发卡型寡聚酰胺对双链 DNA 的识别研究

Abstract

Selective recognition of double strands DNA (dsDNA) has been a research hot spot in molecular biology and biomedicine for a couple decades. Based on the selective interaction between natural nucleic acid/synthetic molecular ligands and dsDNA, gene diagnosis, gene therapy and gene editing would be realized. Hairpin oligopolyamide is a molecular ligand with excellent cellular permeability and nucleases-resistance which can target dsDNA sequence with high affinity and specificity at minor groove. This paper reviews the binding properties and biomedical applications of hairpin oligopolyamide targeting dsDNA, which provide references for further design and application of hairpin oligopolyamide.

引言

发卡型寡聚酰胺是一种拥有良好细胞膜、核膜通透性^[1]，能够在双链脱氧核糖核酸（double strand deoxyribonucleic acid，dsDNA）螺旋小沟处识别特定序列的分子配体。发卡型寡聚酰胺通过三种五环结构单元[N-甲基咪唑（N-methylimidazole，Im）、N-甲基吡咯（N-methylpyrrole，Py）、N-甲基-3-羟基吡咯（3-hydroxypyrrole，Hp）]的四种组合 Im/Py、Py/Im、Py/Py（或Hp/Py）、Py/Py（或Py/Hp）分别识 dsDNA 的 G-C、C-G、T-A 和 A-T 四种碱基对。8 环发卡型寡聚酰胺能以媲美 DNA 结合蛋白的亲和力和优秀的特异性结合 dsDNA^[2]。不同于天然的核酸、蛋白质，发卡型寡聚酰胺能完全抵抗核酸酶的降解，具有良好的细胞内稳定性。近年来大量研究从事发卡型寡聚酰胺在基因治疗、基因调控以及基因编辑等领域的应用^[3-5]。本文综述了发卡型寡聚酰胺对 dsDNA 的识别机制及其应用研究进展。

1. 发卡型寡聚酰胺识别 dsDNA

1.1. 发卡型寡聚酰胺的出现

在 1992 年，Mrksich 等^[6]首次使用核磁共振波谱法证实：两条寡聚酰胺分子 ImPyPy 能特异性地以反向肩并肩的相对位置结合在同一 dsDNA 序列 5′-TGACT-3′ 的小沟。在形成的这种以 2∶1 比例结合的复合物中，两条寡聚酰胺分子相对的芳香环能一同组合识别碱基对，并与同侧 DNA 链碱基形成氢键：寡聚酰胺中酰胺基的 NH 与对应的碱基 A 的N3 原子、碱基 T 和 C 的 O2 原子形成氢键、碱基 G 的 NH2与Im 的 N3 形成氢键。两条寡聚酰胺分子芳香环的交错排布，酰胺键与碱基的氢键绑定，寡聚酰胺与 dsDNA 分子间的范德华力以及带正电末端与小沟的静电作用，共同维持 2∶1 结合复合物的稳定性。从此，寡聚酰胺分子二聚体对 dsDNA 的识别能力越来越被重视。

为了避免寡聚酰胺以非二聚体形式非特异性地结合 dsDNA，或者两寡聚酰胺间发生相对滑动以至结合非目标 dsDNA 序列，Mrksich 等^[7]采用 4-氨基丁酸（4-aminobutyric acid，γ）连接两个寡聚酰胺的末端羧基和末端氨基，作为 “γ-turn” 形成了发卡型结构。6 环发卡型寡聚酰胺 ImPyPy-γ-PyPyPy 对目标序列的亲和常数为 7.6×10⁷（mol/L）^-1，对于两个单碱基错配序列，亲和常数降低为原来的 1/24 或 1/200。与单寡聚酰胺 PyPyPy 和 ImPyPy 相比，ImPyPy-γ-PyPyPy 对目标序列的亲和常数高出 2~3 个数量级。Gottesfeld 等^[2]在活细胞中检测合成的 8 环发卡型寡聚酰胺调控基因的表达时发现，8 环发卡型寡聚酰胺绑定含 6 个碱基对的启动子序列平衡解离常数K_D约为 0.03 nmol/L， 比相应的 DNA 结合蛋白（K_D≈1 nmol/L）有更高的亲和力，这极大地鼓舞了研究者对 2∶1 模式的深入探索。

