黄连素衍生物（氟[¹⁹F]HX-01）体外靶向肝癌的初步研究

Abstract

[¹⁸F]HX-01, a Fluorine-18 labeled berberine derivative, is a potential positron emission tomography (PET) tumor imaging agent, while [¹⁹F]HX-01 is a nonradioactive reference substance with different energy state and has the same physical and chemical properties. In order to collect data for further study of [¹⁸F]HX-01 PET imaging of hepatocellular carcinoma in vivo, this study compared the uptake of [¹⁹F]HX-01 by human hepatocellular carcinoma and normal hepatocytes in vitro. The target compound, [¹⁹F]HX-01, was synthesized in one step using berberrubine and 3-fluoropropyl 4-methylbenzenesulfonate. Cellular uptake and localization of [¹⁹F]HX-01 were performed by a fluorescence microscope in human hepatocellular carcinoma HepG2, SMMC-7721 and human normal hepatocyte HL-7702. Cellular proliferation inhibition and cell cytotoxicity assay of the [¹⁹F]HX-01 were conducted using cell counting kit-8 (CCK-8) on HepG2, SMMC-7721 and HL-7702 cells. Fluorescent microscopy showed that the combining ability of [¹⁹F]HX-01 to the carcinoma SMMC-7721 and HepG2 was higher than that to the normal HL-7702. Cellular proliferation inhibition assay demonstrated that [¹⁹F]HX-01 leaded to a dose-dependent inhibition on SMMC-7721, HepG2, and HL-7702 proliferation. Cell cytotoxicity assay presented that the cytotoxicity of [¹⁹F]HX-01 to SMMC-7721 and HepG2 was obviously higher than that to HL-7702. This in vitro study showed that [¹⁹F]HX-01 had a higher selectivity on human hepatocellular carcinoma cells (SMMC-7721, HepG2) but has less toxicity to normal hepatocytes (HL-7702). This could set up the idea that the radioactive reference substance [¹⁸F]HX-01 may be worthy of further development as a potential molecular probe targeting human hepatocellular carcinoma using PET.

引言

黄连在中医的应用已逾 2000 年^[1]，复方黄连制剂至今仍然是我国普遍应用的传统中药。1959 年，Hano^[2]报道了黄连素具有抗肿瘤活性，从此激发了人们研究黄连和黄连素治疗癌症的浓厚兴趣。大量黄连素及其衍生物在体外细胞抗癌研究的证据表明：黄连素可抑制多种癌细胞增殖和迁移，诱导癌细胞凋亡，对多种癌细胞具有细胞毒性——即广谱抗癌活性^[3-8]。

课题组前期用正电子核素 ¹⁸F 成功标记黄连素衍生物（氟[¹⁸F]HX-01），经静脉注射进入荷载了兔肝鳞癌细胞株（VX2）肌肉肿瘤模型的兔子体内，利用氟[¹⁸F]HX-01 分子中 ¹⁸F 释放正电子湮没产生的 γ 光子对，用正电子发射计算机断层显像（positron emission tomography，PET）设备探测 γ 光子对并生成图像，完成了兔 VX2 肌肉肿瘤模型 PET 显像，获得肿瘤高对比度影像^[9-10]。

近年的系列研究发现：黄连素及其衍生物可选择性诱导人肝癌细胞死亡，但对人的正常肝细胞无细胞毒性，表明黄连素及其衍生物具有肝癌靶向细胞毒性，有可能成为有前途的多功能抗肝癌药物^[11]。课题组拟进一步探讨氟[¹⁸F]HX-01 应用于人肝癌 PET 显像的可行性。

