机械牵拉与前列腺素 E₂ 联合作用下调圆锥角膜成纤维细胞赖氨酰氧化酶家族基因表达

Abstract

为了研究机械牵拉与前列腺素 E₂（PGE₂）对赖氨酰氧化酶（LOXs）家族基因表达的影响，本文对体外培养的正常人及圆锥角膜患者角膜成纤维细胞给予 PGE₂ 处理，并进行幅度为 12%、频率为 0.1 Hz 的周期性机械牵拉 12 h，采用荧光定量聚合酶链式反应(PCR)检测 LOXs 家族基因的表达情况。研究结果显示，圆锥角膜患者的角膜成纤维细胞 LOXs 家族基因表达量普遍低于正常角膜；与静态培养组比较，单独机械牵拉使正常组的赖氨酰氧化酶样蛋白（LOXL）中的 LOXL-2 和 LOXL-4 基因表达上调，并使得圆锥角膜组的 LOXL-3 和 LOXL-4 基因表达下调；机械牵拉与 PGE₂ 联合作用则使正常组的 LOXL-4 以及圆锥角膜组除 LOXL-1 之外的所有 LOXs 基因表达均下调。根据以上研究结果可提示，以机械牵拉和 PGE₂ 同时作用，将下调圆锥角膜患者角膜成纤维细胞的 LOXs 家族基因表达，这将可能导致角膜胶原交联受阻，使胶原纤维之间的黏附力下降，胶原板层之间产生相对滑动，影响角膜结构稳定性，促进角膜发生圆锥膨隆。本文通过探讨研究力学刺激与炎性因子对 LOXs 家族基因表达的影响，有助于更好地理解圆锥角膜发生发展的可能机理，为圆锥角膜预防及治疗提供参考。

引言

圆锥角膜是一种以角膜扩张为特征，致角膜中央部向前凸出呈圆锥形及产生高度不规则近视散光和不同视力损害的角膜变性疾病。目前普遍认为圆锥角膜的发生发展是多因素共同作用的结果，可能与遗传、环境（接触镜的佩戴、揉眼等）、过敏等因素有关^[1]，其病因至今尚不明确。

赖氨酰氧化酶（lysyl oxidases, LOXs）是铜依赖性单胺氧化酶，其家族成员主要有赖氨酰氧化酶蛋白（LOX）和 4 种赖氨酰氧化酶样蛋白（lysyl oxidase like, LOXL）：LOXL-1、LOXL-2、LOXL-3、LOXL-4。LOXs 在细胞内以尚不具活性的酶原形式合成，由前胶原羧基末端内切酶剪切后转变为具有活性的酶^[2]。作为胶原蛋白和弹性蛋白的交联剂，LOXs 在胚胎发育、组织损伤修复以及肿瘤发生与转移等方面发挥着重要的作用^[3]。

Ⅰ型胶原是角膜基质中主要的胶原蛋白，富含赖氨酸和羟赖氨酸残基，可在 LOXs 的作用下形成共价交联，交织成稳定的网状结构。这不仅赋予了角膜组织良好的力学特性，而且增强了角膜抵抗非特异性蛋白水解酶降解的能力。鉴于 LOXs 具有使胶原蛋白和弹性蛋白交联的功能，因此被认为可能与圆锥角膜的发生发展有关，例如：圆锥角膜的胶原纤维平均直径减小、且大小不均一，以及胶原纤维之间的空间距离变窄等^[4]。而给大鼠喂食氨基乙腈（LOXs 抑制剂）可以诱导牙周膜韧带胶原纤维发生与文献[4]报道的圆锥角膜病变类似的变化^[5]，提示 LOXs 功能障碍可能导致角膜胶原形态结构及交联发生异常。此外，采用单核苷酸多态性 （single nucleotide polymorphisms, SNP）分析对伊朗 112 名圆锥角膜患者和 150 名正常健康人进行研究发现，圆锥角膜患者的 LOX 基因 rs1800449 碱基发生变异，进而从分子生物学水平阐明圆锥角膜发生可能与 LOX 基因突变有关^[6]。

