牛溶菌肽线性衍生物 Bac2a 的生物特性及其稳定性研究

Abstract

The objective of the study is to analyze the biological characteristics and stability of the linear derivative Bac2a from bactenecin, compared with the control peptide melittin. The secondary structure, antibacterial activity, hemolytic activity, cell toxicity and stability of the Bac2a were determined by circular dichroism spectroscopy, broth micro-dilution method and MTT assay. The results showed that Bac2a was a nonregular curl in aqueous solution, however, it was an α-helix structure in the hydrophobic environment. The minimal inhibitory concentration (MIC) of Bac2a ranged from 2 to 32 μmol/L, so the bacteriostatic activity of Bac2a was strong. The hemolytic rate was only 14.81% when the concentration of Bac2a was 64 μmol/L, which showed that the hemolytic rate of Bac2a was low. The therapy index of Bac2a was 3.26, and the cytotoxicity was relatively low, thus the cell selectivity was relatively high. In addition, with the heating treatment of 100℃ for 1 h, Bac2a still possessed rather a high antibacterial activity and showed a good heating stability. In a word, Bac2a has good application prospects in food, medicine and other fields, and is expected as a substitute for traditional antibiotics.

引言

近年来，由于抗生素的大量使用导致耐药菌株不断出现以及药物残留问题日益凸显，严重威胁着人类的健康，尤其是“超级细菌”的出现，给人们的生命安全和经济带来巨大损失，因此迫切需要寻找一种新型安全的抗菌药物。抗菌肽（antimicrobial peptides，AMPs）的出现有可能使这一局面得到改观^[1]。抗菌肽又称抗微生物肽，广泛存在于包括原核生物到人类的各个有机体中，是生物体天然免疫防御系统的重要组成部分。抗菌肽的氨基酸残基数目一般为 12～50 个，C-末端一般富含非极性氨基酸，如丙氨酸、缬氨酸和色氨酸，N-末端常富含阳离子氨基酸，如赖氨酸、精氨酸和组氨酸等^[2]；抗菌肽一般带有正电荷，等电点大于 7，相对分子量一般小于 10 kD。抗菌肽作用范围广，对细菌、真菌、病毒、肿瘤细胞、原生动物均有很好的抑制或杀灭作用。抗菌肽还具有抗生素无法比拟的优点，不仅对正常细胞无毒性，而且不会使细菌产生抗药性，这使得抗菌肽具有广阔的发展空间。

牛溶菌肽是从牛中性粒细胞的大颗粒中提取的，是自然界存在的分子量最小的天然阳离子抗菌肽，其对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌均具有较好的抗菌活性，已成为近年来研究较多的抗菌肽之一^[3]。牛溶菌肽由 12 个氨基酸组成，包括 4 个精氨酸残基、2 个半胱氨酸残基和 6 个疏水残基，序列为 RLCRIVVIRVCR。2 个半胱氨酸残基形成的二硫键使牛溶菌肽成为一个环状结构。通过改建，可以使牛溶菌肽线性化，形成各种衍生物^[4]。Bac2a 是通过用疏水性氨基酸丙氨酸替代半胱氨酸得到的一种线性衍生物，序列为 RLARIVVIRVAR。这种改变破坏了原肽的环形结构，但是增加了疏水性氨基酸含量^[5]。近年来研究表明，Bac2a 具有比牛溶菌肽更高的抗菌活性，但是 Bac2a 对细胞的毒性及其稳定性尚不清楚。蜂毒素是意大利蜜蜂蜂毒素的主要成分之一，占蜂毒干重的 50%，具有较强的抑菌活性，但蜂毒素具有较高溶血性和细胞毒性的副作用限制了其使用，其多用作抗氧化肽的对照肽^[6]。本研究以化学合成的 Bac2a 为研究对象，以蜂毒素为对照肽，对 Bac2a 的抑菌性、安全性和稳定性进行了较全面的研究，为 Bac2a 成为抗生素替代品提供理论依据。

