在细胞水平上调控骨重建的相关研究进展

Abstract

Bone remodeling requires an intimate cross-talk between osteoclasts and osteoblasts and is tightly coordinated with regulatory proteins that interact through complex autocrine/paracrine processes. Osteocytes, bone lining cells, osteomacs and vascular endothelial cells also regulate bone remodeling in the basic multicellular unit (BMU) via cell signaling networks of ligand-receptor complexes. In addition, through secreted and membrane-bound factors in the bone microenvironment, T and B lymphocytes mediate bone homeostasis for osteoimmunology. Osteoporosis and other bone diseases occur because multicellular communication within the BMU is disrupted. This review focuses on the roles of the cells in the BMU and the interaction between these cells and the factors involved in regulating bone remodeling at the cellular level. Understanding the process of bone remodeling and related genes could help us to lay the foundation for drug development against bone diseases.

引言

骨组织是一种兼具稳态和动态平衡特点的结缔组织。在生物化学方面，它被定义为无机元素和有机基质的混合物。为了保持其结构的完整性，维持体内矿物质平衡，骨组织不断地进行塑造、成形和修复这一系列的重建过程。在成年后，骨重建主要是调节骨结构和功能的动态过程。骨重建是一个涉及破骨细胞和成骨细胞这两类关键细胞相互转化的复杂、严格的调控过程^[1]。破骨细胞是主管骨吸收功能的细胞，在骨骼的形成和骨密度的调节中发挥了重要作用。成骨细胞是特殊的骨形成细胞，能合成骨基质，调节矿化并最终分化为骨细胞或骨被覆细胞。机体内众多局部和系统的因子高度调控着破骨细胞和成骨细胞之间的相互作用，以维持骨内平衡^[2]。骨重建过程中的平衡无论是偏向成骨细胞还是破骨细胞，都可能引起如：骨量减少、骨质疏松和骨硬化病等临床疾病。骨重建的确切机制现在还不是很清楚。因此，本文主要阐述与进一步探讨参与骨重建的细胞、其内在分子机制，以了解骨重建过程和相关基因，有助于对骨质疏松等骨科疾病的药物开发奠定基础。

1. 骨重建单位

近期相关研究表明，识别和利用骨重建中分泌的“偶联因子（coupling factors）”可以调控基础多细胞单位（basic multicellular unit，BMU）内相关细胞的暂时性激活和功能，有效缩短骨重建的周期。本文则着重强调 BMU 中的细胞作用，以及在细胞水平参与调节骨重建的细胞和因子之间的相互作用。

骨重建是通过功能相同的细胞——BMU 感受力学刺激来对骨的生长或吸收进行调控的过程。BMU 包括破骨细胞、成骨细胞、骨细胞、骨被覆细胞和血管内皮细胞。

骨重建过程是一个多种细胞参与的过程，信号传导和细胞间交流在这个过程中起着重要作用。细胞因子（cytokine）是一类由各种免疫细胞和非免疫细胞产生的具有生物活性的小分子糖蛋白，负责参与介导细胞间的相互作用。细胞因子包括趋化因子、干扰素、白细胞介素、肿瘤坏死因子和淋巴因子等，每一种细胞因子作用于特定的靶细胞，产生不同或相同的生物学效应^[2]。如图 1 所示，在骨重建过程中，涉及到多种细胞因子的参与和相互作用，而骨细胞、破骨细胞、成骨细胞三者之间的关系最为重要。这些细胞因子中，硬骨素（sclerostin）是硬化性骨化病（sclerosteosis）基因所表达的一种蛋白质产物。近年来，研究者发现，sclerostin 能调节骨细胞分化成为成骨细胞^[3-4]。而核因子 κB 受体活化因子配体（receptor activator of nuclear factor kappa-B ligand，RANKL）能在成骨细胞、T 淋巴细胞和内皮细胞内翻译表达，参与破骨细胞的形成，并与破骨细胞及其前体上的核因子 κB 受体活化因子受体（receptor activator of nuclear factor kappa-B，RANK）连接并发挥重要作用^[5]。红细胞生成素诱导的肝细胞受体（Erythropoietin-producing hepato-cellular，Eph）及其配体（Ephrin）是酪氨酸激酶受体家族成员之一，破骨细胞与成骨细胞之间的 Eph-Ephrin 双向信号系统在骨重建中发挥重要作用。它们之间的联系体现为：破骨细胞上存在 EphrinB2 配体，成骨细胞前体上存在 EphB4 受体，两者通过细胞直接接触，在成骨细胞内产生正向信号的同时，在破骨细胞内产生反向信号，从而起到调节成骨细胞与破骨细胞之间相互平衡的作用^[6]。另外，骨组织周围毛细血管可为骨组织提供氧气、营养素和激素等，如图 1 红色箭头所示，并且其中的 T 淋巴细胞活化会产生 RNAKL、肿瘤坏死因子-α （tumor necrosis factor α，TNF-α）等破骨细胞生成因子，参与调节骨重建，如图 1 绿色箭头所示。