LOXs 在正常角膜上皮、基质及内皮各层中均有表达，而在圆锥角膜组织中 LOX 表达明显降低，尤其在基质层的表达量下降较为明显^[7]，而 LOXL-2 和 LOXL-3 的表达较正常角膜组织也明显减少^[8]。有研究指出，圆锥角膜患者泪液中 LOX 活性降低与圆锥角膜病变严重程度相关^[9]。此外，一些体外培养的圆锥角膜上皮细胞及角膜成纤维细胞的 LOX 基因表达量或活性均明显低于正常组织相应的表达量及活性^{[7, 9]}。

角膜属承载组织，在角膜组织变薄、力学性能下降，如进行准分子激光近视手术(laser-in situ kera-tomileusis, LASIK)或发生圆锥角膜、眼内压增高的情况下，角膜会受到更大的力学载荷作用。本课题组前期的研究结果表明，机械牵拉作用会影响角膜成纤维细胞基质金属蛋白酶（matrix metallopro-teinases, MMPs）、基质金属蛋白酶组织抑制因子（tissue inhibitor of metalloproteinases, TIMPs）及 Ⅰ型胶原蛋白的表达调节^[10-12]。另有研究发现，圆锥角膜发生常伴有慢性炎症反应^[13-14]，且圆锥角膜基质细胞中前列腺素 E₂（prostaglandin E₂, PGE₂）表达量约是正常角膜的 10 倍左右^[15]。此外也有研究证实，一些细胞因子如肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor-α, TNF-α）、转化生长因子-β（trans-forming growth factor-β, TGF-β）、PGE₂ 等，能够影响 LOXs 的表达^[16-18]，其中 PGE₂ 可使肺和羊膜成纤维细胞的 LOX 表达下降^[17-18]。另一方面，应力损伤和 PGE₂ 可通过介导后交叉韧带成纤维细胞 LOXs 的表达，影响后交叉韧带的自我修复^[19]。而 PGE₂ 与力学刺激对圆锥角膜 LOXs 家族表达的影响尚未见报道。本文通过对体外培养的正常人及圆锥角膜患者角膜成纤维细胞给予 PGE₂ 处理，并进行周期性机械牵拉，探讨了力学刺激与炎性因子对 LOXs 家族基因表达的影响，这将有助于更好地理解圆锥角膜发生发展的可能机理，为圆锥角膜预防及治疗提供参考。

1. 实验材料和方法

1.1. 主要试剂

改良 Eagle（Dulbecco's modification of Eagle's medium Dulbecco, DMEM）/F12 培养基（Hyclone）、胎牛血清（Gibico）、胰蛋白酶（Gibico）、Ⅱ型胶原酶（Sigma）、PGE₂（Sigma），TRIZOL 及 Prime-Script^TM RT RNA 检测试剂[宝生物工程（大连）有限公司]。

1.2. 人角膜成纤维细胞的提取及培养

正常角膜组织及圆锥角膜组织取自山西省眼科医院，均为角膜移植术后的废弃组织。用含庆大霉素的磷酸盐缓冲液（phosphate buffered saline, PBS）溶液清洗后，机械剥离角膜上皮和内皮层，再用 PBS 溶液反复清洗后，用含 1 mg/mL II 型胶原酶的培养基消化，直至组织块完全消失，镜下可见单个细胞时终止消化。2 000 r/min 离心 5 min，弃上清，加入含 10% 胎牛血清的 DMEM/F12，并置于 37 ℃、5%CO₂ 孵箱内培养，本实验采用传至 3～5 代的细胞进行后续实验。

1.3. PGE₂ 对 LOXs 基因表达的影响

首先收集不同时间点（0 h、6 h、12 h）正常组及圆锥角膜组细胞，TRIZOL 裂解细胞，检测 LOXs mRNA 随时间变化情况。然后选取 12 h 时间点，采用不同浓度(1、10、50 ng/mL)的 PGE₂ 处理细胞，以未加 PGE₂ 的正常组细胞作为对照。TRIZOL 裂解细胞，检测不同浓度的 PGE₂ 对 LOXs mRNA 表达的影响。