1. 材料与方法

1.1. 材料

抗菌肽 Bac2a 和蜂毒素均由上海吉尔（GL）生化有限公司采用固相化学合成法合成，纯度达 95% 以上。用无菌蒸馏水溶解，使浓度为 2.56 mmol/L，—20℃ 下保存备用。实验所用菌株包括大肠杆菌（Escherichia coli ATCC 25922）、大肠杆菌（Esche-richia coli UB1005）、金黄色葡萄球菌（Staphy-lococcus aureus ATCC 29213）、金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus ATCC 25923）、表皮葡萄球菌（Staphylococcus epidermidis ATCC 12228）、单增李斯特菌（Listeriamonocytogenes CMCC 54004）、鼠伤寒沙门菌（Salmonella Typhimurium C77-31）、鼠伤寒沙门菌（Salmonella Typhimurium ATCC-14028）、鸡白痢沙门菌（Salmonella Typhimurium C79-13）和沙门菌（Salmonella entericasubspenterica CMCC 50071），均为中国农业科学院哈尔滨兽医研究所保存。实验所用人肾上皮 293 细胞由中国农业科学院哈尔滨兽医研究所保存。琼脂培养基（Mueller-Hinton Agar，MHA）、肉汤培养基（Mueller-Hinton Broth，MHB）购于北京奥博星生物技术有限责任公司，Triton X-100、胃蛋白酶、木瓜蛋白酶、胰蛋白酶、蛋白酶 K 购于 Sigma 公司，噻唑蓝（thiazolyl blue，MTT）、磷酸盐缓冲（pho-sphate buffer saline，PBS）、三氟乙醇（trifluoroe-thanol，TFE）、十二烷基硫酸钠（sodium dodecyl sulfate，SDS）、二甲基亚砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）等购于 Biosharp 公司。

1.2. 设备

HVE-50 高压蒸汽灭菌锅（日本），VD-1320 型超净工作台（北京东联哈尔仪器制造有限公司），RS-232C 酶标仪（日本），721 型可见分光光度计（上海元析仪器有限公司），摇床震荡培养箱 ZHWY-211D（上海智城分析仪器制造有限公司），电热恒温水浴锅 XMTD-4000（北京市永元明医疗仪器厂）。

1.3. 方法

1.3.1 抗菌肽的分子特性　在 http://web.expasy. org/compute_pi/网站预测 Bac2a 和蜂毒素的理论分子量、净电荷、等电点；在 http://heliquest.ipmc. cnrs.fr/网站预测 Bac2a 和蜂毒素的疏水性和疏水力矩。

1.3.2 Bac2a 和蜂毒素的二级结构的测定　Bac2a 和蜂毒素的二级结构采用圆二色谱法进行测定^[7]。具体测定方法是将 Bac2a 分别溶解在 10 mmol/L 磷酸盐缓冲溶液、50% 的 TFE、30 mmol/L SDS 溶液中，模拟水环境、生物膜的疏水环境、带负电荷的原核细胞膜环境，使其终浓度为 60 μmol/L。25℃ 时，用圆二色谱仪对样品溶液进行测定，圆二色谱仪石英样品池的光程为 0.10 cm，扫描测定范围为 190～250 nm，分辨率 0.50 nm，带宽 1.00 nm，扫描速度为 10 nm/min。对照肽蜂毒素的二级结构的测定方法同 Bac2a。

1.3.3 菌种的培养　将冻存于—20℃ 的待测菌活化两代后，划线接种于琼脂培养基中，37℃ 培养 18～20 h，挑取单菌落，接种于 20 mL 无菌肉汤培养基中，过夜培养后，按 2% 接种量接种于 10 mL 新鲜肉汤培养基中，培养 2～4 h，至菌体处于对数生长期。调整菌体浓度为 1×10⁵ CFU/mL，备用。

1.3.4 抑菌活性的测定　抗菌肽抑菌活性的测定采用微量稀释法^[8]。在 96 孔板的前 10 个孔中，用多肽稀释液将 Bac2a 分别稀释为 256、128、64、32、16、8、4、2、1、0.50 μmol/L 的溶液，每孔再加入 50 μL 菌液。第 11 孔加入 50 μL 多肽稀释液和 50 μL 菌液，作为阳性对照组。第 12 孔加入 50 μL 多肽稀释液和 50 μL MHB 肉汤培养基，作为阴性对照组。加样后放于 37℃ 培养箱中培养 18～24 h，观察各孔细菌生长情况。无肉眼可见细菌生长的最低浓度即为该肽的最小抑菌浓度（minimal inhibitory concentration，MIC）。Bac2a 对 10 种菌的 MIC 的平均数，为几何平均数（geometric mean，GM）。每个浓度重复三次。对照肽蜂毒素的抑菌活性的测定方法同 Bac2a。

