羟基磷灰石/磷酸三钙生物材料植入小鼠体内的血管化过程

Abstract

This study aims to explore the vascularization of hydroxyapatite/tricalcium phosphate (HA/TCP) biomaterials implanted in mice during osteoinduction. The HA/TCP biomaterials were implanted in muscle of mice, and 2, 4, 6, 8, 10 and 12 weeks after the implantation, the materials were harvested to prepare serial sections and hematoxylin-eosin (HE) staining. The process of vascularization was dynamically described, and the area percentage of neovascularization was quantitatively analyzed. The results showed that neovascularization formation was a continuous and dynamic process. The neovascularization appeared largely in the first two weeks, with a rising trend in week 4, reached peak in week 6, and gradually reduced in week 8. The results provide ideas for improving the success rate of bone tissue engineering, and indicate the mechanism of osteoinduction.

引言

羟基磷灰石/磷酸三钙（hydroxyapatite/tricalcium phosphate，HA/TCP）生物陶瓷材料可以在狒狒、猪、狗、兔子、小鼠等多种动物体内诱导异位骨形成，即骨诱导现象^[1-2]。利用 HA/TCP 的这种特性，其可以用来修复骨缺损创伤，是一种优良的人工骨^[3]，且 HA 和 TCP 比例不同成骨效果亦不同^[4]。目前，动物体内骨诱导现象已被广泛报道，但其骨组织形成动态过程很少被描述；在这个过程中，血管化是新生骨组织形成的基础，只有通过新生血管供给小分子营养物质，才能促使新生骨组织形成。因此，在异位骨形成过程中必须先要有新生血管的形成。在本研究中，我们将重点关注 HA/TCP 生物陶瓷材料植入小鼠体内后的血管化过程，试图动态描述骨诱导过程中的血管形成，为骨组织工程提供新的思路。

1. 材料和方法

1.1. 材料

60HA/40β-TCP 生物陶瓷材料由四川大学生物材料中心制备并提供，其孔隙率约占 50%，孔径范围为 300～500μm。实验时，将材料制备成 3 mm×5 mm 大小并高温灭菌后进行移植。

1.2. 动物手术

30 只 6 周龄 C57BL/6 小鼠购自成都达硕实验动物公司，饲养一周后进行手术。首先，用 3% 戊巴比妥钠（30 mg/kg）对所有动物进行腹腔内麻醉；然后，对所有小鼠的两侧后腿消毒、剃毛和备皮，用剪刀剪开皮肤和肌肉，制备肌袋，然后将 HA/TCP 材料植入肌袋，最后逐层缝合肌肉和皮肤。手术后 2、4、6、8、10 和 12 周，各收获 5 只小鼠包裹在肌肉中的材料标本置于 10% 中性福尔马林中固定。

1.3. HE 染色

标本固定后用 pH7.0的 10% 乙二胺四乙酸（ethylene diamine tetraacetic acid，EDTA）脱钙，流水冲洗，梯度酒精脱水，二甲苯透明，浸蜡，然后制成 5 μm 厚连续切片。切片用苏木素-伊红（hema- toxylin-eosin，HE）染色，最后在光学显微镜下观察新生血管形成情况。

1.4. 免疫组织化学染色

为了鉴定血管的生成，我们检测了 HA/TCP 生物陶瓷植入小鼠肌肉中 2、4、6、8 和 10 周后 CD105、CD34 和血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor, VEGF）免疫组织化学染色。CD105 是内皮细胞增殖的标志物，其在新生血管内皮细胞中高度表达，而在成熟血管内皮细胞中弱表达或不表达。CD34 是血管内皮细胞的特异性标记物，能标记血管。VEGF 是血管内皮细胞分泌的因子，能促进血管内皮细胞的增殖。切片脱蜡，再水化后用 3% 双氧水暗室内封闭内源性过氧化物酶 15 min，并放入 Tris-EDTA 中 95 ℃ 水浴 45 min；4 ℃孵育大鼠抗小鼠单克隆抗体 CD105（1∶1 000，Chemicon）、羊抗小鼠单克隆抗体 CD34（1∶2 000，Abcam）和羊抗小鼠单克隆抗体 VEGF（1∶1 000，Abcam）过夜，再室温孵育辣根过氧化物酶标记的二抗 30 min。最后，切片用 3, 3′-二氨基联苯胺（3, 3′-diaminobenzidine tetrahydrochloride，DAB）显色并在显微镜下观看，若细胞显棕色则表示相应蛋白呈阳性。

1.5. 新生血管定量分析

每个石蜡块连续切片 5 张，HE 染色切片于显微镜下采图，用 Image-Pro plus6.0 软件对其中的新生血管面积进行统计，计算每一时间点新生血管的面积百分数，所有数据以均数 ± 标准差表示，应用 SPSS19.0 统计软件进行分析，所有数据采用 t 检验，P<0.05 表示差异有统计学意义。