1.2. 发卡型寡聚酰胺识别 dsDNA 的原理

发卡型寡聚酰胺对 dsDNA 碱基的识别特异性主要来源于五环结构、发卡连接分子 γ 和 3-氨基丙酸（β-alanine，β）与碱基对的特异性作用。

如图 1 所示，碱基 A 和 G 的 N3 原子以及 T 和 C 的 C2-O 原子均带有一对孤对电子，能和寡聚酰胺酰胺键上的 NH 形成氢键，这极大地贡献了结合能。碱基 G 的氨基和 Py 环存在空间冲突，能和 Im 契合并与 Im 的 N3 原子形成氢键^[8]，因此 Im/Py 组合能从四种碱基对中区分出 G-C；Py/Py 组合能从四种碱基对中识别出 A-T 和 T-A，却不能区分二者。为了区分碱基对 A-T 和 T-A，White 等^[9]设计了一种新的芳香族氨基酸 Hp。如图 1c、d所示，Hp/Py 组合能特异性地匹配 T-A 碱基对构象，并与碱基 T 中 O2 形成氢键。Hp/Py 组合对碱基对 T-A 的特异性识别更多地来源于对A-T亲和力的降低，Hp/Py 组合与碱基对 T-A 的亲和力甚至低于 Py/Py，在更多的研究应用中依然使用 Py/Py。

图 1.

Chemical structures of four base pairs viewed from minor groove of DNA and hydrogen bonding patterns of hairpin oligopolyamide recognizing base pairs a. G-C; b. C-G; c. T-A; d. A-T. The short parallel line in the circle stands for lone pair electron and the H in the circle stands for hydrogen atom

dsDNA 小沟面碱基对化学结构式以及发卡型寡聚酰胺与碱基对的氢键结合模式 a. G-C；b. C-G；c. T-A；d. A-T。圈内短平行线代表孤对电子；圈内H代表氢原子

发卡型寡聚酰胺中，γ 具有 Py 类似的特异性：对碱基的亲和顺序为 A≈T>C>G，并且 γ 位置远端的碱基特异性仍然偏好 A 和 T^[10]。可能正如寡聚酰胺酰胺基的 NH 一样，γ 转折结构的 N 端的氨基和 A 的 N3 原子、T 的 O2 原子形成了氢键，但对于 G，可能存在不利的空间作用和静电效果。在 γ 转折结构上的修饰可以影响发卡型寡聚酰胺的结合亲和力和特异性^[11]、细胞透过性^[12]甚至生物毒性^[13-15]。将六环发卡型寡聚酰胺中 γ 转折结构的潜手性 C2 位置上的 H 替代为 NH₂，即将 γ 替换为（R）^H2Nγ^[11]，它对目标序列的亲和力是修饰前的 13 倍，特异性也进一步提升，该修饰还加强了绑定方向的特异性。Meier 等^[12]在 γ 转折结构 C3 位置修饰芳烃基，这个修饰提升了实验中所采用的所有发卡型寡聚酰胺的细胞透过性，并且产生了不同的核内积累量上限。根据 Yang 等^[13]的研究，γ 转折结构的 C2、C3 位置分别修饰氨基或者乙酰氨基的四种八环发卡型寡聚酰胺中，在 γ 转折结构的 C2 位置修饰了乙酰氨基的寡聚酰胺在皮下注射剂量达到 10 mg/kg 时仍没表现出明显的毒性。γ 转折结构修饰的进一步研究探索将扩大寡聚酰胺应用的范围以及安全性。