由于无放射性标准对照品氟[¹⁹F]HX-01 与氟[¹⁸F]HX-01 物理性质及化学性质完全相同，仅能量状态不同，不能释放正电子湮没产生的 γ 光子对，但氟[¹⁹F]HX-01 分子核团具有自发荧光，因此，本项目拟研究氟[¹⁹F]HX-01 在体外人肝癌细胞和人正常细胞中有无选择性分布的现象，为进一步完成活体内氟[¹⁸F]HX-01 肝癌 PET 显像奠定基础。课题组首先合成了非放射性标准品氟[¹⁹F]HX-01；用荧光显微镜观察[¹⁹F]HX-01 在人正常肝细胞（HL-7702）与人肝癌细胞（HepG2、SMMC-7721）内的定位分布；再用细胞增殖活性检测试剂盒（CCK-8法）测定氟[¹⁹F]HX-01 对正常肝细胞（HL-7702）与人肝癌细胞（HepG2、SMMC-7721）的增殖抑制作用及其对细胞的毒性作用。最终拟通过探讨氟[¹⁹F]HX-01 在人肝癌细胞中有无选择性分布这一结果，为进一步完成活体内氟[¹⁸F]HX-01 肝癌 PET 显像积累资料。

1. 材料

1.1. 细胞株

人肝癌细胞株 HepG2、SMMC-7721 及人正常肝细胞 HL-7702 购自美国模式菌种收藏所（Ameri-can type culture collection，ATCC）。

1.2. 试剂

RPMI 1640 培养液、DMEM 高糖培养基、胰蛋白酶（HycLone，美国）；小牛血清（四季青生物公司，中国）；二甲基亚砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）（GIBCO，美国）；细胞增殖活性检测试剂盒（CCK-8）（七海复泰生物科技有限公司，中国）；小檗红碱（萨恩化学技术有限公司，中国）；碳酸铯（Sigma，美国）。

1.3. 仪器

荧光显微镜（Olympus 公司 micropublisher 3.3RTV，日本）；倒置显微镜（Olympus 公司，日本）；高速离心机（日立公司 TGL-16G-A，日本）；CO₂ 培养箱（三洋 SANYO MCO-175，日本）；酶联免疫检测仪（南京华东电子集团医疗装备有限责任公司，中国）。

2. 方法

2.1. 细胞培养

将人肝癌细胞株（SMMC-7721、HepG2）、人正常肝细胞株（HL-7702）接入 25 cm² 培养瓶，SMMC-7721 细胞与 HL-7702 细胞培养于含 10% 小牛血清、100 U/mL 青霉素和 100 mg/mL 链霉素的 RPMI 1640 完全培养液中。HepG2 培养于含 10% 小牛血清、100 U/mL 青霉素和 100 mg/mL 链霉素的 DMEM 高糖完全培养液中。均置于 37 ℃、5% 二氧化碳培养箱中孵育，每日用倒置显微镜观察细胞形态及生长情况，2～3 d 换 1 次培养液。HL-7702 细胞 3～4 d 传代 1 次，SMMC-7721 细胞及 HepG2 细胞 2～3 d 传代一次，取处于对数生长期的细胞用于实验。

2.2. 氟[¹⁹F]HX-01 的合成及鉴定

将小檗红碱（357 mg，1 mmol）与 3′-氟对甲苯磺酸丙酯（即对甲苯磺酰基保护的三氟丙醇）（232 mg，1 mmol）溶于 10 mL 乙腈，搅拌下加入碳酸铯（325 mg，1 mmol），80℃ 下反应 6 h，薄层色谱（thin layer chromatography，TLC）检测。反应完全后，将此反应液用二氯甲烷萃取，有机层用无水硫酸钠干燥，减压旋干后柱层析分离，得到产品氟[¹⁹F]HX-01。

将得到的产品氟[¹⁹F]HX-01 经核磁共振氢谱（¹H nuclear magnetic resonance，¹H NMR）和质谱（mass spectrum，MS）检测，进行结构鉴定。