2. 结果

2.1. 新生血管形成过程

我们将 HA/TCP 材料移植入小鼠体内 2、4、6、8、10 和 12 周的 HE 切片在显微镜下观察，发现其形成了一个动态鲜明的血管生成过程（见图 1）。2 周时，由于材料植入时的创伤，大量炎症因子侵入材料孔隙中，如淋巴细胞、粒细胞、单核细胞、巨噬细胞、成纤维细胞等，在局部形成间充质组织。一方面，血管内皮细胞从周围组织中迁移到材料间隙中，以促进新生血管的形成；另一方面，材料周围毛细血管侵入材料，在间充质组织区域形成血管网络。4 周时，血管继续生长发育，广泛分布在间充质组织中，为骨组织形成提供营养输送，也为新生骨组织形成构建雏形。6 周时，随着成骨细胞分泌胶原物质和矿物质，加上材料降解的钙、磷离子沉积在胶原物质上，类骨质在毛细血管构建的雏形上慢慢形成，血管丛在类骨质中继续为骨组织成熟输送细胞因子和营养成分。8 周时，骨组织继续发育成熟，成骨细胞线性排列在骨组织周围，并分泌抗血管生物因子使骨组织无血管化，毛细血管在未骨化的间充质区域重复前述过程。10 和 12 周时，骨陷窝形成，骨组织成熟为板层骨，并诱导骨髓组织生成，骨组织中仍保持无血管化状态。因此，新生血管仅在成骨早期发挥作用，而骨成熟后就无需其再提供营养输送。

图 1.

HE staining of HA/TCP bioceramic specimen (200×) The micrograph showing the vascularization of HA/TCP biomaterials implanted in muscle of mice. The arrows denoting blood vessels

HA/TCP 生物陶瓷标本 HE 染色（200×） 图片显示 HA/TCP 生物陶瓷植入小鼠肌肉中的血管化过程；箭头表示血管

2.2. 血管相关蛋白的表达

CD105 免疫组织化学结果显示（见图 2），2 周时大量新生血管形成，之后的时间内新生血管不断形成，而已形成的新生血管逐渐成熟且 CD105 表达下降。CD34 组化结果显示，新生血管在材料间隙间的间充质组织中大量形成，6 周时达到最大量。VEGF 免疫组化结果显示，从第 2 周开始，间充质组织中有大量新生血管形成，到 10 周时，仅位于新生骨组织周边的血管和间充质组织中的血管表达 VEGF，而骨组织内部无血管生成。

图 2.

Immunohistochemistry staining of HA/TCP bioceramic specimen (200×) The immunohistochemistry of CD105, CD34 and VEGF indicating the new blood vessel formation. The materials of VEGF group were nonspecifically stained

HA/TCP 生物陶瓷标本免疫组织化学染色（200×） CD105、CD34 和 VEGF 免疫组织化学图片提示新生血管形成;其中 VEGF 免疫组化结果中材料被非特异性染色

2.3. 新生血管面积百分比

从血管化的动态过程我们可以看出，新生血管在第 2 周时就大量生成；4 周时呈增长趋势；6 周时达到峰值，与第 2 周相比新生血管面积百分比明显增多（P<0.05）；8 周后逐步减少，与第2、4、6 周相比明显减少（P<0.05）（见图 3）。

图 3.

Area percentage of new blood vessels (*P<0.05)

新生血管面积百分比（*P<0.05）

3. 讨论

临床上，即使利用人工骨，大范围、大节段的骨缺损也难以修复，究其原因是因为缺乏支持骨再生的营养分子，而这些营养分子均是通过血管再生来输送的^[5]。因此，了解骨诱导过程中的血管化过程对骨组织工程十分重要。本研究以 HA/TCP 生物陶瓷材料植入小鼠肌肉内骨诱导为基础，动态描述了此过程中的血管化过程，明确了血管形成的时间和条件，可更好地用于骨组织工程。

血管生成一般分为两种，一种是由血管内皮祖细胞分化形成新的血管，另一种是已存在的血管通过出芽及微血管融合生长的方式形成新的毛细血管^[6]。在本研究中，新生血管形成机制是两者结合起来实现的。当小鼠机体遭受手术带来的创伤时，大量炎症细胞涌入，释放血管内皮细胞生长因子、碱性成纤维细胞生长因子等促血管生成因子，促进内皮细胞分化形成新的血管；另一方面，手术位点周围已存在的血管通过出芽的方式也会形成一部分毛细血管。这些新生血管为异位骨组织形成提供了必要的生长因子。本研究中选用 CD105、CD34 和 VEGF 做为鉴定血管生成的标志物，有效地鉴定了新生血管和成熟的血管，动态地描述了骨诱导过程中的血管化过程。骨组织工程是由支架材料、种子细胞和生长因子三种因素共同构成的促进骨组织再生的工程 ^[7-8]。HA/TCP 生物材料可作为骨组织工程的一种良好的支架材料^[9]，由于本研究 HA/TCP 材料的孔径范围为 300～500 μm，因此其诱导骨组织形成过程为膜内成骨，而这个孔径也是最适合血管长入的孔径^[10]。尽管骨组织工程已得到了广泛的应用，但是假如植入种子细胞离血管距离较远（大于 200 μm）就难以获得营养得以存活，如果不能快速建立血管，就难以构建大节段骨组织^[11]。因此，根据本研究的提示，我们可以通过复合血管内皮细胞、植入血管束、加入 VEGF 因子等方式，来提高骨组织工程的成功率。同时，本研究也从血管化方面揭示了骨诱导形成的机制。

Funding Statement

国家自然科学基金（51402027）；国家级大学生创新创业训练计划项目（201511079009）