与 1∶1 000 稀释的 6×鼠抗 His 抗体、1∶1 000 稀释的鼠抗β-actin 抗体，4℃ 孵育过夜；TBST 洗膜 3 次，然后与 1∶2 000 稀释的 HRP 标记的山羊抗小鼠 IgG 室温孵育 2 h，TBST 洗膜 3 次，ECL 显色检测目的蛋白。

1.2.5 统计学分析　实验数据采用 SPSS16.0 统计软件进行分析，计量数据以均数±标准差表示，不同处理组组间比较采用方差分析或 t 检验，组间多重比较采用 SNK 检验方法进行分析，P<0.05 为差异有统计学意义。

2. 结果

2.1. 流式细胞仪分选出的细胞及转染效率的检测

将病毒感染后的细胞扩大培养，并用流式细胞仪进行分选，如图 1 所示，右侧绿色区域为分选出的带强绿荧光的 C33A 细胞，分别命名为 LV-HPV58E6E7/C33A 组、LV-NC/C33A 组。经流式细胞仪分选出强绿色荧光信号的细胞，形态上与正常未经处理的 C33A 细胞没有明显差异：分选出的细胞均发出绿色荧光，荧光均匀分布于整个胞浆（如图 2 所示），扩大培养 20 代后细胞内荧光蛋白仍能稳定表达，表明 LV-HPV58E6E7 和 LV-CON 病毒能稳定且持久地整合在人宫颈癌 C33A 细胞基因组中。

图 1.

Efficiency of green fluorescent protein-based cell sorting by flow cytometry

流式细胞术分选绿色荧光细胞效率图

图 2.

Cell morphology of the 20th generation of cells after sorting observed by microscope

分选后培养第 20 代细胞显微镜下形态图

2.2. MTT 法测定三组细胞生长曲线

每组细胞每天任选 5 个孔测其吸光度值（A490）的平均值，共检测 5 d，以吸光度值为纵坐标，培养间隔时间为横坐标，绘制生长曲线，计算对数期生长细胞的倍增时间（如图 3 所示）。LV-HPV58E6E7/C33A 组、LV-NC/C33A 组及 C33A 组细胞的倍增时间分别为 48、72、96 h，结果表明：转染了 HPV58 E6E7 融合基因的宫颈癌 C33A 细胞倍增时间明显短于 LV-NC/C33A 组（P<0.05）及 C33A 组细胞（P<0.05），细胞增殖加快。

图 3.

Cell growth curves in the three groups detected by MTT

MTT 法检测三组细胞生长曲线图

2.3. 流式细胞术检测各组细胞周期的变化

将三组细胞按前述方案处理后上流式细胞仪检测，如图 4 结果显示：LV-NC/C33A 组及 C33A 组细胞周期的各期分布无明显差异（P>0.05）；而转染了 HPV58 型 E6E7 融合基因的 LV-HPV58E6E7/C33A 组细胞，如表 1 所示，其 DNA 合成前期 G1 期的细胞百分率均低于 LV-NC/C33A 组（P<0.05）及 C33A 组细胞（P<0.05），处于 DNA 合成后期 G2 期及 S 期细胞的百分率均高于 LV-NC/C33A 组（P<0.05）及 C33A 组细胞（P<0.05），提示 HPV58 型 E6E7 融合基因可能通过某种途径参与了细胞周期的调控，促进细胞分裂，从而促进 C33A 细胞的增殖。

图 4.

Cell cycle in the three groups detected by flow cytometry

流式细胞术检测三组细胞周期

表 1. Comparison of cell cycle among three groups (%).

三组细胞的细胞周期比较（%）

组别	G1 期	P 值	G2 期	P 值	S 期	P 值
※LV-NC/C33A 组与 C33A 组比较，P>0.05；*LV-HPV58E6E7/C33A 组与 C33A 组比较，P<0.05；#LV-HPV58E6E7/C33A 组与 LV-NC/C33A 组比较，P<0.05
C33A 组	54.09±2.83	0.99※	17.71±1.48	0.553※	27.18±2.22	0.588※
LV-NC/C33A 组	54.09±2.75	0.003#	16.59±3.18	0.031#	25.89±3.07	0.013#
LV-HPV58E6E7/C33A 组	42.16±1.63	0.006*	23.33±1.63	0.047*	34.51±2.01	0.021*

2.4. 成功建立裸鼠皮下成瘤模型

12 只 BALA/C 裸鼠在左腋下皮下接种各组细胞悬液（1×10⁶ 个细胞/只），3 周后可见所有裸鼠皮下瘤长径超过 1 cm。经活体成像仪成像显示：LV-NC/C33A 组、LV-HPV58E6E7/C33A 组活体裸鼠的皮下移植瘤中有绿色荧光表达，表明裸鼠体内瘤组织可持续、稳定表达绿色荧光蛋白（green fluore-scent protein，GFP），如图 5 所示。

图 5.