1.4. 细胞力学加载实验

采用柔性基底拉伸系统 Flexcell 4000（Flexcell 公司，美国）对第 3～5 代的角膜成纤维细胞施加力学载荷。首先，将细胞接种于裱衬有 I 型胶原蛋白的 6 孔培养板上（BioFlex^@，Flexcell 公司，美国），置于 37 ℃、5%CO₂ 孵箱内培养 24 h，当细胞融合率达到 80% 后，施以频率 0.1 Hz、幅度 12% 的周期性机械牵拉 12 h，同时添加 10 ng/mL PGE₂。正常角膜组和圆锥角膜组分别做以下处理：单纯牵拉、PGE₂ 处理、PGE₂+牵拉处理，以未加 PGE₂ 的静态培养为对照组。卸载力学载荷后，以 TRIZOL 裂解细胞。

1.5. 荧光实时定量 PCR 检测 LOXs 基因表达

收集细胞裂解液，提取总 RNA，使用 Prime-Script^TM RT 试剂盒进行反转录获得 cDNA。采用荧光实时定量 PCR（Applied Biosystems Step-One，美国）检测 LOX 及 LOXL-1-LOXL-4 的 mRNA 表达，并以管家基因甘油醛-3-磷酸脱氢酶（glyceral-dehyde-3-phosphate dehydrogenase, GAPDH）作为内参。引物设计如表 1所示。PCR 反应条件为：95 ℃ 预变性 30 s，1 个循环；95 ℃ 变性 5 s，60 ℃ 退火、延伸 30 s，35 个循环。采用 2^-ΔΔCT 法对基因表达进行相对定量分析。

表 1. Primers sequence of target gene.

目标基因引物序列

基因	序列号	引物	产物大小/bp
GAPDH[20]	NM_002046	正义链：5′- GCACCGTCAAGGCTGAGAAC -3′	138
		反义链：5′- TGGTGAAGACGCCAGTGGA -3′
LOX	NM_002317	正义链：5′- GCCGACCCCTACTACATCCA -3′	183
		反义链：5′- TGGGGAAATCTGAGCAGCAC -3′
LOXL-1[20]	NM_005576	正义链：5′- TGCCACCAGCATTACCACAG -3′	135
		反义链：5′- GAGGTTGCCGAAGTCACAGG -3′
LOXL-2[20]	NM_002318	正义链：5′- CTGCAAGTTCAATGCCGAGTCT -3′	149
		反义链：5′- TCTCCACCAGCACCTCCACTC-3′
LOXL-3[20]	NM_032603	正义链：5′- CAACAGGAGGTTTGAACGCTAC -3′	146
		反义链：5′- GCTGACATGGGTTTCTTGGTAA -3′
LOXL-4[20]	NM_032211	正义链：5′- TTCACCCACTACGACCTCCTCA -3′	155
		反义链：5′- CAGCAGCCTACAGTCACTCCCT -3′

1.6. 数据统计分析

实验结果以均值±标准差表示，采用 SPSS 13.0 统计分析软件及 t 检验分析数据，检测两组之间是否存在差异，P<0.05，认为差异具有统计学意义。

2. 实验结果

2.1. 角膜成纤维细胞 LOXs mRNA 表达随时间的变化

各组 mRNA 相对表达量均以正常组 0 h 的数据为参照，如图 1 所示，除 0 h 和 6 h 的 LOX mRNA 以及 6 h 的 LOXL-2 mRNA 外，圆锥角膜组角膜成纤维细胞的 LOXs mRNA 整体表达水平均低于正常组。正常组 LOXL-4 mRNA 在 6 h 时明显升高（约为 0 h 的 3.31 倍），其他各组 LOXs mRNA 总体随时间变化幅度不大。

图 1.

