心肌细胞氧化损伤对 myocardin 和 核因子 E2 相关因子 2 的影响

Abstract

With the oxidative damage model established in rat myocardial cells by hydrogen peroxide (H₂O₂), the expression of myocardin and nuclear factor erythroid 2-related factor 2 (Nrf2) during oxidative damage and effect of myocardin on Nrf2 were preliminarily explored. The expression of the target gene was increased or decreased by transfection of plasmid DNA or shRNA, respectively. Cell proliferation was detected by sulforhodamine B (SRB) assay. The expression of myocardin mRNA and Nrf2 mRNA was detected by Real-time PCR, and their protein levels were detected by Western blot. The results showed that oxidative damage was induced by H₂O₂ with an optimized incubation condition of 200 μmol/L H₂O₂ for 24 hours. H₂O₂ inhibited expression of myocardin in mRNA and protein levels, and increased expression of Nrf2 in mRNA and protein levels. The overexpression of myocardin or the knockdown of Nrf2 significantly decreased cell viability compared with the control group, while the knockdown of myocardin or the overexpression of Nrf2 significantly increased cell viability. The overexpression of myocardin significantly down-regulated the expression of Nrf2 in mRNA and protein levels, while the knockdown of myocardin dramatically up-regulated the expression of Nrf2. Thus, it is deduced that myocardin may inhibit cell proliferation and Nrf2 may promote cell proliferation. Oxidative damage induced by H₂O₂ in rat myocardial cell might activate Nrf2-related signaling pathway through down-regulation of myocardin.

引言

氧化应激时产生大量活性氧（reactive oxygen species，ROS）造成细胞损伤，而过氧化氢（H₂O₂）是体内氧化代谢的中间产物，同时又是一种活性氧，因此实验研究中常用 H₂O₂ 建立氧化损伤模型^[1]。ROS 能激活转录因子核因子 E2 相关因子 2（nuclear factor erythroid 2-related factor 2，Nrf2）-抗氧化反应元件（antioxidant response element，ARE）通路^[2]，转录调控下游抗氧化蛋白等产生生物学效应，从而发挥抗氧化损伤作用。myocardin 是最新发现的血清反应因子（serum response factor，SRF）协同转录因子，它与 SRF 结合成复合物，促进 SRF-CArG box（SRF-[CC（A/T）₆GG]）依赖的靶基因的表达，影响和控制心脏及平滑肌细胞的发育和分化。在氧化损伤过程中，二者对心肌细胞是否存在相互作用尚不清楚。本实验主要是为了明确 H₂O₂ 造成细胞氧化损伤过程中 myocardin 和 Nrf2 基因的表达变化以及它们对细胞增殖的影响，并初探 myocardin 对 Nrf2 的影响。

1. 资料与方法

1.1. 实验细胞

大鼠心肌 H9C2 细胞购自武汉博士德生物工程有限公司。

1.2. 主要试剂

DMEM 培养基（GIBCO 公司），胎牛血清（GIBCO 公司），Trizol 裂解液（Ambion 公司），RIPA 裂解液（碧云天生物技术公司），反转录试剂盒（TaKaRa 公司），SYBGR Green（TaKaRa 公司），30% H₂O₂（国药集团化学试剂有限公司），myocar-din、Nrf2 单克隆抗体、辣根过氧化物酶鼠抗及兔抗（上海起发实验试剂有限公司），1 μg/μL 聚乙烯亚胺（polyethyleneimine，PEI）（GE 公司），DAPI（武汉博士德生物工程有限公司）。

1.3. 主要质粒

pcDNA3.1 质粒、myocardin 质粒（即 pcDNA3.1-myocardin 质粒）、myocardin shRNA 质粒、Nrf2 shRNA 质粒、PTK642 质粒、PTK642-Nrf2 质粒，均由天津科技大学惠赠。

1.4. 主要仪器

日本 Astec 气套式二氧化碳恒温培养箱，Spec-traMax® i3x 多功能酶标仪，美国 SIM 凝胶成像系统，OLYMPUS 激光共聚焦显微镜，BioRad CFX96 定量 PCR 仪，BioRad ChemiDoc^TMXRS+化学发光成像系统。

1.5. 方法

1.5.1 细胞培养　大鼠心肌 H9C2 细胞加入 DMEM 完全培养基（含 10% 胎牛血清、100 U/mL 青霉素、100 mg/mL 链霉素）中，37℃、5% CO₂ 培养箱中培养。