发卡型寡聚酰胺二聚体对识别目标 DNA 序列的亲和力和特异性并不是随着长度的增加而提升^[6]。随着发卡型寡聚酰胺长度增加，寡聚酰胺和 B 型 DNA（与细胞中双螺旋 DNA 结构最接近的 dsDNA 形式）的曲率不匹配愈加凸显，这阻碍了寡聚酰胺和小沟中碱基的氢键和范德华力的形成，甚至造成失配，降低了亲和力；同时，这使得由 G 的氨基产生的空间位阻效应无法起作用，进一步降低了特异性^[16]。将 β 引入发卡型寡聚酰胺可提升发卡型寡聚酰胺识别较长 DNA 序列的亲和力和特异性^[16]。β 有和 Py 类似的特异性，β/β、β/Py 和 Py/β 表现出不弱于 Py/Py 的对A-T及 T-A 的识别特异性，而 β/Im和Im/β 则分别表现出对 C-G 和 G-C 的特异性^[8]。β/β 在适当的位置上取代 Py/Py，发卡型寡聚酰胺甚至能有更佳的识别效果^[16]。Turner等^[16]认为，在发卡型寡聚酰胺序列中，β 的柔软特性有助于发卡型寡聚酰胺将氢键形成位点调整到对应的碱基位置上，缓解了二聚体聚酰胺和 DNA 的曲率的不匹配。甚至，连续的两个 ββ 连接在发卡型寡聚酰胺 N 端的非核心识别区域，能让其识别亲和力和特异性略有提升^[17]。

发卡型寡聚酰胺二聚体中的 γ 替换为 （R）^H2N γ 能为发卡型寡聚酰胺串联提供连接位点。在保持发卡型寡聚酰胺识别 dsDNA 亲和力及特异性的同时，延长识别序列^[18]。Kawamoto 等^[18]串联了两个相同的 7 环发卡型寡聚酰胺ImImPy-（R）^H2Nγ-PyPyPyIm-β-Dp（Dp: dimethylaminopropylamine，3-二甲氨基丙胺）识别含 12 个碱基对的 DNA 序列。该复合物的热熔解温度（Tm值）达到 69.7 ℃，比单纯的 dsDNA 序列 Tm 值高 26 ℃。对单个和两个错配序列复合，Tm 值分别下降约 7 ℃ 和 14 ℃。2015 年，他们^[19]合成了荧光标记的 3 个串联的发卡型寡聚酰胺探针 TT59，用来识别 18 个碱基对长度的人类端粒末端重复序列（TTAGGG）₃（ODN-3），这是目前为止公布的发卡型寡聚酰胺识别的最长序列。发卡型寡聚酰胺探针 TT59 能以优异的亲和力（平衡解离常数K_D=3.6 nmol/L）结合目标序列 ODN-3。该串联寡聚酰胺对包含单个错配的两个 dsDNA 对比序列的结合亲和力降低了 2/3，说明 TT59 能特异性识别 dsDNA 序列，对目标序列外的序列几乎没有结合，细胞毒性小。

1.3. 发卡型寡聚酰胺识别 dsDNA 的缺陷

γ 与 β 在维持发卡型寡聚酰胺结构的同时，也可能带入不利序列偏好。根据 Dervan 团队^[10]的研究，六环发卡型寡聚酰胺 ImImPy-γ-ImPyPy-β-Dp 识别 5′-W₁GGCW₂-3′ 序列，在 W₂处，γ 识别碱基 T、A、C 的亲和常数分别是识别碱基 G 的 420 倍、400 倍、15 倍以上；同时，在 W₁处，β 对 A 和 T 的亲和力至少是 C 和 G 的 310~210 倍。然而，γ 与 β 对 A-T和T-A 的显著结合偏好可能会限制靶定序列范围。