1.3.5 溶血活性的测定　抗菌肽的溶血活性测定，参考 Li 等^[9]方法。采集 1 mL 的人新鲜血液，1 000×g 离心 10 min 后，收集红细胞，然后用磷酸盐缓冲溶液洗涤三次，再用 10 mL 磷酸盐缓冲溶液重悬细胞。在 96 孔板的前 10 个孔中，用磷酸盐缓冲溶液将 Bac2a 分别稀释为 1.3.4 节所述 10 个浓度，每孔再加入 50 μL 红细胞悬液。11 号孔为阳性对照，加入 50 μL 红细胞悬液和 50 μL 0.01% Triton X-100；12 号孔为阴性对照，加入 50 μL 红细胞悬液和 50 μL 磷酸盐缓冲溶液。37℃ 培养 1 h 取出，4℃，1 000×g 条件下离心 10 min，再将上清液转移到干净的 96 孔板对应的孔中，用酶标仪于 570 nm 处测定吸光值。每个浓度重复三次。计算公式如下：

其中，A 为抗菌肽样品处理组的吸光值；A_t 为阳性对照组的吸光值；A₀ 为阴性对照组的吸光值。

溶血率达到 5.00% 时的浓度为最小溶血浓度（minimum hemolysis concentration，MHC），MHC 对 MIC 的比值为治疗指数（therapeutic index，TI）。对照肽蜂毒素的溶血活性的测定方法同 Bac2a。

1.3.6 细胞毒性的测定　抗菌肽的细胞毒性的测定采用 MTT 法^[10]。将保存于液氮中的人肾上皮 293 细胞复苏，在 DMEM 培养液中培养传代。将生长到对数期的细胞制备成单细胞悬液，备用。按照上述 1.3.4 节方法稀释肽。在 96 孔板的 1～10 号孔内加入 50 μL 制备好的单细胞悬液和稀释好的 Bac2a，细胞浓度大约是 1×10⁴个/孔。11 号孔为阳性对照，只加单细胞悬液不加 Bac2a；12 号孔为阴性对照，既不加单细胞悬液也不加 Bac2a。培养 24 h 后，每孔中加入 40 μL MTT 溶液，继续培养 4 h。然后加入 150 μL DMSO 溶液，低速振荡 10 min，用酶标仪在 492 nm 处测定吸光度值。每个浓度重复三次。计算公式如下：

对照肽蜂毒素细胞毒性的测定方同 Bac2a。

1.3.7 稳定性的测定　本试验主要研究了盐离子、温度、蛋白酶对抗菌肽抑菌作用的影响。以大肠杆菌（ATCC 25922）为实验菌株，具体步骤如下：① 配制含不同浓度的 Na⁺ 和 Mg²⁺ 的 MHB 培养基，使 Na⁺、Mg²⁺ 的终浓度分别为 50、100、150 mmol/L 和 0.5、1.0、2.0 mmol/L，待完全溶解后，测定抗菌肽的 MIC，未经盐离子处理的 Bac2a 对大肠杆菌（ATCC 25922）的 MIC 为对照组；② 将抗菌肽配制成 2.56 mmol/L，100℃ 加热 1 h 后，按照上述 1.3.4 节方法将抗菌肽稀释成不同浓度，测定抗菌肽的 MIC，未经热处理的 Bac2a 对大肠杆菌（ATCC 25922）的 MIC 为对照组；③ 在 37℃ 水浴条件下，用反应终浓度为 1 mg/mL 的胃蛋白酶、胰蛋白酶、木瓜蛋白酶、蛋白酶 K 溶液分别处理抗菌肽 1 h，测定抗菌肽的 MIC，未经四种蛋白酶处理的 Bac2a 对大肠杆菌（ATCC 25922）的 MIC 为对照组。对照肽蜂毒素稳定性的测定方法同 Bac2a。

2. 结果

2.1. 抗菌肽的分子特性

Bac2a 和蜂毒素的分子特性如表 1 所示，合成肽的实际分子量与理论分子量很接近，表明合成肽是所需要的目标肽。

表 1. Characterizations of Bac2a peptide and melittin.