1.5.2 细胞种板密度及用途　96 孔板种板细胞数约 1×10⁴/孔，主要用于磺酰罗丹明 B（sulforhoda-mine B，SRB）检测；24 孔板种板细胞数约 5×10⁴/孔，主要用于细胞爬片；6 孔板种板细胞数为 1×10⁵/孔～2×10⁵/孔，主要用于提取 RNA 及蛋白。

1.5.3 相关检测指标及实验方法　（1）PEI 转染法：细胞贴壁后所占总面积达到培养皿面积的 70%～90% 开始转染。用无血清 DMEM 培养基稀释目的 DNA，然后将 1 μg/μL PEI 转染液（PEI∶Total DNA=3∶1）加入稀释质粒中，立即旋涡振荡；室温静置 15 min 后将 DNA-PEI 混合液直接加入细胞培养基中，24～48 h 收获细胞提取 RNA 或者蛋白。

（2）SRB 比色法：细胞接种于 96 孔板进行分组处理后，弃上清，10% 三氯乙酸固定、0.4%（质量—体积百分浓度）SRB 染色、10 mmol/L Tris base（pH 10.5）振荡摇匀后在酶标仪测定 540 nm 波长处光吸收值，计算细胞生长抑制率及细胞活力。

（3）Real-time PCR 检测目的基因 mRNA 的表达：用 GeneTool 软件设计 myocardin、Nrf2 和内参基因 GAPDH 的 PCR 引物（引物序列及产物长度见表 1）。细胞接种于 6 孔板进行分组处理后，利用 Trizol 试剂提取细胞总 RNA，按 Takara 反转录试剂盒操作步骤合成 cDNA，然后于 CFX96 Real-timeSystem 检测目的基因 mRNA 的表达。

表 1. Primers of Real-time PCR.

Real-time PCR 相关引物

引物名称	引物序列	扩增长度
Nrf2-F	GCCTTCCTCTGCTGCCATTA	139 bp
Nrf2-R	TGCCGGAGTCAGAGTCATTG
GAPDH-F	GCCAAAAGGGTCATCATCTCC	174 bp
GAPDH-R	GCCCTTCCACGATGCCA
myocardin-F	CCGGGGCTTGCCAGTGTC	126 bp
myocardin-R	GGGCGTGACAGGAAAGGTGAC

（4）Western blot 检测目的基因蛋白的表达：细胞接种于 6 孔板进行分组处理后，每孔加入 100 μL RIPA 裂解液及 1 μL Cocktail 蛋白酶抑制剂，冰上裂解 30 min，4℃、14 000 r/min 离心 20 min，收集上清液；加入蛋白上样 Buffer，100℃ 煮沸 5～10 min；聚丙烯酰胺凝胶电泳（polyacrlamide gel electrophoresis, PAGE），然后将 PAGE 分离的蛋白质样品转移到硝酸纤维素薄膜，5% 脱脂奶粉 37℃ 封闭 90 min，孵育一抗（37℃ 孵育 1.5 h 或者 4℃ 孵育过夜）；1×TBST 洗涤三次，每次 5 min；孵育二抗（37℃ 1 h）；再用 1×TBST 洗涤三次，每次 5 min；显影。

（5）DAPI 染色法：在 24 孔板中放入灭菌细胞爬片，细胞培养并分组处理完毕后弃去培养基；加入适量 DAPI 工作液（约 80 μL/孔）覆盖细胞即可，室温避光染色 15～30 min；弃去染色液，1×PBS 洗涤细胞，水平摇床上室温慢摇 5 min×3 次；取出细胞爬片倒置于载玻片上；于 OLYMPUS 激光共聚焦显微镜下（100×）观察对比每个视野下各组细胞数及细胞核形态变化，并拍照分析。

1.5.4 实验步骤　（1）细胞贴壁后分组处理：① 对照组（H9C2 组）：弃原培养基，更换完全培养基培养 24 h；② H₂O₂ 组：弃原培养基，加入不同浓度 H₂O₂ 的完全培养基孵育 24 h。分组进行 SRB 检测，计算细胞生长抑制率，确定 H₂O₂ 最佳孵育浓度。进行 DAPI 染色，显微镜下观察细胞数及细胞核形态变化，进一步了解细胞损伤情况。

（2）按转染不同目的基因质粒分两大组：① 上调目的基因组：对照组转染空载体（pcDNA3.1 或 PTK642）质粒，实验组转染目的基因（pcDNA3.1-myocardin 或 PTK642-Nrf2）质粒；② 下调目的基因组：对照组转染 shRNA 空载体质粒，实验组转染目的基因-shRNA 质粒（myocardin shRNA 质粒或 Nrf2 shRNA 质粒）。