在发卡型寡聚酰胺中使用 β 的原则可能需要重新考量。和经典的报道不同的是，Bashkin 等^[20]发现在 8 环发卡型寡聚酰胺 ImImPyPy-γ-PyImPyPy-β-Dp 与ImPyPyPy-γ-PyImImPy-β-Dp 中，用 β 取代其中的 Py 形成 β/Im 五环结构，将导致发卡型寡聚酰胺结合 dsDNA 平衡解离常数两个数量级的增加以及特异性的退化。

发卡型寡聚酰胺的固有结构性问题限制了发卡型寡聚酰胺长度，并造成设计替代的五环结构的困难。过长的发卡型寡聚酰胺，其曲率远高于 dsDNA，底部官能团与小沟碱基对距离过大，无法产生特异性作用，并且可能导致五环结构扭曲，引起失配^[21]。不同于单个聚酰胺与 dsDNA 结合形成的相对柔软体系，发卡形状的两条聚酰胺构象相对不自由，故一个五环结构曲率的变化对整个发卡型寡聚酰胺曲率有巨大的影响^[22]。因此设计替代五环时，由于整个环的原子排布差异，面对小沟的官能团电性也是不同的，即便发卡型寡聚酰胺面对小沟侧是同样的官能团，也难以预测其性能^[21]。

 

2　发卡型寡聚酰胺的应用

发卡型寡聚酰胺能以高亲和力特异性结合 dsDNA 目标序列，并且易于合成，拥有良好的细胞膜透过性和细胞内稳定性，这些优秀的性质让发卡型寡聚酰胺在基因治疗（肿瘤治疗、抗病毒治疗）和基因编辑等领域拥有广泛的应用潜力。目前发卡型寡聚酰胺主要有以下三种应用形式：①通过单纯的发卡型寡聚酰胺结合 dsDNA，阻碍特定生理机制中蛋白质-DNA 复合物形成，具有调控基因表达、抗病毒、肿瘤治疗等效用。②仅作为功能分子中 DNA 结合域，特异性结合相应序列，以实现功能基团的作用。缀以不同的功能基团，比如辛二酰基酰替苯胺异羟肟酸（suberoylanilide hydroxamic acid, SAHA）、四羟基环丙基苯并吲哚（1, 2, 9, 9a-tetrahydrocyclopropa[1, 2-c]benz[1, 2-e]indol-4-one, CBI）、维生素 C（vitamin C, Vc）等，该功能分子可以在特定基因位点完成乙酰化、烷基化、切割等作用，实现相应的生理功能。③发卡型寡聚酰胺仅连接荧光分子基团，作为荧光探针，实现特定生物信息的诊断、定位、可视化等功能。

2.1. 单纯发卡型寡聚酰胺结合 dsDNA

单纯的发卡型寡聚酰胺结合至 dsDNA 小沟，制造小沟空间障碍或者同时引起 dsDNA 的变构扭曲来阻碍或者激活与 DNA 序列特异性结合相关的生理过程，具有治疗癌症和抗病毒的潜力^[23]。

发卡型寡聚酰胺能够结合启动子，阻止转录因子与 DNA 序列的结合作用，调节转录因子结合活性，调节转录水平^{[1, 24-25]}。10 环发卡型寡聚酰胺 PyPyImImIm-γ-PyPyPyPyIm-β-DP 可以绑定三磷酸腺苷结合盒转运蛋白 A1（ATP-binding cassette transporter A1, ABCA1）基因启动子区域的 AP-2 蛋白结合位点，阻碍因 AP-2 蛋白结合引发的 ABCA1 基因蛋白表达下调^[25]。在 10 μmol/L 的 10 环发卡型寡聚酰胺 PyPyImImIm-γ-PyPyPyPyIm-β-DP 处理的 RAW264 细胞中，ABCA1 基因的 mRNA 表达水平提升至空白组 mRNA 表达水平的 1.9 倍，几乎与多沙唑嗪药剂的提升水平（是空白组的 2.2 倍）相当；同时，经凝胶渗透色谱分析，被静脉注射发卡型寡聚酰胺的 C57B6 小鼠血浆中各种高密度脂蛋白亚组分含量都有了显著提升^[25]。Kummer 等^[26]发现，在电离辐射损伤基因后，发卡型寡聚酰胺能结合 PC3 细胞裂解液中 DNA 序列 5′-WCWWCW-3′（W为A/T），阻碍 DNA 修复因子结合该序列进行修复，增加电离辐射对细胞的杀伤力。这表明发卡型寡聚酰胺有望成为放大肿瘤放射治疗效果的药剂；发卡型寡聚酰胺也可结合细胞内游离的病毒基因特殊序列，阻碍病毒基因的逆转录，从而阻碍病毒的复制，或者引发细胞内 DNA 损伤响应机制，清除游离基因，起到抗病毒作用^[27-28]；发卡型寡聚酰胺结合分裂间期的细胞 dsDNA，抑制 DNA 解旋酶活性，激活细胞周期检查点响应，暂停细胞分裂^[29]。