图 1.

BMU of bone remodeling

骨重建的基础多细胞单位

骨重建周期包括启动阶段、逆转阶段和终止阶段。开始的启动阶段，包括破骨细胞前体的募集、分化和成熟以及骨吸收的活化和维持。之后会出现一个逆转阶段，即破骨性骨修复被抑制和破骨细胞凋亡，而成骨细胞开始归巢和分化。逆转阶段是破骨细胞激活到成骨细胞激活的过渡。最后阶段，也叫终止阶段，是成骨细胞介导的骨形成过程^[7]。这一阶段持续时间最长，因为骨形成比骨吸收慢，其中涉及新骨的形成、矿化以及成骨细胞的晚期分化。骨重建过程的时间会因在机体内发生的位置不同而有所不同，例如松质骨的骨重建周期平均约 200 d，其中终止阶段占据整个周期的 3/4 时间，而皮质骨的重建周期相较松质骨短的原因就在于其终止阶段的持续时间较短。

2. 破骨细胞

破骨细胞是一类多核巨细胞，是由单核细胞、巨噬细胞家族的单核祖细胞融合而成，这一融合过程被称作破骨细胞的形成^[2]。破骨细胞一般位于骨内膜表面哈弗斯管内和骨外膜表面的骨膜下，在骨组织中数量通常极少，只有 2～3 个/μm³。破骨细胞有运动期和重吸收期两种功能状态，并且在不同的分期呈现出不同的细胞形态。运动期的破骨细胞是扁平的无极化细胞，重吸收期的破骨细胞则呈圆顶状并且伸出板状伪足。这些具有被称为板状伪足的毛样突起和包含肌动蛋白的伪足小体复合物的破骨细胞，通过板状伪足来进行移动和扩散。在到达重吸收位置后，破骨细胞通过细胞骨架重组极化，最后导致皱褶缘、封闭区域、功能分泌域和基底侧膜等一系列膜域的形成。其中封闭区域是破骨细胞的一种特殊结构，其将酸性再吸收的环境与细胞的其他区域分开，形成一个器官免干扰区域^[8]，而褶皱缘和封闭区域只在非运动的重吸收期的破骨细胞中被发现。

2.1. 在 BMU 中破骨细胞分化的调节

破骨细胞的分化和融合需要大量破骨细胞生成因子并经多步骤调节。造血干细胞是一组骨髓单核细胞，能够生成破骨细胞前体。这些细胞的进一步分化需要骨基质细胞、成骨细胞或 T 淋巴细胞产生的因子共同作用^[9]。巨噬细胞集落刺激因子（macrophage colony stimulating fact，M-CSF）和 RANKL 这两个因子是促进破骨细胞生成所必要的。

M-CSF 是由成骨细胞和干细胞产生的，在巨噬细胞成熟、与破骨细胞前体细胞上的跨膜糖蛋白受体酪氨酸激酶受体（transmembrane glycoprotein-receptor tyrosine kinase，c-Fms）结合并在促进其生存和增殖中起重要作用。通过 c-Fms 受体介导的信号转导包括细胞外调节蛋白激酶（extracellular regulated protein kinases 1/2，ERK1/2）和磷脂酰肌醇 3 激酶（phosphatidylinositol 3 kinase，PI3K）/蛋白激酶 B（protein kinase B，PKB）等多重途径。M-CSF 能在早期激活骨肉瘤致癌基因转录因子（c-Fos）和造血转录因子（PU.1）。缺少 M-CSF 或 PU.1 的小鼠会缺乏破骨细胞和巨噬细胞，与此同时灭活 c-Fos 将阻止破骨细胞生成并导致骨硬化表型的表达^[10]。有趣的是，骨硬化（基因型为 op/op）小鼠的突变导致 M-CSF 缺乏，最后却能恢复破骨细胞分化的功能。这提示我们可能还有其他因素能够代偿 M-CSF 缺乏。

