环介导等温扩增技术可视化检测结核分枝杆菌

Abstract

In this study, loop-mediated isothermal amplification (LAMP) assay in conjunction with calcein for visualized detection of Mycobacterium tuberculosis (MTB) was established. Firstly, four LAMP primers were designed according to the region of 16S rDNA sequences of MTB. Secondly, clinical sputum samples were collected, decontaminated and their DNA was extracted. Thirdly, standard MTB strains were used to evaluate the specificity and sensitivity of LAMP. At the same time, electrophoresis was used for products detection and calcein was used for visualized verification. At last, Chi-squared test function in SPSS 17.0 software was used for consistency evaluation of LAMP assay as compared with the gold standard (culture method). Results showed that there was no nonspecific amplification appeared in the specificity assay and the detection limit was 10 copies/tube in the sensitivity assay. In addition, visualized method by calcein had a comparable sensitivity with that of electrophoresis method. After evaluation of clinical practicability, the sensitivity of LAMP was calculated as 94.74% and the specificity was 90%, respectively. And Chi-squared test showed that LAMP and culture method had no statistic difference, and the two methods were in good consistency (P>0.05). In conclusion, LAMP assay introduced in our study has the characteristics of high efficiency and visualized detection so that this technique has great application prospects in the resource-limited environment, such as work field and primary care hospitals.

引言

分枝杆菌属是一组抗酸性、呼吸道传播的杆菌，其中引起肺结核的主要为结核分枝杆菌（mycobacterium tuberculosis，MTB）。据世界卫生组织（world health organization，WHO）报道，2014年新发结核病达 900 万，而结核病又是位列人类获得性免疫缺陷综合症（acquired immune deficiency syndrome，AIDS）之后的第二大致死性传染病^[1-2]。中国是全球 22 个结核病高负担国家之一，每年新发病例占全球总数的 16%，每年新增的活动性肺结核患者达 130 万例，其中涂阳肺结核达 58 万例，因此越来越多的研究人员开始关注对 MTB 感染的快速诊断^[3-6]。然而，针对 MTB 的快速实用检测在结核病流行的发展中国家仍有一定难度^[7-8]。比如，作为“金标准”的培养法需要 4～8 周才能得出结果^[9]，而近年来发展起来的快速培养系统如Bactec^TM结核分枝杆菌生长指示管（mycobacteria growth indicator tubes，MGIT），虽然缩短了培养时间（3～7 d），但是会带来快速增菌造成的气溶胶污染^[10-14]。另一方面，目前应用广泛的抗酸染色技术是一种在实验设备匮乏的在中小型基层医疗机构都较为常用的检测手段，甚至很多专业医疗机构也普遍应用。然而，这种传统方法的敏感性和特异性较低，常有漏诊发生，结果是涂阴者也可能会传播 MTB，而对涂阴者冒然用药必然会增加耐药率甚至导致药物中毒^[15-17]。如今，使用以分子生物学为基础的技术，不仅可以提高检出率，而且可以避免因药物中毒导致的不必要处理措施和费用。但是分子生物学技术，如聚合酶链反应（polymerase chain reaction，PCR）和实时 PCR 等，需具备昂贵的设备和技术熟练的操作人员^[18-20]，因此限制了这类既特异又灵敏的技术在现场和基层医疗机构的应用。

环介导等温扩增技术（loop-mediated isothermal amplification，LAMP）不仅特异性和灵敏度高，而且操作简单，操作者使用恒温装置在 60～65℃条件下经 30～60 min 即可完成扩增，使用钙黄绿素染料对产物显色即可定性指示结果^[21-22]。另外，反应中不受温度浮动和反应体系中血红素、免疫球蛋白、抗凝剂等的干扰，因此更加适用于条件较差的操作环境^[23-25]。

MTB 中 16S 核糖体核糖核酸（16S ribosomal ribonucleic acid，16S rRNA）是由 16S 核糖体脱氧核糖核酸（16S ribosomal desoxyribonucleic acid，16S rDNA）编码的长约 1 500 bp 的 30S 小亚基元件，具有一定的保守性^[26]。虽然 16S rRNA 占总 RNA 的 80%，拷贝数是 DNA 的 1 000～10 000 倍^[13]，但是 16S rRNA 半衰期短，仅存在于有代谢活性的活菌中，然而，根据 LAMP 的温度条件（60～65℃），MTB 的 16S rRNA 在 20 min 内即被降解，而 16S rDNA 不受温度干扰。因此本研究应用 LAMP 技术为手段，开展了针对 MTB 16S rDNA 的可视化检测 MTB 技术的初步探索，为推进该技术在现场或基层医疗机构的应用奠定了理论基础。