Changes of gene expression of LOXs family with time in corneal fibroblasts for healthy human and keratoconus patient

正常人及圆锥角膜患者角膜成纤维细胞 LOXs 家族基因表达随时间变化情况

2.2. 不同浓度 PGE₂ 对 LOXs mRNA 表达的影响

如图 2 所示，各组 mRNA 相对表达量均以正常对照组为参照，PGE₂ 对正常组及圆锥角膜组 LOXs mRNA 表达无明显的剂量依赖性。正常组和圆锥角膜组趋势基本相同，1 ng/mL 的 PGE₂ 对 LOXs mRNA 表达具有一定促进作用；10 ng/mL 的 PGE₂ 有上调 LOXL-1 和 LOXL-4、下调 LOXL-2 和 LOXL-3 mRNA 表达的趋势，而对 LOX mRNA 的表达无明显影响；50 ng/mL 的 PGE₂ 对 LOXs 的表达无明显影响。

图 2.

Effects of PGE₂ on LOXs gene expression in corneal fibroblasts for healthy human and keratoconus patient ^*P<0.05, keratoconus groupvs. healthy group under corresponding treatment; ^#P<0.05,vs. healthy control; ^&P<0.05,vs. keratoconus group without treatment

PGE₂ 对正常人及圆锥角膜患者角膜成纤维细胞 LOXs 家族基因表达的影响 ^*P<0.05，相应处理下，圆锥角膜组vs. 正常组；^#P<0.05，vs. 正常对照组；^&P<0.05，vs. 圆锥角膜未处理组

2.3. 机械牵拉与 PGE₂ 联合作用对角膜成纤维细胞 LOXs mRNA 表达的影响

如图 3 所示，单独机械牵拉可上调正常组 LOXL-2 和 LOXL-4、下调圆锥角膜组 LOXL-3 和 LOXL-4 mRNA 的表达（P<0.05），对正常组的 LOX、LOXL-1 和 LOXL-3、圆锥角膜组的 LOX、LOXL-1 和 LOXL-2 无明显影响（P<0.05）。机械牵拉与 PGE₂ 联合作用仅上调正常组 LOXL-4（P<0.05），对正常组其他家族成员基因表达无明显影响（P<0.05），但下调了圆锥角膜组除 LOXL-1 外所有 LOXs mRNA 的表达（P<0.05）。

图 3.

Combined effects of mechanical stretching and PGE₂ on the gene expression of LOXs family in corneal fibroblasts for healthy human and keratoconus patient ^*P<0.05,vs. their own static control

机械牵拉和 PGE₂ 联合作用对正常人及圆锥角膜患者角膜成纤维细胞 LOXs 家族基因表达的影响 ^*P<0.05，与各自静态对照组比较

3. 讨论

细胞外基质的动态平衡及重塑受到多种因素的精准调控。其中，胶原蛋白和弹性蛋白交联需要在 LOXs 的催化下完成。LOX 和 LOXL-1 表达异常可导致眼部疾病如青光眼、增生型糖尿病视网膜病变和孔源性视网膜脱离以及圆锥角膜等疾病的发生^[21-22]。本课题组研究发现，圆锥角膜患者角膜成纤维细胞的 LOX、LOXL-1、LOXL-2、LOXL-3、LOXL-4 的 mRNA 表达均低于正常人。Dudakova 等^[7-8] 也发现圆锥角膜成纤维细胞的 LOX 整体活性低于正常人，其研究小组的免疫组化染色结果也证实圆锥角膜基质中 LOX、LOXL-2 和 LOXL-3 的表达较正常角膜组织明显减少。