RANKL 可由成骨细胞、T 淋巴细胞和内皮细胞表达，在破骨细胞的形成和连接破骨细胞及其前体上的 RANK 受体时发挥重要作用^[11]。通过 RANKL 刺激表达 M-CSF 的前体细胞，使其分化为破骨细胞表型，这些细胞之后将会表达一些破骨细胞关键标记物，如抗酒石酸酸性磷酸酶（tartrate resistant acid phosphatase，TRAP）。在 M-CSF 和 RANKL 进一步地刺激下，破骨细胞前体融合形成多核细胞并开始表达更多像降血钙素受体和组织蛋白酶 K 这样的特殊破骨细胞标记。RANKL 和 RANK 的连接依赖于这两个分子间的聚合作用，RANKL 的激活作用可以被可溶性诱导的骨保护蛋白（osteoprote-gerin，OPG）受体所抵消^[12]。这个受体能阻止 RANKL 和 RANK 的结合，并抑制破骨细胞的分化。RANKL 的信号传递取决于 RANK/OPG 和 RANK 在破骨细胞前体中的表达量。因此通过生成 RANKL 和 OPG，成骨细胞能够控制骨生成和骨重吸收。

除此之外，还有一些与破骨细胞相关的重要调节因子，例如其中的核转录因子（nuclear factor-κB，NF-κB），作为一个转录因子蛋白家族，包括 5 个亚单位：Rel（cRel）、p65（RelA，NF-κB3）、RelB、p50（NF-κB1）、p52（NF-κB2），其中以 p65 和 p50 组成的二聚体形式最为常见。NF-κB 参与多种基因的转录调控，与许多重要的病理生理过程密切相关。位点特异的 NF-κB 抑制蛋白（inhibitor of NF-κB，IκB）的磷酸化对于激活 NF-κB 有重要意义。IκB 激酶（IκB kinase，IKK）能磷酸化 IκB，为进一步了解 NF-κB 在骨重建分子水平的功能和调控提供了线索。其由两个催化亚基 α、β 和一个调节亚基 γ 组成，其中 β 亚基可能通过降解 IκB 来介导 NF-κB 的活化。IKKα 参与 NF-κB 前体的转化和 p65 的磷酸化。

在静息状态下，NF-κB 与其抑制蛋白 IκB 结合，驻留在胞浆内。在 RANK 与 RANKL 结合后激活，其胞浆部分与泛素连接酶（TNFR-associated activalor factors 6，TRAF6）结合，启动细胞内的信号级联反应。TRAF6 能激活 IKK，活化的 IKK 再催化 IκB 磷酸化，并使其被蛋白酶体降解，释放出 NF-κB。游离的 NF-κB 的 p50、p65 二聚体由胞浆转移至细胞核中与脱氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）特异区域结合，启动破骨细胞特异性基因的转录。在破骨细胞中 NF-κB 信号转导通路的异常激活将破坏骨重建，并导致溶骨性疾病发生^[13]，如图 2 所示。

图 2.

RANK/RANKL signalling pathway in osteoclasts

破骨细胞内 RANKL 信号通路

虽然 RANKL 已经被证实是破骨细胞分化的重要信号，但是协同刺激途径也是不可或缺的。活化 T 细胞核因子（nuclear factor of activated T cells，NFAT）也在破骨细胞分化中起重要作用^[14]。RANKL 通过促进钙振荡来激活 NFAT。这一过程是通过免疫球蛋白样受体的协同刺激和承接分子的作用实现的。免疫球蛋白样受体包括破骨细胞相关的受体（osteoclast associated receptor，OSCAR）和髓细胞触发表达受体（triggering receptor expressed myeloi-dcells，TREM），承接分子则包含免疫受体酪氨酸激活基序（immunoreceptor tyrosine-based activation motifs，ITAM motifs）。这一信号级联反应激活磷脂酶 Cγ（phospholipase Cγ，PLCγ）和下游的钙离子，介导活化 T 细胞核因子胞 1 蛋白（nuclear factor of activated T-cells，cytoplasmic 1，NFATc1）在细胞核内的转移、翻译及自我扩增。除此之外，钙调蛋白激酶（calcium/calmodulin-dependent protein，CaMK），作为下游钙离子的主要调节介质，在 RANKL 介导的破骨细胞分化和骨再吸收中起重要作用^[15]。

