生物细胞三维打印技术与材料研究进展

Abstract

Three-dimensional (3D) bio-printing is a novel engineering technique by which the cells and support materials can be manufactured to a complex 3D structure. Compared with other 3D printing methods, 3D bio-printing should pay more attention to the biocompatible environment of the printing methods and the materials. Aimed at studying the feature of the 3D bio-printing, this paper mainly focuses on the current research state of 3D bio-printing, with the techniques and materials of the bio-printing especially emphasized. To introduce current printing methods, the inkjet method, extrusion method, stereolithography skill and laser-assisted technique are described. The printing precision, process, requirements and influence of all the techniques on cell status are compared. For introduction of the printing materials, the cross-link, biocompatibility and applications of common bio-printing materials are reviewed and compared. Most of the 3D bio-printing studies are being remained at the experimental stage up to now, so the review of 3D bio-printing could improve this technique for practical use, and it could also contribute to the further development of 3D bio-printing.

引言

三维（three dimension，3D）打印技术是利用光、热等外界输入，并配合打印材料的特性，将打印材料逐步固化、堆积成型，实现 3D 复杂结构的制造。目前 3D 打印技术不仅成为了工业制造领域的新型制造技术，同时为生物医学领域带来了新的研究思路与解决方案^[1]。生物 3D 打印技术在医学模型制造、活体细胞 3D 培养、药物测试开发等领域已经取得了一系列的研究成果，更有望为组织器官再生、临床修复治疗、器官移植等医学应用方向带来全新的方法突破。

与普通 3D 打印技术不同的是，生物细胞 3D 打印与细胞的功能和存活率密切相关。具体来说，相比普通 3D 打印技术，生物细胞 3D 打印包含了更多的复杂性，如需要了解打印过程对细胞活性、功能的影响，并研究打印方法对细胞溶液浓度、黏度的要求，以及掌握生物打印材料的设计。因此，生物细胞 3D 打印有着特殊的技术要求与设计思路。本综述着重调研了生物 3D 打印的打印方法和材料，对目前主流的打印方法进行了总结，并从打印方法和材料种类的选择进行了分析，为生物 3D 打印平台搭建以及相关领域的研究提供参考。

1. 生物 3D 打印方法

生物细胞 3D 打印技术利用医学成像技术如电子计算机断层扫描（computed tomography，CT）、核磁共振成像（magnetic resonance imaging，MRI）以及 3D 建模软件建立数字模型。细胞和生物材料依据该数字模型完成精确堆积，并最终形成形状复杂的 3D 细胞结构^[2]。这一技术的目的是在确保细胞的存活以及功能的前提下，形成具备生理功能的类细胞外基质的微结构或细胞结构。下面我们着重介绍近几年发展起来的生物 3D 打印方法，包括喷墨（inkjet）、挤出沉积（extrusion）、光固化成型（stereolithography）、激光辅助（laser-assisted）等方法^[3]，并对常用的生物 3D 打印材料进行总结，为进一步推动这一技术进入生产实用进行原理性分析并奠定理论基础。

1.1. 喷墨法

喷墨法也可被称作微滴法（drop-by-drop），通过喷出微滴形成 2D 细胞图案，层层叠加并最终形成 3D 细胞结构。该方法将可容纳细胞和生物材料的生物打印墨盒安装在三轴电控移动平台上，通过电控平台对微滴实现位移控制，完成 3D 结构制造^[4]。这一方法打印成本低、平台建设简便。其微滴的形成主要依靠热或者声波使材料滴落。其局限性体现在每一个微滴在到达位置后必须快速聚合，以便下一个液滴可以继续固定。这种快速凝胶的要求限制了可用材料的种类。同时，该方法使得细胞在打印过程中会受到热或者力的影响，一定程度上会对细胞的活性以及功能产生干扰。此外，喷墨法要求打印材料的黏度不能过低，一般要求高于 12 mPa/s，因此喷墨法的局限性还包括喷头易堵塞，而且液滴形状较难控制等^[5]。