Bac2a 抗菌肽和蜂毒素的分子特性

肽	氨基酸序列	理论分子量 Mw/D	实际分子量	净电荷	疏水性	疏水力矩	等电点
Bac2a	RLARIVVIRVAR-NH2	1 421.80	1 420.83	+4	0.462	0.255	12.48
蜂毒素	GIGAVLKVLTTGLPALISWIKRKRQQ-NH2	2 847.49	2 847.51	+5	0.511	0.394	12.02

2.2. Bac2a 和蜂毒素的二级结构

Bac2a 和蜂毒素在 10 mmol/L 磷酸盐缓冲溶液、50% TFE、30 mmol/L SDS 溶液中的二级结构见图 1。由图 1 可见，在磷酸盐缓冲溶液中，在波长为 200 nm 处附近，Bac2a 和蜂毒素出现负的特征性峰；在 TFE 溶液中，在波长为 192 nm 处，两条肽出现一个正的特征峰，而在 208 nm 和 220 nm 波长附近，两条肽都有明显的负峰；在 SDS 溶液中，Bac2a 在波长为 195～198 nm 处有一强的正峰，而在波长为 217～218 nm 处有一负峰，蜂毒素在 SDS 溶液中出现负峰。

图 1.

CD spectra of Bac2a and melittin in 10 mmol·L^–1 sodium phosphate buffer, 50% TFE, and 30 mmol·L^–1 SDS

Bac2a 和蜂毒素在 10 mmol·L^–1磷酸盐缓冲液、50% TFE 和 30 mmol·L^–1 SDS 溶液中的圆二色谱图

2.3. 抑菌活性

Bac2a 和蜂毒素对革兰阴性菌和革兰阳性菌的 MIC 见表 2。由表 2 可见，Bac2a 的 MIC 范围为 2～32 μmol/L ，其对大肠杆菌（ATCC 25922）的抑菌性最强，MIC 为 2 μmol/L，而对鼠伤寒沙门菌（C77-31）的抑菌性最弱，MIC 为 32 μmol/L；GM 为 9.80 μmol/L。蜂毒素的 MIC 范围为 1～8 μmol/L，其对大肠杆菌（ATCC 25922）的抑菌性最强，MIC 为 1 μmol/L，对鼠伤寒沙门菌（C77-31）和鸡白痢沙门菌（C79-13）的抑菌性最弱，MIC 为 8 μmol/L；GM 为 3.20 μmol/L。

表 2. Bacteriostatic activities of Bac2a peptide and melittin.

Ba2a 抗菌肽及蜂毒素的抑菌活性

指标	Bac2a	蜂毒素
MIC/（μmol·L–1）
革兰阴性菌
大肠杆菌 ATCC 25922	2	1
大肠杆菌 UB1005	4	2
鼠伤寒沙门菌 C77-31	32	8
鼠伤寒沙门菌 ATCC 14028	16	2
鸡白痢沙门菌 C79-13	8	8
沙门氏菌 CMCC 50071	8	2
革兰阳性菌
金黄色葡萄球菌 ATCC 29213	8	2
金黄色葡萄球菌 ATCC 25923	8	4
表皮葡萄球菌 ATCC 12228	8	2
单增李斯特菌 CMCC 54004	4	1
MHC/（μmol·L–1）	32.00	0.25
GM/（μmol·L–1）	9.80	3.20
TI	3.26	0.08

2.4. 溶血活性

Bac2a 和蜂毒素对人正常红细胞的损伤作用见图 2。由图 2 可见，Bac2a 的浓度在 1～32 μmol/L 内，溶血率非常低（<5%），当其浓度达到 64 μmol/L 时，其溶血率也仅为 14.81%，MHC 和 TI 值分别为 32.00 μmol/L 和 3.26（见表 2）。但蜂毒素的最低溶血率为 9.49%，随着浓度的增加，溶血率急剧上升，当浓度为 4 μmol/L 时就达到了 100%，MHC 和 TI 值分别为 0.25 μmol/L 和 0.08（见表 2）。

图 2.

