利用探针跳跃式离子电导显微镜研究活体血小板膜结构及其膜微粒的形成

Abstract

Platelets are rapidly activated by activators and produce a large number of platelet microparticles (PMPs) with high coagulation activity, resulting in coagulation dysfunction. However, the generation mechanism of PMPs is still not clear. Hopping probe ion conductance microscopy (HPICM) has special technical advantages in non-contact, real-time, high-resolution imaging of living cells under physiological conditions. Using HPICM, this study monitored the processes of platelet activation and generation of PMPs in real time in the presence of calcium ionophore A23187 and cytochalasin D (CD), respectively. The results proved that the intracellular calcium concentration and the cytoskeletal proteins played important roles in the platelet activation and the generation of PMPs. Compared with the low density spread shape platelets (LDSS), the high density bubble shape platelets (HDBS) were more sensitive to the calcium ionophore A23187 and cytochalasin D. This research has a guiding significance for the further study on the relationship between platelet activation and coagulation function using HPICM.

引言

有研究表明，血小板在促凝血酶原激酶及血小板活化因子等激活剂作用下，会快速活化并发生形变、血小板膜蛋白磷酸化以及细胞骨架重排，从而使部分血小板膜脱落而形成直径为 10～500 nm 的微小膜性囊泡，即血小板膜微粒（platelet micropar-ticles，PMPs）^[1-3]。研究报道，在脑卒中及外伤性颅脑损伤患者的脑脊液和血液中血小板活化并生成大量促凝的 PMPs^[4-5]；PMPs 膜上富含磷脂酰丝氨酸，其促凝活性是活化血小板的 50～100 倍^[6]；PMPs 能够进一步促进血小板活化并形成更多 PMPs，进而可诱发出凝血功能障碍，但这些具有高度促凝活性的 PMPs 的形成机制至今尚不明确^{[1-2, 7]}。

PMPs 体积小于正常的血小板但具有完整的膜结构，由于 PMPs 膜来源于血小板膜，故活化后血小板膜上的多数标志物均可在 PMPs 膜上表达^[8]。利用 PMPs 的特异性标志物（如：GPⅡb/Ⅲa 复合物、GPⅠb/ⅢX 复合物、P-选择素、磷脂酰丝氨酸等）借助于流式细胞仪或荧光显微镜可检测 PMPs 的形成。然而，尽管借助于价格昂贵的荧光抗体，但目前可探测的 PMPs 依然局限在直径大于 100 nm 的范围，无法探测小于 100 nm 的 PMPs^[3]。

由于血小板具有柔软而复杂的膜结构，且极易受机械或化学刺激而迅速活化并改变形貌，要实时跟踪活体血小板的活化及其纳米级 PMPs 的动态形成过程，需要一种无创、非接触且高分辨率的新型显微镜技术^[3]。近年来，广泛应用于生物医学研究的原子力显微镜（atomic force microscope，AFM）被初步用于血小板的活化^[9]及 PMPs 的形貌^[10]研究，但即使在对生物样品影响较小的轻敲操作模式下，扫描成像过程中探针针尖与生物样品间的轻微接触也不可避免^[11]，这些微弱的机械作用力不仅会损伤血小板柔软的膜结构^[12]，会人为激活血小板活化而改变形貌，还会人为促使 PMPs 的形成而造成测试的假阳性，因此高分辨率的 AFM 也不能满足实时动态研究血小板活化及 PMPs 形成机制的需要。

探针跳跃式离子电导显微镜技术（hopping probe ion conductance microscopy，HPICM）可以使活细胞非接触扫描成像达到横向 10 nm、纵向 5 nm 的高分辨率^[13-15]。与其它生物样品显微镜探测技术相比，非接触式的 HPICM 更适合在生理液态环境条件下对柔软活体细胞进行非侵入式的高分辨率扫描成像^[16]，其具有明显技术优势：① 非接触式探测生物样品；② 样品制备简单；③ 可在生理环境条件下对活体细胞表面微观结构进行连续扫描成像；④ 高分辨率地实时探测。我们^{[12, 17]}已利用 HPICM 技术在生理液态条件下高分辨率地研究了活体血小板的形貌，本文中我们进一步运用 HPICM 技术实时监控血小板在激活剂作用下活化及 PMPs 的动态形成过程。

1. 材料与方法

1.1. 药品与仪器

L15 培养基购自美国 Gibco 公司，人纤维蛋白原购自北京博奥森公司，胞内钙离子诱导剂 A23187 和细胞松弛素 D（cytochalasin D, CD）购自美国 Sigma 公司。扫描成像用玻璃微探针为硼硅酸盐微电极玻璃毛细管（外径 1.00 mm，内径 0.59 mm，长度 90 mm），购自武汉滨川科学仪器有限公司。扫描离子电导显微镜（ICnano SICM）购自英国 Ionscope 有限公司，MultiClamp 700B、Digidata 1440A 购自美国 Axon 公司，TiU 倒置显微镜购自日本 Nikon 公司，P-2000/G 型程控水平激光微电极拉制仪购自美国 Sutter Instrument 公司。