Subcutaneous tumor models of nude mice inoculated with C33A, LV-NC/C33A, and LV-HPV58E6E7/C33A cells

三组细胞构建裸鼠皮下成瘤模型

2.5. qRT-PCR 检测三组瘤组织中 HPV58 型 E6E7 融合基因的负载量

提取三组瘤组织总 RNA，逆转录成 cDNA 后，以 HPV58 型 E6E7 融合基因上下游引物、管家基因 GAPDH 上下游引物特异性扩增各组细胞中 HPV58E6E7 融合基因及 GAPDH 基因。qRT-PCR 检测结果显示：LV-NC/C33A 组及 C33A 组裸鼠瘤组织的病毒负载量均为 0；LV-HPV58E6E7/C33A 组裸鼠瘤组织病毒负载量均值为 0.65，证明带有 HPV58 型 E6E7 融合基因的 C33A 细胞能够在裸鼠体内稳定转录 HPV58E6E7 融合基因。

2.6. Western blot 验证三组瘤组织中 HIS 标签蛋白的负载量

提取三组瘤组织总蛋白，用鼠抗 His-tag 抗体及内参抗体鼠抗 β-actin 抗体作为一抗进行 Western blot 检测。结果如图 6 所示，在 LV-HPV58E6E7/C33A 组瘤组织的总蛋白中，在分子量约 64 kD 处的蛋白能与兔抗 His-tag 抗体特异性反应，免疫条带位置与 HPV58E6E7+His-tag 的融合蛋白（约为 64 kD，其中 HPV58E6E7 融合蛋白为 27 kD，His-tag 蛋白为 37 kD）理论分子量相符，而在对照组 LV-NC/C33A 及 C33A 组瘤组织的总蛋白中，未见上述条带。由此证明：LV-HPV58E6E7/C33A 组能够表达包含示踪标签的 HPV58E6E7+His-tag 融合蛋白，证明带有 HPV58 型 E6E7 融合基因的 C33A 细胞能够在裸鼠体内稳定翻译 HPV58E6E7+His-tag 融合蛋白。

图 6.

Detection of the expression of His-tag protein in tumor tissues in the three groups by Western blot

三组瘤组织中 His-tag 标签蛋白表达的 Western blot 鉴定

3. 讨论

虽然 HPV58 型是我国特别高发的高危型 HPV，特别是广西等南方地区，但由于全球 HPV58 型感染地理分布的差异极大，国内外对于 HPV58 型的研究不多。目前市场上仍无能稳定表达 HPV58 E6 或 E7 基因的人宫颈癌细胞系，难以评价 HPV58 型疫苗的免疫效果。课题组前期已成功构建了表达 HPV58E6E7 融合基因的慢病毒系统并通过 qRT-PCR 及 Western blot 检测实现其真核表达^[1]，本研究试图构建能稳定表达 HPV58 型 E6E7 融合基因的人宫颈癌细胞株，为后续 HPV58 型宫颈癌疫苗的研究提供靶抗原细胞。

C33A 细胞系是 HPV 检出阴性的人宫颈癌细胞株^[6]，其能够表达我国最为常见的限制型主要组织相容性复合体（major histocompatibility complex，MHC）Ⅰ类分子^[7]。我们将前期构建的表达 HPV58 型 E6E7 融合基因的慢病毒 LV-HPV58E6E7 及空载病毒 LV-CON 转染到 C33A 细胞，荧光显微镜下 LV-HPV58E6E7/C33A 融合基因组及 LV-NC/C33A 组均能观察到 GFP 的表达。通过流式细胞仪将转染有目的基因及空载基因的强绿色荧光细胞分选出来并扩大培养，扩大培养 20 代后 GFP 仍能稳定表达，表明 LV-HPV58E6E7 融合基因和 LV-CON 病毒载体稳定且持久地整合在人宫颈癌 C33A 细胞基因组中。