喷墨法打印的优点是可以使用交联剂溶液作为支撑。近年来，喷墨法在打印血管状结构这一研究方向得到了较快的发展。2015 年，Christensen 等^[6]利用喷墨法的这一特点，打印出了具备水平和垂直方向的血管结构。在这一打印过程中，他们使用了生物相容性较高的海藻酸钠，采用纤维组织母细胞—海藻酸钠打印墨水，使打印过程具备了极高的细胞存活率。

1.2. 挤出沉积法

挤出沉积法将喷头固定在三轴电控移动平台上，通过加载压力可将打印材料从喷头挤出，并通过开关阀控制喷头的通断^[7]。其打印材料可由悬浮细胞与细胞外基质模拟材料（如琼脂、水凝胶等材料）混合产生。打印材料挤出到底板后，通过交联作用（crosslink）形成叠加，实现 3D 细胞结构搭建^[8]。类似的做法也有用多喷头的挤出法^[9]，按照一层热敏材料一层细胞的排序逐层打印，之后通过控制温度使热敏材料降解并只留下细胞，形成 3D 细胞结构。挤出沉积法需要满足以下几个条件：① 打印材料在沉积后能尽量维持形状并原位交联；② 材料与打印过程对细胞状态应当不产生影响或仅仅产生极小影响；③ 成型后支架材料的降解性质可控^[10]。

这一方法的特点是技术方法门槛低，平台架设所需时间短。其打印精度以及可行性主要取决于打印材料。一方面，由于打印材料在挤出、下落过程中有着变形问题，局限了最终成型的精度，使得其打印精度在数百微米级别。另一方面，这一方法使用的喷头极易堵塞，影响加工效率。目前对这一方法的研究重点是在打印材料的生物相容性与可打印性之间找到平衡点。为了进一步提高挤出沉积法的可打印性和结构稳定性，Markstedt 等^[11]于 2015 年制备了纤维素微纤丝以及海藻酸钠的复合打印墨水。同时，打印后的结构还可以在钙离子溶液中进一步固化。这一打印技术已实现软骨细胞打印，并已被证实可以用来打印网格状结构以及耳状结构。

1.3. 光固化成型法

光固化成型法基于液态光敏材料的光聚合原理，利用激光或投影光将液态光敏材料转变为固体。这一方法往往从底层开始固化，完成一层的固化后，成型平台竖直移动，由于光聚焦平面未变，因此可将另一层固化，直至每一层成型并最终得到 3D 结构^[12]。材料的光聚合原理是这一打印方法的基础，要求打印材料必须同时具备生物相容性以及光敏特性。大多数光敏树脂由于制备过程存在毒性以及不具备生物相容性，无法直接使用在这一场合。因此，生物光固化成型技术一般使用改造后具备光敏特性的水凝胶作为打印材料^[12]。此外，细胞在打印过程中需要避免长时间高温照射，而一定强度的紫外光在固化材料的同时可以满足这一条件^[13]。紫外光的照射通过数字光处理技术（digital light precessing，DLP）具备了图形化的功能，从而直接将细胞以及打印材料加工成型。最新的 DLP 技术的打印过程包括如下环节：首先，将含有光引发剂/光催化剂的高分子水溶液与细胞悬浮液混合，再通过 DLP 技术对每一层进行不同图样的“投影”，可以对每层的结构进行精确修饰；通过竖直方向的移动，最终加工出每一层的结构并累加形成 3D 结构。由于每一层图样的精度主要取决于投影光的精度，因此相比挤出法，光固化生物 3D 打印技术具备了更高的精度^[14]。

最近发表的文章表明，光固化成型技术可以利用商用投影仪，从而使其成本大大降低。Wang 等^[15]在 2015 年底发表的文章使用了商用投影仪，使整个系统的成本降低到 500 美元以内，并且具备了 50 μm 打印精度以及 85% 以上的细胞生存率。

1.4. 激光辅助生物打印

激光辅助生物打印方法是基于激光聚焦脉冲的原理工作的。标准的激光辅助打印系统包括脉冲激光器，负责吸收激光能量的吸收层（通常是玻璃层，同时覆盖金或铂层），生物样品层（如细胞或混合水凝胶，在液体环境中制备）以及最下层的接收基底^[16]。其工作过程是利用激光脉冲在吸收层上产生液泡，将细胞以及支架材料推到接收基底。激光辅助生物打印的分辨率受到许多因素的影响，如激光能量密度（每个单元输出的能量）、表面密度、基底湿度、基底和吸收层气隙以及生物样品层的厚度和黏度等^[17]。其方法适合多种生物样品黏度（1～300 mPa/s），可以在不影响细胞活性和功能的情况下对哺乳动物细胞进行打印。