1.2. 富血小板血浆的制备及活体血小板体外贴壁黏附方法的建立

血液样品的采集：随机抽取年龄为 20～40 岁的健康男性（两周内未服用抗凝及抗血小板药物、无心脑血管疾病的健康人）空腹肘静脉血样 33 例，采血 2 mL 置于一次性真空采血管（柠檬酸钠 9∶1）中备用；其中 15 例血样用于在生理液态环境中对体外活体血小板的扫描成像（对照组），8 例血样在相同扫描过程中加入 1 μmol/L A23187（A23187 组），10 例血样在相同扫描过程中加入 10 μmol/L 细胞松弛素 D（CD 组）。

标本收集严格遵守相关的伦理学原则，在受试者知情同意的前提下进行。

富血小板血浆的制备：室温 150 × g 离心 15 min， 取上清液获得富血小板血浆（platelet-rich plasma，PRP），保存于气浴恒温 37℃ 振荡器中，所有试验均在 PRP 制备后 3 h 内完成。

活体血小板的体外贴壁黏附方法：在 35 mm 培养皿底部以 1 mg/mL 人纤维蛋白原铺备基底，于 4℃ 过夜保存；使用前将该皿于室温温育约 30 min 后用无菌磷酸盐缓冲液（phosphate-buffered saline，PBS）溶液洗涤，将 PRP 滴入皿内室温静置 30 min；依次用无菌 PBS 溶液、L15 培养基轻柔洗涤，以去除未贴壁黏附的血小板，此后置于 2 mL L15 培养基中用于 HPICM 扫描成像实验。

1.3. 利用 HPICM 技术对活体血小板进行扫描成像

本实验室的 HPICM 技术平台是在扫描离子电导显微镜系统（ICnano SICM）基础上改进而成，主要由精密扫描头、扫描控制器、商用膜片钳系统及装有操控及图像采集软件的个人电脑组成^[18]。扫描控制器以 20 kHz 的高速采样频率实时监测流入玻璃微探针的电流变化，利用 MultiClamp 700B 膜片钳放大器给玻璃微探针提供 + 200 mV 的电压。运用 HPICM 技术对血小板进行扫描成像时，50 μm ×50 μm 扫描范围的成像时间为 7～9 min，10 μm ×10 μm 与 15 μm × 15 μm 扫描范围的成像视样品表面复杂程度不同所需时间为 5～7 min。所得图像利用 HPICM Image Viewer 软件进行图像处理与分析。

本实验所使用的玻璃微探针为硼硅酸盐微电极玻璃毛细管，经 P-2000/G 程控水平激光微电极拉制仪拉制而成，探针尖端内半径约为 20 nm。将探针内充灌电极内液（L15 培养基），通过商用膜片钳技术测得探针电阻值约为 140 MΩ^[19]。

HPICM 成像实验分别对对照组、A23187 组和 CD 组随机选取 50 μm × 50 μm 区域的体外贴壁的活体血小板进行连续扫描。A23187 组和 CD 组在加入药物时，为避免污染及损伤玻璃探针的针尖和细胞样品，轻抬玻璃探针远离样品表面但针尖部分仍浸于 L15 培养基的液体环境，分别加入 A23187 和细胞松弛素 D，待药品扩散混匀后控制探针缓慢接近样品表面，从而对同一区域内的血小板进行连续扫描成像。本实验中所有 HPICM 扫描成像实验均在室温（23±2）℃ 条件下进行。

2. 结果与分析

2.1. 利用 HPICM 技术在体外对正常人活体血小板进行扫描成像

我们利用 HPICM 技术在生理液态培养条件下对体外静息状态的活体血小板的三维形貌进行了扫描成像（对照组，见图 1）。在 50 μm × 50 μm 尺度范围的成像中可以清晰地观察到活体贴壁的血小板呈现出两种不同表型：扁平型（low density spread shape，LDSS，图 1a 实线箭头所示）和突起型（high density bubble shape，HDBS，图 1a 虚线箭头所示）。对 15 例对照组血小板扫描数据中的扁平型和突起型血小板分别进行统计显示：扁平型血小板的直径为 4.6～8.7 μm，中心高度为 0.3～0.6 μm（n=56）；突起型血小板的直径为 1.6～3.8 μm，中心高度为 1.1～3.3 μm（n=62）；此外还发现，健康人体外静息状态的活体血小板中扁平型和突起型血小板的比例保持在 1∶1 左右。为了对两种不同表型血小板的形态特征进行高分辨率研究，我们利用 HPICM 的精确定位技术，随机选取了扁平型（图 1b）和突起型（图 1c）血小板分别进行了 15 μm ×15 μm 和 10 μm×10 μm 的高分辨率放大扫描成像。扁平型细胞在人纤维蛋白原上充分铺展，中心和边缘的高度差较小，为 0.3～0.4 μm，并且细胞边缘光滑完整；而突起型细胞中心和边缘的高度差达 1.4～1.7 μm，其边缘部分表现为树枝状不规则结构向周围伸展。

图 1.