体外实验表明，细胞周期与细胞的增殖关系密切。而细胞周期的长短则取决于 G0/G1 期，G0/G1 期阻滞可使细胞增殖周期延长，增殖速度减慢^[8-9]。通过流式细胞仪检测分选好的 LV-HPV58E6E7/C33A 组、LV-NC/C33A 组、C33A 组细胞的周期变化，细胞生长曲线实验结果显示：LV-HPV58E6E7/C33A 组倍增时间明显快于 LV-NC/C33A 组（P<0.05）和C33A 组细胞（P<0.05）；流式细胞仪检测细胞周期显示转染 HPV58E6E7 融合基因组后，LV-HPV58E6E7/C33A 细胞处于 G1 期的细胞比例为 42.16%±1.63%，处于 S 期的细胞比例为 34.51%±2.01%，处于 G2 期的细胞比例为 23.33%±1.63%，G2 期和 S 期数据均高于 LV-NC/C33A 组（P<0.05）和 C33A 组细胞（P<0.05）。结果显示 HPV58 型 E6E7 融合基因能够促进细胞的增殖，同时能使 G1 期细胞减少以及 G2 期及 S 期细胞增加，表明 E6、E7 具有转化活性，能够促进肿瘤的发生、发展，可作为 HPV58 型疫苗研究的靶抗原。

为了建立能够稳定表达 HPV58E6E7 融合基因的动物模型，我们选择目前常用的、稳定的肿瘤实验动物 BALB/C 裸鼠，它的 8 号染色体上隐性基因突变，无胸腺，且其先天性 T 细胞免疫缺损，缺乏免疫应答性及无免疫排斥反应，另外，它能够短时间内成瘤，肿瘤能够良好地生长、持续增殖和长期传代，且肿瘤的形态与功能可与原人肿瘤保持一致性，是近年来研究恶性肿瘤基础资料的良好模型^[10]。慢病毒载体自身携带有抗生素抗性基因及 GFP 基因，课题组构建的 LV-HPV58E6E7/C33A 融合基因经流式分选后细胞均能表达绿色荧光并能够反复传代，在子代中稳定表达，因此可借助活体成像仪检测裸鼠皮下移植瘤中的基因表达及细胞活动情况。将 LV-HPV58E6E7/C33A 组、LV-NC/C33A 组、C33A 组细胞接种到裸鼠皮下，通过活体成像仪、qRT-PCR 和 Western blot 可检测各组瘤组织中 HPV58E6E7+His-tag 标签蛋白的表达情况。实验结果表明，LV-HPV58E6E7/C33A 组、LV-NC/C33A 组、C33A 组的成瘤率均为 100%，并且瘤体体积随时间的增加而逐渐增大。21 天后，所有裸鼠左腋窝区皮下结节大小约 1 cm，经活体成像仪成像，LV-HPV58E6E7/C33A 组、LV-NC/C33A 组裸鼠瘤组织可见荧光蛋白表达，而 C33A 组裸鼠则未见荧光蛋白。表明慢病毒自带 GFP 可在裸鼠体内稳定表达。采用 qRT-PCR 及 Western blot 检测各组瘤组织中 HPV58E6E7 基因及 HPV58E6E7+His-tag 标签蛋白的表达，结果显示 LV-NC/C33A、C33A 组裸鼠移植瘤组织均未检测到 HPV58E6E7 基因及 HPV58E6E7+His-tag 标签蛋白的表达，而 LV-HPV58E6E7/C33A 组裸鼠移植瘤组织中有 HPV58E6E7 基因及 HPV58E6E7+His-tag 标签蛋白的表达，且根据 qRT-PCR 数值比较发现其在裸鼠移植瘤中高度表达，表明该新建细胞模型已经稳定整合了 HPV58E6E7 融合基因，可在转录水平及蛋白水平上稳定表达。

总之，通过以上方法，我们成功建立了能内源性表达 HPV58 型 E6E7 融合基因的人宫颈癌 C33A 模型细胞，为 HPV58 型相关疫苗的免疫效果检测奠定了基础。

Funding Statement

国家自然科学基金项目（81260386）；广西自然科学基金项目（2013GXNSFAA019192）；2015年度广西壮族自治区高等学校专利资助项目（KY2015ZL021）；2016年广西医疗卫生适宜技术研究与开发项目（S201511）资助