2.2. 多功能缀合分子中 DNA 结合域

发卡型寡聚酰胺作为 DNA 结合域，可缀以相应的功能区域，如 DNA 切割剂、dsDNA 烷基化剂^[30-33]或组蛋白脱乙酰酶（histone deacetylase, HDAC）抑制剂来组成相应的功能分子，进行 DNA 序列特异性的编辑修饰作用。

整合了发卡型寡聚酰胺与 DNA 烷基化剂的双功能分子能特异性地烷基化相关基因碱基位点，造成基因功能损伤，沉默基因。这种缀合分子避免了 DNA 烷基化剂非特异性地烷基化正常基因的问题，减少了毒副作用。同时，缀以 DNA 烷基化剂后，寡聚酰胺不仅结合在启动子能阻止特定基因的转录翻译，而且也能结合在编码区有效阻碍 mRNA 的转录延伸，扩大了阻碍特定基因转录翻译的可作用序列范围。Sugiyama 团队^[30-32]设计的基于发卡型寡聚酰胺的 DNA 烷基化缀合分子——发卡型寡聚酰胺-CBI，能有效特异性地烷基化致癌基因 Kras 的突变点密码子（codon 13和condon12）以及人类端粒序列，并诱导细胞凋亡。Sugiyama 团队^[33]还设计了一种光控发卡型寡聚酰胺-CBI 烷基化剂。他们将光解基团修饰在 CBI 的苯酚羟基处，当暴露在 365 nm 紫外线（ultraviolet, UV）照射下，基团可特异性地脱除，激活 CBI 烷基化活性。实验证明 UV 诱导激活的光控发卡型寡聚酰胺-CBI 烷基化剂能够导致人类肺癌细胞株 A549 发生显著的形貌改变。这些结果都展现了发卡型寡聚酰胺-DNA 烷基化剂缀合分子作为有效的癌症化疗手段的潜力。此外，发卡型寡聚酰胺-DNA 烷基化剂缀合分子阻断转录的功能同样有望应用于抗病毒药物的研发^[30]。

在癌细胞中，HDAC 往往过度表达，过强的核小体组蛋白去乙酰化，使得 DNA 和组蛋白紧紧结合，阻碍了某些肿瘤抑制基因的转录表达。HDAC 抑制剂能序列特异性地提高组蛋白乙酰化，增强肿瘤抑制基因表达水平，诱导癌细胞凋亡，是一种抗肿瘤药物^[34]。发卡型寡聚酰胺和一种 HDAC 抑制剂 SAHA 组装成的发卡型寡聚酰胺-SAHA 缀合分子特异性激活基因表达的功能被应用于调节诱导多功能干细胞重编程基因的表达^[35]。Pandian等^[35]合成了一种发卡型寡聚酰胺-SAHA 缀合分子，显著诱导 Oct-3/4 和 Nanog 基因转录因子的内源性表达。并且，这种缀合分子对 5 种基因（Oct-3/4、Nanog、Dppa4、Cdh1、Rex1）启动子区域的结合让它们的 H3、H3K14 位点的组蛋白乙酰化水平均超过了胚胎干细胞，而单独使用 SAHA 几乎不改变 H3、H3K14 位点的乙酰化水平。这显示出基于发卡型寡聚酰胺的 HDAC 抑制剂的巨大抑制效用。