激光辅助法可以将高密度的细胞进行沉积（密度可达约 10⁸ 个/mL），并实现对每个细胞的精确控制，其控制激光的频率可以达到 5 kHz 以上^[18]。激光辅助法的特点是由于激光并不直接接触细胞，因此对细胞的伤害较小（存活率可达 95% 以上）。其精度大约可以达到 30～100 μm，同时不存在喷口堵塞的问题。但是其存在打印速度较慢，以及打印材料制备较为复杂、成本高昂等局限。如表 1 所示，列举了上述4种方法的精度以及相应的优缺点对比。

表 1. Comparison of four types of 3D bio-printing.

四种生物 3D 打印的优缺点对比

工艺	精度	优点	缺点
喷墨法	中（50 μm 级）	打印机与材料价格低，易于制备，打印速度较快 （可达每分钟 1 万滴）	细胞密度低（一般小于 106 个/mL），黏度必须 小于 12 mPa/s，细胞会受热或机械力，喷头易 堵塞，无法精确控制液滴形状，精度受局限， 加工表面粗糙。
挤出沉积法	低（100 μm 级）	过程无毒，加工幅面大，样品制备容易，系统架 设简单，成本低廉，细胞存活率可达 90% 以上。 黏度范围大（最高可达 107 mPa/s 以上）	精度较低，喷头易堵塞，加工表面粗糙。
光固化成型法	中（50 μm 级）	成本较低，样品制备容易，准备时间短，系统架 设简单。光成型的化学键力学性能好。	适用水凝胶种类较少，光引发剂有一定毒性， DLP 方法加工幅面受限，加工过程中结构 易变形。
激光辅助法	较高（30～70 μm 级）	精度高，可对高密度细胞样品中数个细胞进行 位置控制，控制频率高（5 kHz 以上）且伤害小 （存活率 95% 以上），样品黏度范围大（1～ 300 mPa/s）	样品制备复杂，成本相对高，原位打印难度 较大。

2. 生物细胞 3D 打印材料

材料的黏度、成型方式很大程度上影响了上述打印方法的适用范围。随着生物材料的多样性和适用范围逐步提高，用于 3D 打印的生物材料需要经过一系列科学的选择和设计^[19]。材料必须具备合适的交联机制来完成所需结构体成型，而且打印材料必须具备稳定的生物相容性和合适的力学性能。其中，力学性能需要保证诸如孔隙率、内部通道以及网络等重要结构不易破坏。同时，材料还需具备可靠的生物相容性，有利于促进细胞生长形成具有一定功能的组织。因此，对生物打印材料的选择，必须要考虑可打印性、生物相容性、可降解性、产生的副作用、材料结构、机械性质以及材料仿生性能等较多方面。

2.1. 打印材料种类

细胞活性以及生存率是在细胞与生物材料混合并成型中面临的主要问题。生物 3D 打印材料经历了非生物相容性材料到生物相容性材料、非降解型材料到降解型材料的发展过程。目前，生物 3D 打印所用材料主要可以分为天然聚合物（natu-rally derived polymer）和人工合成高分子（synthetic molecules）两种来源^[20]。其中，天然聚合物是指来源于动物或人体组织的聚合物，如海藻酸盐水凝胶（alginate），基质胶（matrigel），胶原（collagen），壳聚糖（chitosan）以及纤维蛋白等^[21]。人工合成高分子则是指利用化学手段合成的高分子聚合物，譬如聚乙二醇（polyethylene glycol，PEG）或丙烯酰胺水凝胶等^[22]。天然聚合物的优点在于其化学特性更接近人体的细胞外基质特性，天生具有较高的生物相容性。而合成材料优点则在于其物理性质更容易调整以适用于不同的应用场合，但这些合成材料的缺点主要是相对较差的生物相容性以及有一定的细胞毒性，同时降解性能较差且在降解过程中机械性能会受到损失。即便如此，合成材料由于其物理性质在合成过程中可以得到很好地控制而被广泛地使用^[23]。