1.1. 模板来源

本文使用的临床样本来自中国人民解放军白求恩国际和平医院感染科2015年 9–11 月经痰培养和电子计算机断层扫描（computed tomography，CT）等检查诊断为结核病的患者 95 例，另采集该医院呼吸科非结核病而有其他肺部疾病患者痰样本 10 例作为阴性对照，提供痰液者均要求签署《知情同意书》。用 N-乙酰-L-半胱氨酸（N-acetyl-L-cysteine，NALC）-NaOH 去污染，操作流程为：取 4%（NALC）-NaOH（成分：4% NaOH 1 mL，NALC 0.1 g，2.94%枸橼酸钠 1 mL）1 mL，加等量痰液混合震荡后静置 20 min，直至完全液化无痰丝。取 1 mL 液化痰液 5 000 rpm 离心，沉淀加入 1.5 mL pH 值为 7.2 的磷酸盐缓冲液混匀。按照核酸提取试剂盒（MasterPure^TM Complete DNA and RNA Purification kits，Epicentre Biotechnologies）操作完成DNA提取。MTB 标准菌株（H37Ra）由本实验室保存。

1.2. LAMP体系和条件

25 μL LAMP 体系包括：正向内引物（forward inner primer，FIP）和反向内引物（backward inner primer，BIP）各 1.6 μmol/L，正向外引物3（forward outer primer 3，F3）和反向外引物 3（backward outer primer 3，B3）各 0.2 μmol/L，1.6 mol/L甜菜碱（Sigma），6 mmol/L Mg₂SO₄，1.4 mmol/L 三磷酸脱氧核糖核苷（deoxy-ribonucleosidetriphosphates，dNTPs），8 U Bst DNA 聚合酶 1 μL（New England BioLabs）、20 mmol/L Tris-HCl（pH 8.8）、10 mmol/L（NH₄）₂SO₄、10 mmol/L KCl、0.1% Triton X-100、1 μL 模板 DNA、1 μL 钙黄绿素和锰离子（manganese ion，Mn²⁺） 混合染色液 （成分：0.5 mmol/L 钙黄绿素和10 mmol/L MnCl₂）。将反应管置于 65℃ 恒温水浴箱内反应 60 min 后置于冰盒内灭活酶，以终止反应。

1.3. 引物设计

登陆 Genbank 网站搜索 MTB 16S rDNA 全序列并进行下载，用 Clustal Omega 工具（ http://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalo/）通过序列对比确定相对保守基因区段。然后用 Genbank 号为 KC692362.1 作为代表序列输入 LAMP 引物设计软件 PrimerExplorer V5（ http://primerexplorer.jp/e/）设计检测 MTB 的引物。该软件的最大优点为可以根据人型 MTB 不同于其他 MTB 的核酸位点设计出相对特异的引物。引物由两条外引物（F3和B3）和两条内引物（FIP和BIP）组成。内引物组成：FIP 由正向内引物 1 的互补序列（complement of forward inner primer 1，F1c）和正向内引物 2（forward inner primer 2，F2）组成，BIP 由反向内引物 1 的互补序列（complement of backward inner primer 1，B1c）和反向内引物 2（backward inner primer 2，B2）组成，外引物即为 F3 和 B3。因此，这四条引物可识别靶序列上的六个基因区段。引物的图解如 图 1 所示，图中各个引物以彩色条带标出：红色条带代表 F3 和 B3，蓝色条带代表 F2 和 B2，黄色条带代表 F1c 和 B1c。箭头表示从 5′ 到 3′ 方向。虚线表示同上列的核苷酸，其中的实线表示缺失的脱氧核糖核苷酸。引物序列和位点如 表 1 所示，所有引物由上海生工公司合成。

图 1.

Diagram of primers for detection of MTB with LAMP

LAMP 检测 MTB 的引物分解图

表 1. Four primers of LAMP for MTB detection.

LAMP 检测 MTB 的四条引物

名称	序列	长度/bp	位点
F3	5′-GCGGCGTGCTTAACACAT-3′	18	42–59
B3	5′-GCTCATCCCACACCGCTA-3′	18	215–232
FIP（F1c+F2）	5′-CACCCACGTGTTACTCACCCGCAAGTCGAACGGAAAGGTCT-3′	45	125–105（F1c）+60–80（F2）
BIP（B1c+B2）	5′-GGATAAGCCTGGGAAACTGGGTCGCTTTCCACCACAAGACAT-3′	46	164–143（B1c）+192–211（B2）