发卡型寡聚酰胺靶定目标 dsDNA 序列的高亲和力和特异性也让它能作为 DNA 切割剂的靶定区域。Li 等^[36]利用发卡型寡聚酰胺连接小分子 DNA 切割剂大环多胺和 Vc，组合成新型的 dsDNA 切割缀合分子。相对于小分子 DNA 切割剂的低效性和位点的随机性，缀合分子切割剂有显著的速率提升以及特异性切割活性，能以更低的有效浓度和更高的特异性进行基因操控。

2.3. 发卡型寡聚酰胺荧光探针

发卡型寡聚酰胺表现出优秀的 dsDNA 识别能力以及良好的核定位能力，有望成为 dsDNA 检测探针^[37]。Kawamoto 等^[18]在两个串联的发卡型寡聚酰胺 C 端修饰 3H-吲哚菁类染料或者德克萨斯红（Texas Red, TR）组成荧光发卡型寡聚酰胺探针，用于识别小鼠或人类端粒重复序列 5′-AGGGTT AGGGTT-3′。其中，串联吡咯-异咪唑聚酰胺发卡（tandem hairpin pyrrole-imidazole polyamides，TH59）与 TR 组成的缀合分子 TH59TR 能在小鼠以及人类细胞中清晰地标示端粒，为细胞中端粒的特异性标记和分析提供了有效方法。随后他们又设计了基于 3 个串联发卡型寡聚酰胺的荧光探针，能特异性地识别 18碱基对人类端粒重复序列，进一步扩大了识别长度^[19]。此外，Vaijayanthi等^[38]设计了一种新型荧光探针：荧光基团（芘）连接在 8 环发卡型寡聚酰胺的 γ 转折结构部分。稳态荧光研究表明，结合目标序列后，相对于芘连接在发卡型寡聚酰胺 N 端的探针，新型荧光探针的荧光发射强度（386 nm）有更高的提升。用 β 连接芘和 γ 转折结构将进一步提升新型发卡型寡聚酰胺荧光分子的结合亲和力，其平衡解离常数可达1.73×10^–8mol/L，有望成为有效的 DNA 荧光探针。

3. 展望

发卡型寡聚酰胺是一种绑定 dsDNA 小沟的分子配体，它拥有良好的细胞膜和核膜透过性，不需要载体帮助就能进入细胞核。不同于核酸和类核酸，寡聚酰胺能完全抵抗核酸酶的降解，具有良好的细胞内稳定性。发卡型寡聚酰胺识别 dsDNA 的特异性来自于两侧五环单元与小沟碱基对的形状特异性匹配以及五环与碱基边缘的氢键结合。发卡结构的连接让寡聚酰胺二聚体以 Im/Py 识别 G-C、Hp/Py 识别 T-A 的配对原则，组合识别小沟两侧碱基序列。8 环发卡型寡聚酰胺能以媲美 DNA 结合蛋白的亲和力和优秀的特异性结合 dsDNA。这些性质吸引了大量学者致力于研究基于寡聚酰胺的基因药物或探针，以实现对细胞内 dsDNA 序列的定向结合，并探索特定基因序列功能^[39-41]。开发可被发卡型寡聚酰胺以优秀亲和力特异性靶定的病理相关 dsDNA 序列，以及对具有序列特异性的发卡型寡聚酰胺的透膜吸收性^[42]、生物毒性^[13]等临床性质的检测研究将会是后续发展热点。

Funding Statement

国家自然科学基金（61371042）；中南大学教师基金（2013JSJJ060）