（3）通过 SRB 检测相对活细胞数，了解myo-cardin 及 Nrf2 基因对细胞增殖的影响。

（4）通过 Real-time PCR 检测各组细胞 myo-cardin 及 Nrf2 mRNA 的表达差异。

（5）通过 Western blot 检测各组细胞 myo-cardin 及 Nrf2 蛋白的表达差异。

1.6. 统计学处理

用 SPSS20.0 软件进行数据处理，计量资料以均数±标准差表示，组间比较均采用 t 检验，P<0.05 为差异有统计学意义。

2. 结果

2.1. 确定 H₂O₂ 氧化损伤最佳孵育浓度

2.1.1 不同浓度 H₂O₂ 氧化损伤　大鼠心肌 H9C2 细胞分别加入不同浓度 H₂O₂ 孵育 24 h，SRB 检测后计算细胞活力，结果提示 200 μmol/L H₂O₂ 孵育时细胞存活率与对照组比较差异有统计学意义（P<0.05）（见图 1），故选择 200 μmol/L 为 H₂O₂ 氧化损伤最佳孵育浓度。

图 1.

Oxidation damage induced by a H₂O₂ concentration-gradient

H₂O₂ 浓度梯度氧化损伤

^*P<0.05,^**P<0.01，vs. 0 μmol/L H₂O₂ group

以 0 μmol/L 组作为对照组，^*P<0.05，^**P<0.01

2.1.2 镜下观察 H₂O₂ 对细胞造成的损伤及生长抑制　大鼠心肌 H9C2 细胞分组处理完毕后进行 DAPI 染色，结果提示每个视野下 H₂O₂ 组细胞数较 H9C2 组明显减少；H₂O₂ 对细胞造成明显损伤及生长抑制（见图 2、表 2）。

图 2.

Morphology of cells (by OLYMPUS laser confocal microscopy, 100×)

两组细胞形态（OLYMPUS 激光共聚焦显微镜下，100×）

表 2. Cell number, and morphological classification and quantification of nucleus.

两组细胞中细胞数及细胞核形态分类计数

组别	核肿大	核碎裂	核浓缩	细胞个数/视野
**两组间比较，P<0.01
H9C2 组	19（16.24%）	0	7（5.98%）	117
H2O2 组	26（45.61%）**	5（8.77%）**	15（26.32）**	57

2.2. H₂O₂ 对 H9C2 细胞中 myocardin 和 Nrf2 基因的影响

2.2.1 H₂O₂ 对 myocardin mRNA 和 Nrf2 mRNA 的影响　H₂O₂ 组 myocardin mRNA 表达较对照组下调 58.86%，而 Nrf2 mRNA 上调到对照组的 2.27 倍（见图 3）。

图 3.

Effect of H₂O₂ on the expression of myocardin mRNA and Nrf2 mRNA

H₂O₂ 对 myocardin mRNA 和 Nrf2 mRNA 表达的影响

^**P<0.01

^**P<0.01

2.2.2 H₂O₂ 对 myocardin 蛋白和 Nrf2 蛋白的影响　H₂O₂ 可下调 H9C2 细胞中 myocardin 蛋白表达，以及上调 Nrf2 蛋白表达（见图 4）。

图 4.

Differential expression of myocardin and Nrf2 between two groups

两组细胞 myocardin 蛋白和 Nrf2 蛋白的表达差异

2.3. myocardin 及 Nrf2 对细胞增殖的影响

过表达 myocardin 基因和下调 Nrf2 基因表达可抑制细胞增殖，而下调 myocardin 基因表达和上调 Nrf2 基因表达可促进细胞增殖（见图 5、6、7），实验证明 myocardin 基因和 Nrf2 基因对细胞增殖的影响呈现相反的作用。

图 5.

Effect of myocardin overexpression on cell viability

过表达 myocardin 基因对细胞活力的影响

^**P<0.01

^**P<0.01

图 6.

Effect of Nrf2 on cell viability

Nrf2 对细胞活力的影响

^**P<0.01

^**P<0.01

图 7.

Effect of down-regulation of myocardin and Nrf2 on cell viability

下调 myocardin 及 Nrf2 基因表达对细胞活力的影响

^*P<0.05, vs. shRNA group;^**P<0.01, myocardin shRNA group vs. Nrf2 group

与 shRNA 对照组比较，^*P<0.05；myocardin shRNA 组与 Nrf2 组比较，^**P<0.01

2.4. 调控 myocardin 基因表达对 Nrf2 基因的影响

2.4.1 上调 myocardin 基因表达对 Nrf2 基因的影响（见图 8、9）　实验组转染 myocardin 质粒后检测到 myocardin mRNA 上调到对照组的 26.27 倍，提示成功转染 myocardin 基因；而过表达 myo-cardin 后检测到 Nrf2 表达（mRNA 及蛋白）下调。

图 8.