在以上这些打印材料中，水凝胶是最常用的材料之一，包括天然的海藻酸盐水凝胶以及人工合成的聚乙二醇、丙烯酰胺等。水凝胶是一种聚合的网络结构，可以吸收、保存大量的水，具有生物相容性、生物可降解性^[24]，因此被广泛用在生物 3D 打印中^[25]。水凝胶具有利于细胞增殖、细胞间的黏合扩展及形成一定器官构型的特点，是作为细胞外基质的优秀材料^[26]。作为打印材料，水凝胶与细胞混合液的机械性能需要经过调控，以达到同时满足打印分辨率及维持细胞活性的要求。此外，水凝胶在成型后要寻求合适的方法进行交联以维持打印结构的形貌^[27]。以海藻酸盐水凝胶为例，在挤出沉积法打印中，将一定比例的海藻酸钠盐溶于水后与细胞悬浮液混合，置于打印针管内。之后，在压力或者重力作用下，海藻酸钠盐溶液会从针孔流出。通过对针孔通断以及针孔位置的控制，即可以控制海藻酸钠盐流出的精确位置以及其用量。在外部提供交联剂（如钙离子溶液），即可依靠海藻酸钠盐的交联固化过程，实现对细胞位置的固定并完成细胞打印。聚乙二醇以及丙烯酰胺则是与光引发剂溶于去离子水后，通过紫外照射完成固化，因此经常被用于光固化成型法中。

2.2. 打印材料选择

生物细胞 3D 打印的材料选择应当重点考虑以下几方面性能^[28]：① 可打印性，指材料本身的可处理性以及沉积性能，这些性能受到材料本身的黏度、凝胶作用以及流变特性等性质影响。② 生物相容性，即材料应该不包含或少包含有毒性的小分子或会引起不良反应的成分。③ 降解速率和副作用，其中降解速度可以配合细胞本身产生细胞外基质的形成速度，同时降解过程中应当避免有毒副作用的产生。④ 材料结构与性能，即所选材料本身的力学性能应当符合所需的环境。⑤ 材料仿生性能，材料应当能模拟并满足所需组织的静态以及动态力学性能。

如表 2 所示，列举了常用的几种打印材料的材料特性。此外，在实际使用中，不一定只选用单独一种打印材料，也可以选用两种以上材料通过产生多网络交联形成具有不同特性的材料以达到更广的适用范围。

表 2. Characteristics of several materials for bio-printing.

几种常用打印材料特性

打印材料	来源	常用交联方式	特点和应用
海藻酸盐水凝胶	天然	添加离子溶液形成离子键交联	具有较高生物相容性以及原位成型能力[11]
基质胶	天然	温度控制成型	可提供细胞外基质，能与细胞混合后培养 于所需的组织结构中[29]
聚乙二醇	人工合成	通过光引发剂以及光催化剂产 生共价键交联	用于光固化成型 3D 打印并可实现细胞直 接成型[13]
丙烯酰胺	人工合成	通过光引发剂以及光催化剂产 生共价键交联	丙烯酰胺单体以及相应光引发剂存在一定 毒性，适用于成型后再培养细胞

3. 发展趋势

本文介绍了近年来主要的生物细胞 3D 打印技术方法和材料，重点阐述了喷墨法、挤出沉积法、光固化成型法以及激光辅助法的原理以及工作过程，并比较了各自的优势和局限性。目前，打印过程仍需要解决速度、精度、存活率与细胞活性等问题，而打印材料的选择以及成型仍有较大发展空间，包括进一步提高生物相容性、降解性能、力学性质以及成型过程的可控性等。具体来说，就是要提高材料的生物相容性和打印过程的结构可塑性，并且要进一步研究打印后的组织器官随着时间变化而产生的结构、力学性能变化。可以预计，今后生物细胞 3D 打印技术的发展一方面将着眼于打印材料从单一材料向着多种材料复合的方向发展，而另一方面打印技术正从实验室离体打印向着原位打印发展。另外，在基础研究上，生物细胞 3D 打印的发展还需要进一步阐明细胞与打印材料互相作用机制。

Funding Statement

国家自然科学基金资助项目（61603002）；安徽医科大学博士科研资助项目