2.2. 破骨细胞在骨重建中的作用

虽然破骨细胞在骨重建里的基础功能是骨的重吸收，但同时也有调节骨形成的功能。在破骨细胞重吸收并与成骨细胞相接触时，破骨细胞通过分泌因子来调节骨形成和基质衍生因子的释放。

破骨细胞的骨重吸收功能是调节骨形成的一种方式。吸收池本身的分布是介导骨形成的一个重要因素。在缺乏破骨细胞时，成骨细胞可能识别部分吸收陷窝，如 TRAP 沉积。TRAP 沉积能被破骨细胞再吸收，以及进行胶原转换^[16]。成骨细胞表达的 RANKL 不仅能直接激活破骨细胞的骨重吸收作用，也能作用于成骨细胞的骨形成。

破骨细胞在骨重吸收时，能够释放调节成骨细胞骨形成的骨基质衍生因子。在骨基质沉积和作用于成骨细胞时，成骨细胞释放这些因子来促进骨形成；然而也可能是破骨细胞在吸收骨基质时，加工骨基质衍生因子并调节其释放来作用于成骨细胞^[17]。这些因子包括骨形成蛋白（bone morphoge-netic proteins，BMPs），胰岛素样生长因子（insulin like growth factor system，IGFs）：IGFs I 和 IGFs II，以及转换生长因子-β（transforming growth factor-β，TGF-β）。

然而，在有骨硬化病的患者和小鼠中，破骨细胞的重吸收作用并不是成骨细胞骨形成的必要条件。因为在具有较多破骨细胞的骨硬化病情况下，虽然破骨细胞功能受损，但是仍然有大量的有功能的成骨细胞，这不仅表明破骨细胞数量在骨形成中比它的功能活性更重要，也表明破骨细胞并不是骨形成的必须条件^[18]。

破骨细胞调节成骨细胞的可能方式一直是一个令人感兴趣的课题，并且已经有大量的研究工作来识别这一对耦合因素表达的潜在靶点。鞘氨醇磷酸酯（sphingosine-1-phosphate，S1P）是由破骨细胞分泌的，它通过与成骨细胞上的受体结合可增强成骨细胞的迁移和生存，并上调 RANKL 生成。S1P 也能通过调节破骨细胞前体的迁移来直接作用于破骨细胞^[19]。肝配蛋白 B2 作为破骨细胞表达的膜结合配体，通过接触依赖的机制结合破骨细胞上的受体 EphB4，两者相互作用促进成骨细胞分化和骨形成。肝配蛋白和 Eph 的相互作用可以产生双向信号传导，由此提示 EphB4 作用于破骨细胞并抑制分化。

成熟破骨细胞能表达 EphrinB2，而成骨细胞前体表达 EphB4，于是我们推测在骨重建中 EphrinB2 和 EphB4 的相互作用可能调节骨吸收和骨形成之间的转化。最近，由破骨细胞表达的脑信号蛋白 4D 已被确定为一个偶联因子，它通过结合破骨细胞上的 Plexin-B1 受体，激活 RhoA 蛋白从而抑制骨的形成^[20]。

3. 成骨细胞

成骨细胞是唯一负责骨形成的细胞。它来源于具有分化为成熟成骨细胞潜能的间充质干细胞。成骨细胞分化分成四个阶段：前成骨细胞、成骨细胞、骨细胞和骨被覆细胞。当提供适当的刺激时，间充质干细胞能够分化为前成骨细胞。这些细胞在组织学上类似成骨细胞，并且在碱性磷酸酶染色中呈阳性；然而它们缺乏一些成熟的成骨细胞的特点，包括产生矿化组织的能力^[21]。当前成骨细胞形成成熟的成骨细胞时，呈现出立方形的形态和碱性磷酸酶强阳性。在骨形成活跃的位置，它们定植在骨表面。成骨细胞分泌 I 型胶原蛋白作为骨的基本构成材料。此外，它们生产非胶原蛋白，包括骨钙素（一种骨中特有的维生素k依赖钙结合小蛋白）和碱性磷酸酶来作用于矿物沉积。若敲除小鼠的碱性磷酸酶基因，小鼠生长受到抑制并在 3 周内死亡，组织检测显示小鼠矿化作用缺失，成骨细胞形态异常。这些研究可能表明碱性磷酸酶对成骨细胞的功能具有重要作用。