2.3. 细胞摄取与定位

细胞 HepG2、SMMC-7721 及 HL-7702 传至第 6 代，用 0.25% 胰酶消化，收集处于对数生长期的细胞，并调整单细胞悬液的细胞密度为 1×10⁴ 个/cm²，接种于 96 孔培养板，每孔 100 μL。37 ℃、5% 二氧化碳饱和湿度下培养 24 h，待细胞贴壁后，吸弃孔内相应培养液，加入含不同浓度的氟[¹⁹F]HX-01（25、50、100 μmol/L）的磷酸缓冲盐溶液（phosphate buffer saline，PBS）（含 0.5% 小牛血清），每孔 100 μL，每个浓度 3 个复孔，同时设细胞对照组（仅加入 PBS 和细胞，不添加氟[¹⁹F]HX-01）和空白对照组（仅加入 PBS，不含细胞和氟[¹⁹F]HX-01），37 ℃、5% 二氧化碳饱和湿度下作用 1 h 后，吸弃孔内液体，PBS 冲洗 3 次后，利用氟[¹⁹F]HX-01 分子结构核的自发荧光，于荧光显微镜 488 nm 激发波长下观察细胞对氟[¹⁹F]HX-01 的摄取及其在细胞内的定位分布。

2.4. CCK-8 法测定对细胞增殖抑制作用以及毒性作用

将 SMMC-7721、HepG2 及 HL-7702 细胞传至第 5 代，并经胰酶消化，并吹打成均匀悬液，以 5×10⁴ 个/mL 的浓度接种于 96 孔板，每孔 100 μL 培养液。37 ℃、5% 二氧化碳饱和湿度下培养 24 h，待细胞贴壁后，吸弃孔内液体，按不同浓度（0、25、50、100 μmol/L）将氟[¹⁹F]HX-01 加入细胞孔内，每个浓度组设 12 个复孔，并且对应不同的氟[¹⁹F]HX-01 浓度组分别另取 3 个孔加入 0.5% DMSO 作为 DMSO 对照组（因 DMSO 对细胞具有毒性作用，故设立此组排除 DMSO 对细胞存活率的干扰），每孔均含 100 μL 培养基。另外向 3 个空孔中仅加入培养基作为空白对照组（control check，CK）。分别在 0、24、48、72 h 时取每个药物浓度组对应的 3 个复孔和 DMSO 组进行 CCK-8 检测。小心吸去待检测孔内的培养基，每次测量前重新加入含 6 μL CCK-8 试剂的 100 μL 无血清培养基，37 ℃、5% 的二氧化碳培养箱内孵育 4 h，4 h 后，使用酶标仪检测各孔中 450 nm 下的光吸收值（optical density，OD）。根据 OD₄₅₀ 计算细胞存活率，存活率=（该浓度时间点组 OD₄₅₀–空白对照组平均 OD₄₅₀）/（0 μmol/L 细胞对照组 0 h OD₄₅₀–空白对照组平均 OD₄₅₀）×100%。实验重复 3 次，结果取平均值。

细胞毒性实验中 3 种细胞培养、接种及测量方法，与细胞增殖抑制实验处理相同，区别在于：① 每孔接种细胞数为 1×10⁵ 个/mL。② 以不同浓度（0、5、10、20，50、100 μmol/L）氟[¹⁹F]HX-01 作用 48 h 后进行 CCK-8 法检测。③ 3 种细胞每组浓度设 3 个复孔。④ 孵育细胞所用培养基仅含 0.5% 小牛血清，目的是在保证细胞营养补给的情况下，利于测量氟[¹⁹F]HX-01 对细胞的毒性作用。

对于细胞增殖抑制实验，比较的是同种细胞在不同氟[¹⁹F]HX-01 浓度、同一作用时间点的细胞存活率；对于细胞毒性实验，比较的是不同细胞在同一氟[¹⁹F]HX-01 浓度及作用时间点的细胞存活率。

2.5. 统计方法

统计数据均以均数±标准差表示，采用 SPSS 17.0 统计分析软件进行单因素方差分析比较细胞的存活率，当 P<0.05 时，认为差异具有统计学意义。

3. 结果

3.1. [¹⁹F]HX-01 的合成及鉴定

3.1.1 [¹⁹F]HX-01 的合成　利用对甲基苯磺酰基保护的三氟丙醇与小檗红碱在碳酸铯的催化下反应，即可制备[¹⁹F]HX-01，如图 1 所示。该合成方法简便，便于分离，共得到产品氟[¹⁹F]HX-01 166 mg，产率 40%。

图 1.