Hemolytic activities of Bac2a and melittin

Bac2a 和蜂毒素的溶血活性

2.5. 细胞毒性

Bac2a 和蜂毒素对人肾上皮 293 细胞存活率的影响见图 3。由图 3 可见，Bac2a 的浓度在 1～ 64 μmol/L 之间时，细胞的存活率在 97.00% 以上，其细胞毒性小。而蜂毒素表现出很强的细胞毒性，在浓度达到 4 μmol/L 时，细胞存活率只有 41.95%，当蜂毒素浓度达到 16 μmol/L 时，细胞的存活率接近零。

图 3.

Cytotoxicities of Bac2a and melittin

Bac2a 和蜂毒素的细胞毒性

2.6. 稳定性

2.6.1 盐离子稳定性　Na⁺ 离子和 Mg²⁺ 离子对 Bac2a 和蜂毒素稳定性的影响见表 3，当 NaCl 溶液的浓度为 50、100、150 mmol/L 时，Bac2a 的 MIC 分别为 8、16、32 μmol/L，均大于未处理的 2 μmol/L；当 MgCl₂ 溶液的浓度为 0.50、1、2 mmol/L 时，Bac2a 的 MIC 分别为 2、4、8 μmol/L。但蜂毒素的 MIC 不受阳离子影响，盐溶液稳定性高。

表 3. MICs (μmol·L^–1) of Bac2a and melittin in the presence of salts .

盐溶液处理后 Bac2a 和蜂毒素的 MIC（μmol·L^–1）

抗菌肽	NaCl/(mmol·L–1)				MgCl2/(mmol·L–1)			对照组
	50	100	150		0.5	1.0	2.0
Bac2a	8	16	32		2	4	8	2
蜂毒素	1	1	1		1	1	1	1

2.6.2 热稳定性　温度对 Bac2a 和蜂毒素稳定性的影响见表 4，由表 4 可知，100℃ 处理 1 h 时，抗菌肽 Bac2a 对菌株的 MIC 仍为 2 μmol/L，不受温度影响。蜂毒素的热稳定性也很高。

表 4. MICs (μmol·L^–1) of Bac2a and melittin in the presence of heat .

热处理后 Bac2a 和蜂毒素的 MIC（μmol·L^–1）

抗菌肽	实验组	对照组
Bac2a	2	2
蜂毒素	1	1

2.6.3 酶稳定性　不同蛋白酶对 Bac2a 和蜂毒素稳定性的影响见表 5。由表 5 可见，Bac2a 经 4 种蛋白酶处理之后，MIC 发生了改变。经木瓜蛋白酶处理后，MIC 为 16 μmol/L，与对照组 2 μmol/L 相比，抑菌性大大降低。Bac2a 经胃蛋白酶、胰蛋白酶、蛋白酶 K 处理后，MIC 均>64 μmol/L，几乎丧失抑菌能力。蜂毒素抗蛋白酶 K 和胃蛋白酶酶解的能力较弱，经处理后，与对照组相比，抑菌活性几乎丧失，抗胰蛋白酶和木瓜蛋白酶酶解的能力较强，抑菌活性没有发生改变。

表 5. MICs (μmol·L^–1) of Bac2a and melittin in the presence of protease .