3.1. 在 BMU 中成骨细胞的调节

成骨细胞中调节骨形成的一个最重要的信号通路是 Wnt/β-catenin 信号通路^[2]。Wnt 配体与跨膜受体卷曲蛋白 frizzled 和低密度脂蛋白（low density lipoprotein，LDL）受体相关蛋白 5 或 6（LDL receptor related protein 5/6，LRP5/6）组成的受体复合物结合。在没有配体结合时，糖原合酶激酶-3（glycogen synthase kinase 3，GSK-3）、结肠腺瘤样息肉（adenomatous polyposis coli，APC）蛋白和支架蛋白 Axin 复合体使 β-链蛋白（β-catenin）磷酸化，继而导致其泛素化并在蛋白酶体中降解。当 Wnt 与其受体复合物结合时将激活蓬乱蛋白（dishevelled，DVL），并抑制 GSK-3 活性。这样 β-catenin 就不会被降解，从而转移到核内激活淋巴样增强因子（1ymphoid enhancer factor，LEF）和 T 细胞因子（T cell factor，TCF），介导与成骨细胞分化、作用、生存有关的目的基因转录，如图 3 所示。

图 3.

Canonical Wnt/β-catenin signalling pathway in osteoblasts

成骨细胞中 Wnt/β-catenin 信号通路

Wnt/β-catenin 途径的各种生理抑制剂的主要功能是阻止配体和受体复合物的形成。它们包括能与 LRP5/6 结合的 sclerostin 和 Dickoff-1（Dkk-1），和与 Wnt 结合的分泌型 frizzled 相关蛋白（Sfrp）。Wnt/β-catenin 通路在骨生物学中的重要性，在人类 LRP5 基因的突变中被突显出来。LRP5 突变引起的功能损失将导致骨质疏松症和假神经胶质瘤综合症，这是一种以早期出现骨质疏松症和失明为特点的常染色体隐性疾病^[22]。相反，突变引起的功能升高与高骨量相关。这些人类表型已经被复制到小鼠身上，由于改变成骨细胞增殖和功能，缺乏 LRP5 的小鼠表现为低骨量，而成骨细胞过度表达 LRP5 的小鼠表现为骨量增加。

其他重要的信号通路包括的 TGF-β 超家族的两个关键成员 TGF-β 和 BMPs，它们共同参与成骨细胞分化和骨形成^[23]。TGF-β 可以维持骨基质细胞形态和促进其生长，及对成骨细胞谱系的定型起重要作用。这是通过选择性的激活有丝分裂原激活蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPKs）和 Smad2/3 信号途径实现的。BMP 信号通路的激活也需要 Smad 蛋白家族激活及其后续转移至核内激活成骨基因转录。

3.2. 在骨重建中成骨细胞的作用

3.2.1 骨形成　成骨细胞的主要功能是骨形成。因此，成骨细胞在骨架形成起始阶段以及在持续的骨生长和骨重建过程中起重要作用。骨形成有两个不同的机制：膜内成骨和软骨内成骨。膜内成骨主要形成像颅骨这样的扁平骨和大部分的锁骨。由成骨细胞沉积于结缔组织预先留有的纤维层上，在此基础上逐渐形成由 I 型胶原蛋白组成的有机基质，再由磷酸钙填充入基质形成松质骨。相比之下，软骨内成骨能形成绝大部分骨。它涉及间质到软骨雏形的转化，然后在软骨被血管侵入、逐步分解的同时，成骨细胞沉积胶原基质并通过释放包含磷酸钙的小囊泡调节基质的矿化^[24]。矿化发生的确切机制目前尚不清楚，但人们认为碱性磷酸酶的活性在其中起着重要的作用。透明软骨在骺表面形成关节软骨，在骨干和骨骺连接处形成生长板，使长骨在生长期间延长长度。