Synthesis chart of fluoro[¹⁹F]HX-01

氟[¹⁹F]HX-01 的合成线路图

3.1.2 ¹H NMR 图谱　氟[¹⁹F]HX-01的¹H NMR 表征数据如下：¹H（400 MHz，DMSO-d₆） δ 9.79（s，1 H），8.95（s，1 H），8.21（d，J=9.1 Hz，1 H），8.00（d，J=9.1 Hz，1 H），7.80（s，1 H），7.10（s，1 H），6.18（s，2 H），4.95（t，J=6.3 Hz，2 H），4.80（t，J=5.9 Hz，1 H），4.68（t，J=5.9 Hz，1 H），4.41（t，J=6.4 Hz，2 H），4.06（s，3 H），3.21（t，J=6.3 Hz，2 H），2.28（ddt，J=25.8，12.4，6.2 Hz，3 H），如图 2 所示。

图 2.

¹H NMR spectrum of fluoro[¹⁹F]HX-01

氟[¹⁹F]HX-01 的 ¹H NMR 图谱

3.1.3 质谱　电喷雾电离-质谱（electrospray ionization-mass spectrum，ESI-MS）（m/z）结果显示为：382.1 [M]⁺，如图 3 所示，即鉴定结果测定氟[¹⁹F]HX-01 的质谱的分子离子峰为 382.1，与其化学结构式计算理论值一致，说明所得产物为目标化合物氟[¹⁹F]HX-01。

图 3.

Mass spectrum of fluoro[¹⁹F]HX-01

氟[¹⁹F]HX-01 的质谱图

3.2. 氟[¹⁹F]HX-01 在细胞内定位分布特性

利用氟[¹⁹F]HX-01 分子结构核的自发荧光，于 488 nm 激发波长，用荧光显微镜观察人肝癌细胞 HepG2、SMMC-7721 和人正常肝细胞 HL-7702 摄取氟[¹⁹F]HX-01 及其在细胞内的定位分布特性。如图 4 所示，氟[¹⁹F]HX-01 在人肝癌细胞 HepG2、SMMC-7721 和人正常肝细胞 HL-7702 内显示不同的细胞内荧光信号分布特征。以低浓度 25 μmol/L 氟[¹⁹F]HX-01 孵育 1 h，氟[¹⁹F]HX-01 首先聚集在 HepG2、SMMC-7721 细胞线粒体内，而 HL-7702 细胞内几乎看不见荧光信号；当浓度调整为 50 μmol/L 孵育 1 h，HepG2、SMMC-7721 线粒体内的荧光信号明显增强，而 HL-7702 仍然未见明显荧光信号；当浓度升高到 100 μmol/L 孵育 1 h 时，氟[¹⁹F]HX-01 对 HepG2、SMMC-7721 的线粒体膜和核膜显示出很强的穿透能力和破坏性影响，并可进入细胞核内，而正常肝细胞 HL-7702 内仅隐约可见微弱的荧光信号。以上研究结果显示：氟[¹⁹F]HX-01 对人肝癌细胞 HepG2、SMMC-7721 较人正常肝细胞 HL-7702 具有更高的选择性，而且氟[¹⁹F]HX-01 首先在人肝癌细胞线粒体内聚集，随着药物浓度的增高，氟[¹⁹F]HX-01 逐渐往细胞核聚集；而即使在较高氟[¹⁹F]HX-01 浓度下（100 μmol/L），人正常肝细胞 HL-7702 内仅见微弱的荧光信号。

图 4.