近年的一些研究发现，圆锥角膜常伴有慢性炎症，在患者泪液中检出了 TNF-α、白介素（interleu-kin, IL）-1/-6 等促炎症因子^[13-14]；圆锥角膜成纤维细胞中 IL-6、PGE₂ 和 IL-1α受体的表达明显高于正常人，添加 IL-1 培养圆锥角膜成纤维细胞可使 PGE₂ 表达量进一步增加^{[15, 23]}。还有研究表明，TNF-α可通过上调 IL-6 促进圆锥角膜成纤维细胞 MMP-1 的表达，促进 I 型胶原降解^[24]。本研究发现，PGE₂ 对正常及圆锥角膜 LOXs mRNA 表达的影响无明显的剂量依赖性，虽然不同剂量 PGE₂ 对 LOXs 基因表达影响不同，但对正常及圆锥角膜 LOXs 基因表达影响趋势基本一致：低剂量（1 ng/mL）PGE₂ 对 LOXs 的基因表达具有一定促进作用；中剂量（10 ng/mL）PGE₂ 有上调 LOXL-1 和 LOXL-4、下调 LOXL-2 和 LOXL-3 mRNA 表达的趋势，对 LOX mRNA 表达无明显影响；而高剂量（50 ng/mL）PGE₂ 对 LOXs 表达均无明显影响。他人研究也发现，不同剂量细胞因子通过不同信号通路影响 LOXs 的表达，如低剂量 TNF-α（1～5 ng/mL）可抑制心肌成纤维细胞 LOX 表达，高剂量 TNF-α（10～30 ng/mL）则通过磷脂酰肌醇-3-激酶-蛋白激酶 B（phosphatidyl inositol-3-kinase-protein kinase B，PI3K-Akt）信号途径促进 LOX 表达^[16]。不同剂量 PGE₂ 通过何种信号通路影响角膜成纤维细胞 LOXs 的表达则有待进一步研究。

由于圆锥角膜组织结构完整性破坏、力学性能下降，在眼压的作用下所受张应变增加，因此，我们探究了力学刺激和炎症同时存在条件下 LOXs 的表达。发现单独机械牵拉可上调正常组 LOXL-2、LOXL-4，下调圆锥角膜组 LOXL-3、LOXL-4 mRNA 的表达，说明单独机械牵拉即可引起圆锥角膜组 LOXs 表达异常。而机械牵拉和 PGE₂ 联合作用则更是下调了圆锥角膜组除 LOXL-1 外所有 LOXs mRNA 的表达。这些结果提示圆锥角膜角膜成纤维细胞在张应变和炎症同时存在的条件下，可能通过下调 LOXs 的表达，引起角膜基质胶原交联障碍，进而影响角膜组织结构完整性和力学性能的稳定性。在韧带组织中也存在类似情况：12% 机械牵拉使共培养条件下的膝关节后交叉韧带成纤维细胞和滑膜细胞中 LOXs 表达明显降低；在共培养和应力损伤共同作用的基础上，10 ng/mL 的 PGE₂ 进一步降低了两种细胞中 LOXs 的表达。应力损伤和 PGE₂ 可能通过介导 LOXs 表达异常从而破坏细胞外基质的动态平衡，导致后交叉韧带损伤后难以达到满意的自身修复^[19]。

目前为止，本研究尚具有一定的局限性。首先，正常人及圆锥角膜患者角膜样本来源有限；此外，采用柔性基底拉伸系统 Flexcell 4000 牵拉系统，仅在一定程度上模拟了圆锥角膜组织的在体环境。而圆锥角膜成纤维细胞所处的真实力学微环境远比此复杂，有多种细胞因子和蛋白酶等参与了圆锥角膜的发生发展。这些因素如何共同作用影响圆锥角膜的发生发展及其分子调控机制，还有待深入探讨。我们的研究结果进一步说明圆锥角膜的发生发展可能与 LOXs 的表达降低有关；此外，角膜张应变增加和炎症共同作用可能会进一步降低圆锥角膜 LOXs 的表达。鉴于 LOXs 可通过促进胶原交联来增加角膜结构的力学稳定性，因此，改善 LOXs 的表达可能成为圆锥角膜疾病治疗的新靶点。

Funding Statement

国家自然科学基金资助项目（11402162，31271005，11402161）