Expression of myocardin mRNA and Nrf2 mRNA in cells that transfected with pcDNA3-1-myocardin expression plasmid

转染 myocardin 质粒后检测 myocardin mRNA 和 Nrf2 mRNA 的表达

^**P<0.01

^**P<0.01

图 9.

Expression of myocardin and Nrf2 in cells that transfected with pcDNA3.1-myocardin expression plasmid

转染 pcDNA3.1-myocardin 质粒后检测 myocardin 和 Nrf2 蛋白的表达

2.4.2 下调 myocardin 基因表达对 Nrf2 基因的影响（见图 10、11）　实验组转染 myocardin shRNA 质粒后 myocardin 基因表达明显下调，检测到 Nrf2 基因表达（mRNA 及蛋白）较对照组明显上调，即下调 myocardin 基因表达可导致 Nrf2 mRNA 及蛋白表达上调。

图 10.

Expression of myocardin mRNA and Nrf2 mRNA in cells that transfected with myocardin shRNA plasmid

转染 myocardin shRNA 质粒后检测 myocardin mRNA 和 Nrf2 mRNA 的表达

^**P<0.01

^**P<0.01

图 11.

Expression of myocardin and Nrf2 in cells that transfected with myocardin shRNA plasmid

转染 myocardin shRNA 质粒后检测 myocardin 和 Nrf2 蛋白的表达

3. 讨论

正常生物体内的氧化代谢会产生少量的 ROS，ROS 低浓度时在正常的细胞代谢和信号转导中具有重要作用，体内抗氧化系统能及时清除多余的氧自由基以维持机体代谢平衡，而高浓度的 ROS 会引起细胞损伤。文献报道，过量的 ROS 介导产生的氧化应激是导致心肌缺血再灌注损伤发生的主要机制^[3]。因此，本研究应用 H₂O₂ 和大鼠心肌细胞建立氧化损伤模型。

myocardin 特异地在心脏和平滑肌细胞内广泛表达^[4]，影响心脏及平滑肌细胞的发育和分化^[5]。在最近的研究工作中，我们首次发现 myocardin 可以保护心肌细胞使其避免由十字胞碱引起的凋亡，这一发现提示 myocardin 在成年心肌细胞中可能具有保护功能。氧化损伤过程中亦伴随着细胞凋亡的发生，而 myocardin 是否能在心肌细胞氧化-抗氧化损伤过程中发挥保护作用尚不清楚。

生物进化过程中，机体形成了一套复杂的对抗氧化应激反应的反馈应答系统^[6]。当反复暴露于活性氧自由基时，机体自身能通过 Kelch 样环氧氯丙烷相关蛋白-1(kelch-like ech-associated protein-1, Keap1)-Nrf2-ARE 通路诱导产生一系列保护性蛋白，以缓解活性氧自由基对细胞造成的损害^[7]。

本实验研究表明：200 μmol/L H₂O₂ 孵育 24 h 能导致大鼠心肌 H9C2 细胞出现氧化损伤，细胞增殖受到抑制，氧化损伤过程中反馈激活了内源性 Nrf2 主导的抗氧化损伤信号系统，同时发现 myo-cardin 的表达明显下调。进一步实验结果提示上调 myocardin 基因和下调 Nrf2 基因表达可抑制细胞增殖，下调 myocardin 基因表达和上调 Nrf2 基因表达可促进细胞增殖；且上调 myocardin 基因表达时检测到 Nrf2 表达下调，而下调 myocardin 基因表达时检测到 Nrf2 表达上调。由此推测心肌细胞遭受氧化损伤时可能通过上调 Nrf2 基因表达发挥抗氧化损伤作用；同时通过上调 Nrf2 基因表达及下调 myocardin 基因表达促进细胞增殖；而 Nrf2 基因表达上调可能是通过下调 myocardin 基因表达实现的。

myocardin 基因在影响细胞增殖和氧化-抗氧化损伤过程中的表现与抗氧化基因 Nrf2 的表现完全相反，其作用机制尚不明确。二者之间是否存在直接或者间接的转录调控作用？H₂O₂ 导致心肌氧化损伤时反馈激活了 Nrf2 主导的抗氧化损伤信号系统是否是通过下调 myocardin 基因而实现的？这些作用机制都需要进一步研究明确，以便更好地寻求抗氧化损伤的生物学治疗靶点。

Funding Statement

国家自然科学基金资助项目（31471282）