Fluorescence images of three types of cells in different concentrations (×40)

不同浓度下三种细胞荧光图像（×40）

3.3. 氟[¹⁹F]HX-01 对细胞的增殖抑制及毒性作用

如图 5 所示，氟[¹⁹F]HX-01 在对人肝癌细胞 SMMC-7721、HepG-2 以及人正常肝细胞 HL-7702 三种细胞的增殖抑制上具有剂量依赖效应。各给药组的细胞存活率均明显降低，且随着氟[¹⁹F]HX-01 浓度的增加和作用时间的延长，细胞存活率下降更明显。三种细胞在相同的药物作用时间点，随着氟[¹⁹F]HX-01 浓度的增加，细胞增殖抑制率均随之增加；同一浓度，随着氟[¹⁹F]HX-01 作用时间的延长，细胞增殖抑制率亦增加，P<0.05，差异有统计学意义。

图 5.

Inhibition of fluoro[¹⁹F]HX-01 to proliferation of three type cells

氟[¹⁹F]HX-01 对三种细胞增殖抑制图

而针对氟[¹⁹F]HX-01 对三种细胞的毒性作用，如图 6 所示，在低浓度药物（5、10 μmol/L）用药 48 h 时，氟[¹⁹F]HX-01 对人正常肝细胞 HL-7702 无明显毒性作用，对人肝癌细胞 SMMC-7721、HepG2 表现为轻度毒性，且对 HepG2 细胞作用更加明显，P<0.05，差异有统计学意义。随着药物浓度的增加，氟[¹⁹F]HX-01 对人肝癌细胞 SMMC-7721、HepG2 具有明显毒性作用，对人正常肝细胞 HL-7702 亦逐渐表现出毒性作用。细胞毒性实验结果表明，氟[¹⁹F]HX-01 在低浓度时，对人正常肝细胞无明显毒性，对人肝癌细胞具有轻度毒性作用，且对 HepG2 细胞毒性作用更强。在高浓度时，氟[¹⁹F]HX-01 对人正常肝细胞及人肝癌细胞均表现出毒性作用，但对人肝癌细胞毒性作用更加明显，P<0.05，差异有统计学意义。

图 6.

Cellular cytotoxicity of fluoro[¹⁹F]HX-01 to three types of cells

氟[¹⁹F]HX-01 对三种细胞的毒性作用

4. 讨论

恶性肿瘤是严重威胁人类健康，并导致死亡的主要原因。其疗效取决于建立在早期诊断、准确分期及早期监测治疗反应基础上作出的合理选择手术、化疗、放疗、生物治疗或联合治疗方案的有效决策。

¹⁸F-2-氟-2脱氧-D-葡萄糖（fluorine-18 fluoro-deoxyglucose，¹⁸F-FDG）PET 肿瘤显像，已在肿瘤的早期诊断、分期、监测治疗反应等方面发挥重要作用。然而，¹⁸F-FDG 不是肿瘤特异性显像剂，炎症、感染性病变均可高摄取 ¹⁸F-FDG，从而导致假阳性。高分化腺癌，如前列腺癌、肝癌等摄取 ¹⁸F-FDG 低或不摄取，则可导致假阴性。¹⁸F-FDG PET 肿瘤显像诊断的假阳性和假阴性问题是临床肿瘤诊断及鉴别诊断中亟待解决的世界性难题^[12]，进一步开发新型 PET 肿瘤靶向分子显像药物，对解决目前 ¹⁸F-FDG PET 肿瘤显像存在的难题具有重要价值。

越来越多黄连素及其衍生物体外抗癌研究表明黄连素及其衍生物具有广谱抗癌活性^[3-8]、多功能抗肝癌靶向性^[11]和安全性^[13-14]，可能成为有前途的抗癌药物。黄连素及其衍生物分子结构中有亲脂性的季氨氮基团，致其可穿过细胞膜进入细胞。它还可电离为+1 价的阳离子，这可能是其在肿瘤细胞跨膜电位差（Δψm）驱动力作用下，选择性聚集在肿瘤细胞线粒体内的结构基础^[15]。