3.2.2 成骨细胞的调节　除了成骨作用，成骨细胞在破骨细胞分化中同样发挥重要的作用。

成骨细胞通过破骨细胞在重吸收时释放的骨基质沉积因子调控破骨细胞生成，而分泌型因子则通过细胞间直接相互接触发挥作用，这与破骨细胞调节成骨细胞的方式相似。成骨细胞能产生 M-CSF，RANKL 和 OPG 等因子。正如上面所讨论的，这些因素对于破骨细胞形成和功能至关重要。

RANKL 是破骨细胞分化的主要细胞因子，而 OPG 作为诱饵受体控制 RANKL 激活破骨细胞的数量^[25]。除了调节破骨细胞分化之外，成骨细胞通过释放趋化因子控制破骨细胞前体运动到骨表面。两种骨的基质衍生趋化因子分别是骨钙素和 I 型胶原，均由成骨细胞产生，并在骨形成时储存在基质中。在破骨细胞骨重吸收时这些趋化因子被释放，从而吸引更多的破骨细胞前体转移到重建位点继续重吸收。骨被覆细胞也可能诱导基质释放趋化因子。单核细胞化学引诱物蛋白（monocyte chemoattractant proteins，MCP-1）是由成骨细胞和募集而来的破骨细胞前体产生。在破骨细胞上 MCP-1 受体的表达是由 RANKL 介导的，表明成骨细胞可以通过调节 RANKL 表达来控制 MCP-1 依赖的破骨细胞前体的募集。

有许多其他因子通过作用于成骨细胞间接调节破骨细胞生成。这样的可溶性因子包括甲状旁腺素（parathyroid hormone，PTH）、甲状旁腺激素相关肽（parathyroid hormone-related protein，PTHrP）、TNF-α，白介素-1 和 1，25-（OH）₂ 维生素 D₃ 等。这些因子作用于成骨细胞会增加 RANKL 的表达，从而增加破骨细胞分化。一些因子具有双重功能并且能够抑制成骨细胞产生 OPG。成骨细胞能够通过 PTHrP 旁分泌因子调节分化。PTHrP 是由前破骨细胞产生的，通过存在于成骨细胞上的 PTH1 受体刺激成骨细胞分化和抑制成骨细胞凋亡^[26]。因此 PTHrP 在调节破骨细胞生成和成骨细胞分化中具有双重作用。

4. 骨细胞

骨细胞是新生骨基质中的分化晚期成骨细胞。与成骨细胞相比，这些细胞体积更小，并且丢失了许多细胞器。骨细胞在新生骨基质陷窝内驻留较长时间并最终凋亡。骨细胞在空间上是彼此孤立的，但它们延伸出富含微丝骨架的丝状伪足，将彼此细胞之间以及在骨表面的骨被覆细胞和成骨细胞连接起来。有新证据表明，骨细胞的主要功能与骨结构的确定和维护有关。骨细胞作为机械传感器能将肌肉骨骼介导的机械输入转化为生物输出^[27]。微损伤（是骨基质的小缺陷，被视为骨骼病理条件）已被证明能启动骨重建。由于 RANKL 生成和破骨细胞的生成增加引起了骨重建水平升高，微损伤附近的骨细胞将会凋亡。最近的一项研究显示，骨细胞也能表达 RANKL，从而支持破骨细胞生成。在缺乏 RANKL 的小鼠骨细胞中特异地表达骨硬化表型，说明在骨重建时骨细胞可能是 RANKL 的主要来源。而膜结合的或可溶性的 RANKL 与破骨细胞的形成是否有关仍然还未确定。

sclerostin 是骨细胞释放的成骨抑制剂，被认为是骨骼反应的另一个下游介质，用以应对机械环境。sclerostin 在对机械卸载应答的调节中扮演着重要角色，并且在废用性骨质流失的患者中它的表达上调。有一种假设是 sclerostin 穿过骨细胞网到达骨表面，抑制成骨细胞上的 Wnt/β-catenin 途径从而抑制细胞增殖，削弱矿化作用和增强细胞凋亡。除了作用于成骨细胞以外，最近的一项研究表明，sclerostin 还可以通过 RANKL 依赖的方式促进破骨细胞形成和活动^[28]。因此，骨细胞产生的 sclerostin 可以调节破骨细胞和成骨细胞。