蛋白酶溶液处理后 Bac2a 和蜂毒素的 MIC（μmol·L^–1）

抗菌肽	胃蛋白酶	胰蛋白酶	木瓜蛋白酶	蛋白酶 K	对照组
Bac2a	>64	>64	16	>64	2
蜂毒素	32	1	1	>64	1

3. 讨论

研究表明，抗菌肽的二级结构，以 α-螺旋结构为最多，β-折叠结构次之，无序结构及环状结构最少^[11-12]。本试验中，Bac2a 和蜂毒素在磷酸盐缓冲溶液中，在波长 200 nm 附近出现一个负的特征性峰，这是蛋白质和多肽无规则卷曲结构的典型图谱特征^[13]，说明这两条肽在水溶液中呈无规则卷曲的二级结构；当在 50% 的 TFE 溶液中，Bac2a 和蜂毒素在 192 nm 附近出现一个正的特征峰，而在 208 nm 和 220 nm 波长附近都出现明显的负峰，说明这两条肽在疏水溶液中呈 α-螺旋型结构^[14]。当在 30 mmol/L SDS 溶液中，Bac2a 在 195～198 nm 处有一强的正峰，而在 217～218 nm 处有一负峰，这是 β-折叠构象的典型图谱特征^[15]，说明 SDS 溶液诱导 Bac2a 显现 β-折叠的二级结构，这一结构的改变能让疏水的 C-末端更容易插入细胞膜的脂质双分子层^[16]。而蜂毒素在 SDS 溶液中与在 50% 的 TFE 溶液中峰型特征相似，是典型的 α-螺旋结构。

丁永林^[3]和 Wu 等^[5]的研究表明，牛溶菌肽对革兰阳性菌和革兰阴性菌的 MIC 较高（MIC 在 6～128 μmol/L 之间），抑菌效果不好。本试验结果表明，牛溶菌肽的线性衍生物 Bac2a 的抑菌活性较高（MIC 在 2～32 μmol/L 之间），这说明将半胱氨酸替代成丙氨酸，虽然破坏了环形结构但是增加了其疏水性氨基酸含量，这对增强抑菌性有一定效果。随着肽浓度的增加，Bac2a 的溶血率呈上升趋势，其对红细胞的溶血率呈浓度依赖性，但是上升的幅度很小，说明 Bac2a 对细胞的溶血能力相对较弱。肽浓度在 1～64 μmol/L 范围内，细胞存活率很高，说明 Bac2a 的细胞毒性也很低。蜂毒素是公认的抑菌性较强的抗菌肽，但溶血性和细胞毒性很高，细胞选择性较低^[5]，因此 Bac2a 在实际应用中比蜂毒素更有优势。

治疗指数是指示抗菌剂抗菌特异性的参数，是 MHC 对 MIC 的比值。治疗指数越大，表明抗菌特异性越强^[14]。由表 2 可知，Bac2a 的治疗指数为 3.26，蜂毒素为 0.08，Bac2a 的治疗指数远强于蜂毒素，表示 Bac2a 的细胞选择性较高，作为添加剂比蜂毒素更有优势。Bac2a 在拥有较强抗菌性的同时能够保持较低的溶血性和毒性，证明 Bac2a 具有成为抗生素替代品的潜力。

本实验研究发现，增加溶液中钠离子和镁离子浓度会使 Bac2a 的抑菌性降低，说明 Bac2a 对上述两种盐离子不稳定，这可能是因为二价阳离子的结合位点是革兰阴性菌细胞膜上带负电荷的脂多糖，而阳离子抗菌肽主要是通过静电作用与细菌细胞膜结合，两者是竞争关系^[17-18]。因此增强溶液中二价阳离子的浓度会抑制抗菌肽与细胞膜作用，从而使抑菌性降低。研究发现，Bac2a 热稳定性较高，与 Ma 等^[18]报道结果一致。

大量的研究结果已经证明，胃蛋白酶的酶切位点是疏水性氨基酸或芳香族氨基酸；胰蛋白酶的酶切位点是赖氨酸和精氨酸的羧基端形成的肽键；木瓜蛋白酶属于巯基蛋白酶，作用位点是精氨酸、赖氨酸、甘氨酸结合的肽键；蛋白酶 K 的酶切位点具有广泛特异性。本实验中 Bac2a 对四种蛋白酶的稳定性都不太好。说明 Bac2a 具有 4 种蛋白酶的酶解位点，容易酶解而失活。

本实验通过微量稀释法测量抗菌肽的抑菌活性，结果表明，牛溶菌肽线性衍生物 Bac2a 抑菌性较强，与蜂毒素相比，其细胞选择性较好，并且对真核细胞的毒性小；同时抗菌肽 Bac2a 具有较好的热稳定性，但盐离子稳定性和蛋白酶水解稳定性较差。总之，抗菌肽 Bac2a 具有成为抗生素替代品的潜力，可以考虑适当应用于食品、医药及其它领域。

Funding Statement

“十三五”国家重点研发计划（2016YFD0400605）