课题组前期用正电子核素 ¹⁸F 标记黄连素衍生物（放射性氟[¹⁸F]HX-01），完成了兔 VX2 肌肉肿瘤模型PET显像，获得了肿瘤的高对比度影像^[9-10]。

结合近年的系列研究发现：黄连素及其衍生物可选择性诱导人肝癌细胞死亡，但对人的正常肝细胞没有细胞毒性，表明黄连素及其衍生物具有肝癌靶向细胞毒性，有可能成为有前途的多功能抗肝癌药物^[11]。因此，我们设想氟[¹⁸F]HX-01 在生物活体内可能具有肝癌靶向性。

本研究根据氟[¹⁹F]HX-01 自发荧光特性，首先采用荧光显微镜观察氟[¹⁹F]HX-01 在人肝癌细胞 SMMC-7721、HepG2 及人正常肝细胞 HL-7702 中的定位。发现氟[¹⁹F]HX-01 对人肝癌细胞 HepG2、SMMC-7721 较正常肝细胞 HL-7702 具有更高的选择性，而且氟[¹⁹F]HX-01 首先在人肝癌细胞 SMMC-7721、HepG2 线粒体内聚集，这与 Serafim 等^[16]研究证明黄连素在低浓度时（12.5～50 μmol/L）聚集在肿瘤细胞线粒体，而在高浓度时（>50 μmol/L）黄连素逐渐聚集在细胞核中相符。另外黄连素衍生物靶向肿瘤细胞可能涉及多靶点、多通路，具有多功能肿瘤靶向性。因此本文通过 CCK-8 法测定氟[¹⁹F]HX-01 对人肝癌细胞株 SMMC-7721、HepG2 和人正常肝细胞 HL-7702 的增殖抑制及毒性作用，表明氟[¹⁹F]HX-01 在对 3 种细胞的增殖抑制上具有剂量依赖效应；另外本文研究结果表明，氟[¹⁹F]HX-01 在低药物浓度时，对人正常肝细胞 HL-7702 无明显毒性作用，对人肝癌细胞 SMMC-7721、HepG2 表现为轻度毒性；在高浓度时，氟[¹⁹F]HX-01 对人正常肝细胞及人肝癌细胞均表现出毒性作用，但对人肝癌细胞毒性作用更加明显。这与早期报道相符合：黄连素在低浓度时主要表现出细胞抑制作用而不表现细胞毒性作用^[16]；在多项临床试验药物浓度作用下，黄连素不具有细胞毒性作用^[17-18]。

综上所述，本研究合成新型氟化衍生物氟[¹⁹F]HX-01，将其用于比较人肝癌细胞 SMMC-7721、HepG2 与人正常肝细胞 HL-7702 的摄取差异、其在细胞内定位分布特性以及不同浓度氟[¹⁹F]HX-01 对肝癌细胞及正常肝细胞的增殖及毒性作用，验证了氟[¹⁹F]HX-01 对人肝癌细胞（SMMC-7721、HepG2）具有更高的选择性而对人正常肝细胞（HL-7702）毒性低。本实验作为体外研究结果可为后续进一步开展放射性氟[¹⁸F]HX-01 肝癌肿瘤模型动物 PET 显像奠定基础。课题组将开展最终目标为筛选、开发一类有完全自主知识产权的 PET 正电子多功能恶性肿瘤靶向性放射性新药的研究，这将对建立新型有效的肝癌 PET 分子显像方法、监测恶性肿瘤进展、早期评价抗肿瘤药物治疗疗效具有独特意义；对促进解决目前 ¹⁸F-FDG PET 临床肿瘤显像面临的世界性难题，具有一定的科学意义及应用价值。

Funding Statement

国家自然科学基金资助项目（30770603）；中央高校基本科研业务费专项资金（2082604184393）；四川省学术和技术带头人培养基金（JH2014051）