1.4 LAMP 的特异度

分别以 MTB 标准株为阳性对照，对非结核病而有其他肺部疾病患者的痰液 DNA 为扩增模板进行 LAMP 扩增。结果判定：将 2 μL 扩增产物在 2% 琼脂糖凝胶中电泳约 40 min 并置于紫外光下进行照相，出现 LAMP 特征性梯状条带为阳性结果，无梯状条带为阴性结果。染色验证：反应管内液体变绿为阳性，保持淡橙色为阴性。

1.5. LAMP 的灵敏度

使用核酸蛋白分析仪（BioPhotometer，Eppendorf，Germany）对 MTB H37Ra 标准株 DNA 进行重复定量后取平均值作为真实含量，再调整为 1 ng/μL 后用双蒸水进行倍比稀释。根据 1 fg 相当于 100 拷贝 DNA 的计算标准 ^[27]，可知 LAMP 反应管中的模板含量分别为 1 ng（10⁸拷贝）、10^–1 ng（10⁷拷贝）、10^–2 ng（10⁶拷贝）、10^–3 ng（10⁵拷贝）、10^–4 ng（10⁴拷贝）、10^–5 ng（10³拷贝）、10^–6 ng（100拷贝）、10^–7 ng（10拷贝）和 10 ^–8 ng（1拷贝）。 扩增后产物用电泳和染色方法对灵敏性进行评价，并进行多次重复实验以验证其稳定性。

1.6 LAMP 的临床评价

对采集的 95 例痰样本和 10 例非结核病患者痰 DNA 用 LAMP 扩增，将其结果和细菌培养结果进行比较，用 SPSS 17.0 统计学软件的卡方检验功能进行一致性检验。差异判定：P<0.05 认为差异有统计学意义。一致性评价：Kappa 值 <0.4，一致性较差； Kappa值 0.4～0.7 之间，则一致性一般； Kappa>0.7 说明一致性较好。

2.1. LAMP 的特异度

用 LAMP 对 MTB 标准株和 10 例非结核病其他肺病患者痰 16S rDNA 的电泳结果和钙黄绿素染色的可视效果如图 2 所示。可以看出，只有 MTB 为模板的 LAMP 体系得出阳性结果（有特征性条带），而以其他样本为模板的 LAMP 体系均为阴性结果（无特征性条带）；并且只有 MTB 管中的颜色由淡橙色变为明显的绿色，而其他样本管均未发生颜色改变，说明结果为阴性。通过比较图中结果，可知染色效果和电泳效果相一致。由于此种染色方法快速而简单，所以可以通过观察颜色而不必进行电泳即可对结果进行定性判定。

图 2.

Specificity assay of LAMP for detection of MTB 1: The MTB standard strain; 2～11: templets of the sputum from non-TB patients; 12: Negative control without template; M: 1 kb DNA marker

LAMP 检测 MTB 的特异度实验 1：MTB 标准株；2～11：非结核病患者痰模板；12：阴性对照；M：1 kb DNA 标记物

2.2. LAMP 的灵敏度

对倍比稀释后的 MTB 标准株进行 LAMP 扩增后，其结果如 图 3 所示，电泳后的产物均呈现 LAMP 的特征性梯状条带，虽然原始的细菌量无法通过条带显现出来，但是从稀释度最大的第 8 泳道可以看出，LAMP 的检测极限为 10 拷贝。通过对染色管进行观察，发现不同的细菌量在 LAMP 扩增后，第 1～8 个扩增管均可见由橙色到绿色的颜色改变，证明染色和电泳效果的检测极限相一致。虽然只是通过颜色的深浅无法用肉眼判断具体的细菌含量，但是在没有气溶胶污染的前提下，使用不开盖的染料判定法不失为一种简单易得的结果判定手段。进一步对该实验进行多次重复扩增后显示，结果稳定。

图 3.

Sensitivity assay of LAMP for detection of MTB 1～9: 10⁸ copies, 10⁷ copies, 10⁶ copies, 10⁵ copies, 10⁴ copies, 10³ copies, 100 copies, 10 copies and 1 copy; M: 1 kb DNA marker

LAMP 检测 MTB 的灵敏度实验 1～9：10⁸拷贝、10⁷拷贝、10⁶拷贝、10⁵拷贝、10⁴拷贝、10³拷贝、100拷贝、10拷贝和 1 拷贝；M：1 kb DNA 标记物

2.3. LAMP 的临床评价

对收集的 95 例 MTB 阳性痰样本和 10 例非结核病患者的痰样本 DNA 再次进行 LAMP 扩增，将 LAMP 方法得出的结果和培养后结果进行比较。 所得实验结果如表 2 所示，在 95 例细菌培养为阳性的样本中 LAMP 可确定 90 例阳性样本，剩余 5 例未得扩增， LAMP 的灵敏性为 94.74%。在 10 例非结核病患者样本中，可用 LAMP 确定出 9 例阴性，特异性为 90%。对这两种方法经SPSS 17.0 进行一致性检验后，得出 P>0.05，说明两种方法的差异没有统计学意义。由 Kappa值>0.7 可知，两种方法的一致性较好。

表 2. Consistency comparison between LAMP and culture method.