5. 骨被覆细胞

一部分成骨细胞将分化为骨被覆细胞，这些细胞大多数排列在骨表面。有理论提出，骨被覆细胞通过抑制破骨细胞前体与骨表面的不恰当作用在骨重建中发挥作用。人们认为启动破骨细胞形成的信号能通过激活胶原酶来刺激骨被覆细胞为骨吸收做准备。活化的胶原酶能消化非矿化骨的薄层，暴露底下的矿化基质，然后骨被覆细胞迁移至重建区域形成顶峰，在骨重建中创建一个良好的微环境。

在破骨细胞形成和活动启动之后，成骨细胞在骨重建位置上形成并产生新的骨质。此时，活化的成骨细胞上细胞相关 RANKL 如何直接介导破骨细胞形成和功能产生仍是一个有争议的话题。有证据指出当填满重建隔间时，骨被覆细胞已被证实能够表达 RANKL 和其他成骨细胞的标记，并与破骨细胞前体的 RANKL 和 RANK 受体之间的细胞间作用有关。这种观点也适用于许多其他直接作用于细胞间的耦合因子。但在体内骨髓腔内可能的物理作用和激活骨重建所需要的因子浓度等问题目前尚不清楚。

6. 骨巨噬细胞

骨巨噬细胞是骨膜和骨内膜的表面巨噬细胞。它们位于骨表面的骨细胞、破骨细胞、成骨细胞这三种细胞中间，并与骨被覆细胞相互作用。在成骨过程中，骨巨噬细胞在成熟成骨细胞上形成顶篷样结构，通过体内试验显示，骨巨噬细胞数量的消耗将导致成骨细胞矿化减少，证明了骨巨噬细胞能调节成骨细胞矿化。这表明骨巨噬细胞的数量在调节骨内稳态中发挥重要的作用。

骨巨噬细胞与成骨细胞在骨组织中的位置距离很近并且能调节成骨细胞矿化，因此有人提出在骨重建过程中，与破骨细胞为成骨细胞提供耦合信号类似，骨巨噬细胞同样能为成骨细胞提供一个耦合信号。比如，骨巨噬细胞表达的 TGF-β 和 EphrinB2 是潜在的耦合信号，它们参与了破骨细胞调节的骨形成。最近的一项研究表明，在胫骨损伤愈合模型中骨巨噬细胞能提高膜内成骨^[29]。因为膜内成骨并不涉及软骨或骨形成前的骨模板的重吸收，所以提出骨巨噬细胞可以作为合成代谢因子的细胞来源。而这些因子在这一过程中调节成骨细胞募集、成熟和骨形成。

7. 血管内皮细胞

毛细血管作为 BMU 中至关重要但却常被忽略的部分，能为骨组织供应氧气和营养物质，并代谢钙和再吸收废物。骨组织是一种高度血管化的组织，血管生成在骨质形成、改造和修复过程中扮演着关键的角色^[30]。骨骼的血液供应是维持骨密度和骨结构不可或缺的。病理情况下的骨血供的缺乏将导致骨死亡，如缺血性坏死。骨血供缺乏与骨形成、骨质的减少相关，抑制骨血流量将会抑制骨折模型中的骨修复和增加骨不愈合的风险^[31]。

骨重建发生在特殊的血管结构上。毛细血管能调节钙平衡，并提供骨重建过程的反馈调节信号的传递。氧气作为通过血管系统转运到 BMU 最重要的营养物质，是许多细胞过程的基础，特别在能量的产生方面。另外，氧气在骨重建中还扮演其他特殊的角色。其中生产胶原蛋白最主要的酶（脯氨酰-4-羟化酶）就需要分子氧。在缺乏氧气的情况下，成骨细胞不能有效地产生胶原蛋白，并且其自身的细胞增殖能力会下降。细胞对氧含量变化的反应主要通过低氧诱导因子（hypoxia-inducible factor-1，HIF-1）的活化来反映。HIF-1 能够激活基因转录来应对低氧状态，其中特异沉默 HIF-1α 和 HIF-2α 基因的成骨细胞显示：在骨重建和骨血管化形成过程中，HIF-1 对低氧条件起着重要的调控作用^[31]。此外，低氧环境促进破骨细胞 HIF-1α 稳定表达并增加破骨细胞数量。HIF-1 最近被确认为是成骨细胞对机械载荷应答的复性调控因子。综上所述，血管内皮细胞和血管为 BMU 提供营养，对骨重建起直接作用。