LAMP 与培养方法的一致性比较

LAMP	金标准（培养）		P 值	Kappa值
	+	–
+：阳性结果；–：阴性结果
+	90	1	0.06	0.72
–	5	9

3 结论

结核病有六高“不改变”，即结核病的感染率、患病率、死亡率、新涂阳率、耐药率和农村患病率在传染病中最高且至今不改变。针对结核病的涂片检测及时方便，然而其灵敏度和特异度仅为 50% 和 80%，况且在肺结核患者中，临床上有 14.2% 患者无肺结核症状。因此临床上亟需一种更为灵敏、特异的实验技术以佐证甚至代替传统的结核杆菌检测技术。

与其他核酸扩增技术相比，LAMP 技术具有如下三点优势：首先，由于等温条件下即可扩增，因此所用装置廉价、操作简单，无需昂贵的设备和繁琐的操作，本实验就仅用一台水浴箱完成了所有实验。第二，由于 LAMP 没有如 PCR 的变性、退火和延伸等温度循环步骤，所以扩增效率得到了极度提高，一般使用 4 条引物的 LAMP 在 1 h 内可终止反应，如果再加用两条引物，可使得其扩增时间缩短到 30 min，但是这种方案对引物的要求十分严格，否则容易形成二聚体，会产生类似于假阳性的结果。最后，利用钙黄绿素的颜色改变进行结果判定，这种方法不但操作简单，而且不干扰 Bst DNA 聚合酶工作，使 LAMP 可以达到和电泳相一致的灵敏性。按照原理解释，钙黄绿素是一种金属荧光指示剂，在反应尚未开始阶段，其和体系中的 Mn²⁺ 螯合而处于淬灭状态。随着反应逐步进行，Mn²⁺ 被反应过程中生成的焦磷酸盐替代致使钙黄绿素游离出来，从而发出绿色荧光。这种游离的钙黄绿素更倾向于与 LAMP 体系中的镁离子结合，这种结合可加强荧光效果，使绿光更加鲜艳明亮。

LAMP 具有良好的特异性，从实验中可看出，其没有与非目标病毒发生交叉反应，这主要归功于 4 条引物：F3、B3、FIP 和 BIP。F3 和 B3 的作用是形成茎环结构，而 FIP 和 BIP 通过与茎环结构的内部序列互补而达到扩增靶序列的目的。因此，使用 4 条引物可以使得其扩增特异性高于仅使用两条引物的普通 PCR 方法。在灵敏性方面， LAMP 对标准株的检出极限可到 10 拷贝，然而对临床评价试验中未检出的 5 例假阴性痰样本进行 DNA 定量，发现其细菌含量并不低，分析原因，可能是引物设计时主要是选择标准株的相对保守的基因区段，再加上 MTB 某基因位点有突变的可能，因此未能得到扩增。而在 10 例非结核病患者的痰扩增实验中，其中的 1 例痰得出假阳性结果，后经再次实验和分析，发现是由于在 105 例大量样本扩增过程中，实验环境受到了轻度气溶胶污染。

综上，本研究证明了 LAMP 具有的高效、省时和经济等优势，具有在现场或基层医疗机构的应用价值。然而，LAMP 技术依然面临几处不足，例如 DNA 提取过程叫繁琐，反应试剂需低温保存，气溶胶污染容易导致假阳性率升高等问题。所以，今后的研究可以落实在以下几点：首先，在样本处理方面，要进一步探索更加简易的 DNA 提取方法，比如开发出一种仅需把棉签放入试剂稍加搅拌即可完成 DNA 提取的试剂。第二，在反应液保存方面，开发干燥剂型反应试剂，不但可以使其在常温保存，而且携带方便。第三，由于 MTB 中 16S rRNA 的量远高于 16S rDNA 的量，如果可以做到同时检测 16S rRNA 和 16S rDNA，则能进一步提高检测灵敏性。最后，杜绝扩增产物的气溶胶污染，比如使用更为密闭的反应管或发明一体化的反应装置。相信随着该技术的不断成熟和改进，相信 LAMP 将会成为现场和基层医疗机构的实用检测技术，也会成为在流行病学调查中的有力辅助工具。

Funding Statement

全军医药卫生科研基金项目（CBJ14C010）