8. T 淋巴细胞和 B 淋巴细胞

自 1970 年代初以来，免疫系统和骨骼系统之间的关系就被重点研究，并且用骨免疫学这个词来描述这两个领域的重叠。鉴于免疫细胞和造血功能相关细胞都源于骨髓，这两个系统之间的交叉也就不奇怪了。许多免疫细胞分泌的因子，如T淋巴细胞分泌的 RANKL 能够激活破骨细胞，但在维护正常的骨生理中免疫细胞的作用尚不清楚。人们认为 T 淋巴细胞可能对骨代谢有保护作用，因为体外研究表明 CD8⁺T 细胞抑制破骨细胞生成。在存在 1，25-（OH）₂ 维生素 D₃ 情况下饲养 CD4⁺ 和 CD8⁺ 缺陷的裸鼠，发现其破骨细胞生成增强，表明 T 淋巴细胞抑制破骨细胞的形成。B 淋巴细胞和 T 淋巴细胞缺陷裸鼠的研究中表明这些淋巴细胞在骨内稳态和骨重建中起重要作用。B 淋巴细胞缺陷裸鼠将导致 OPG 缺乏，骨吸收增加导致骨量减少^[32]。T 淋巴细胞缺陷裸鼠因为骨重吸收的增加也显示出一个基础骨量减少的表型。在裸鼠脊髓中，B 淋巴细胞分泌的 OPG 减少表明 T 淋巴细胞的缺陷影响 B 淋巴细胞分泌 OPG^[33]。因此在骨生理平衡时，T 淋巴细胞起到一个保护作用。虽然淋巴细胞并没有直接在腔体中参与骨重建，但是通过在骨微环境中分泌因子，从而在骨内稳态中发挥重要作用。

自身免疫性疾病如类风湿性关节炎（rheuma-toid arthritis，RA）往往存在广泛的骨破坏现象，因此免疫系统在骨病理性条件下的作用已经被更全面地研究。早期研究发现破骨细胞样巨细胞位于滑膜和骨骼的接触表面，这表明破骨细胞负责骨破坏。进一步的研究发现了滑液中破骨细胞前体和破骨细胞生成的支持细胞，证明了破骨细胞存在于 RA 关节中。RANKL 也同样在 RA 患者滑膜中的 T 淋巴细胞和滑膜细胞高表达。其他炎症细胞因子如：IL-1、IL-16 和 TNF 出现在滑膜中介导 RANKL 的表达。目前热门的课题是研究参与增强破骨细胞生成的 T 淋巴细胞类型。辅助性 T 淋巴细胞（T helper cells，TH）中的 TH17 被认为是增强破骨细胞生成的 T 细胞亚型。破骨细胞生成 T 淋巴细胞的主要特点是产生 IL-17，表达 RANKL 和引发炎症，但不产生过量的干扰素 γ^[34]。因为这些 T 淋巴细胞在共培养中不能介导破骨细胞生成，所以它们在 RA 中不能单独起破骨细胞生成的作用。进一步了解淋巴细胞在骨生物学中的作用以及这些分子在骨免疫系统中的作用将对骨疾病的靶向治疗起重要作用。

9. 总结

骨重建过程是由无数细胞紧密协调的。而成骨细胞和破骨细胞之间的相互作用是其中不可或缺的部分，BMU 中其他细胞包括骨细胞、骨被覆细胞、骨巨噬细胞和血管内皮细胞也发挥着重要的作用。这些细胞活动的失衡往往导致骨质疏松、骨硬化病或骨骼生长畸形等骨疾病。另一方面，骨重建微环境的条件十分重要，其中的调控机制失衡可以导致很高的骨相关疾病发病率和死亡率。对骨重建过程和相关基因的更好理解有助于这些骨疾病治疗方案的选择。虽然骨重建的协调与骨的多细胞信号通路有关，但是目前对其中最为关键的骨耦合因子的认识是十分有限的。因此，在骨生物学中破译骨重建的分子基础是非常有意义的。

Funding Statement

国家自然科学基金面上项目（81572227）；浙江省自然科学基金一般项目（LY14H170002）；浙江省大学生科技创新活动计划暨新苗人才计划（2016R413085）