Morphological imagings of live blood platelet in healthy subject using HPICM

健康人活体血小板的 HPICM 扫描成像

a. an image of live blood platelets, white solid arrows represent LDSS and white dotted arrows represent HDBS; b. a high-resolution image of single LDSS platelet; c. a high-resolution image of single HDBS platelet

a. 活体血小板的 HPICM 成像，实线箭头和虚线箭头分别指示扁平型血小板和突起型血小板；b. 扁平型血小板的高分辨率扫描成像；c. 突起型血小板的高分辨率扫描成像

2.2. 利用 HPICM 技术实时动态研究胞内钙离子在血小板活化及 PMPs 形成中的作用

血小板的活化功能与胞内钙离子浓度密切相关，胞内钙离子诱导剂 A23187 会诱发钙离子迅速进入细胞内，我们用 A23187 处理血小板，并利用 HPICM 连续扫描成像，实时记录体外活体贴壁血小板在胞内钙离子浓度增加后其形貌的动态变化过程。此前的研究表明，在无外源药物作用的生理液态环境中，黏附于人纤维蛋白原基底上的健康人体外活体血小板在 45 min HPICM 连续扫描成像过程中，扁平型血小板几乎没有形态变化，突起型血小板中一部分形态保持不变，另一部分则逐渐变成扁平型^[12]。

在 A23187 作用下血小板的 HPICM 扫描成像结果显示（见图 2），血小板对 1 μmol/L A23187 的激活作用非常敏感，当把 A23187 加入到含有钙离子的 L15 培养液 18 min 后即引起了扫描区域内所有血小板的急剧形变甚至破碎，同时还可以清晰地观察到由虚线椭圆标识出的 PMPs 的产生与释放。随着 A23187 作用时间的延长（图 2，34 min），两型血小板的收缩形变都进一步加剧，同时部分突起型血小板发生凋亡、消失（图 2，实线椭圆所示）。与扁平型血小板的形变（图 2，实线箭头所示）对比发现，突起型血小板对 A23187 的作用更敏感，更容易发生收缩、凋亡。

图 2.

HPICM continuous scanning imagings of live platelets adherent to fibrinogen in the presence of A23187 in the same field

在 A23187 作用下同一区域内活体贴壁血小板的 HPICM 连续扫描成像

2.3. 利用 HPICM 技术实时动态研究细胞骨架在血小板活化及 PMPs 形成中的作用

血小板变形是一种快速的血小板活化表现，其本质是血小板在活性物质作用下发生了骨架蛋白的收缩运动。因此，我们使用细胞松弛素 D，以期观察到细胞骨架对血小板活化过程形貌变化以及 PMPs 形成的影响。

随机选取体外活体贴壁的血小板群对其进行 50 μm × 50 μm 范围的 HPICM 扫描成像，实时扫描观测 10 μmol/L 细胞松弛素 D 持续作用下的同一区域内血小板的变化（见图 3）。结果显示，当细胞松弛素 D 持续作用 19 min 时，突起型血小板变化明显（图 3，实线椭圆所示），约 50% 的突起型血小板破碎消失，其所在位置附近有明显的 PMPs 产生和释放（图 3，虚线椭圆所示）；部分扁平型血小板出现较明显的形貌变化。当细胞松弛素 D 持续作用 34 min 时，约 70% 的突起型血小板消失，扁平型血小板出现收缩隆起的迹象（图 3，实线箭头所示）。由此可见，突起型血小板对细胞松弛素 D 的作用更敏感，药物反应更快更剧烈，更容易形成并释放 PMPs。

图 3.

HPICM continuous scanning imagings of live platelets adherent to fibrinogen in the presence of CD in the same field

在 CD 作用下同一区域内体外活体贴壁血小板的 HPICM 连续扫描成像

3. 结论

本研究在纳米尺度利用 HPICM 技术在生理活性条件下高分辨率地观察到扁平型和突起型两种血小板亚型；实时、动态、高分辨率地监测到扁平型和突起型血小板在 A23187 和细胞松弛素 D 作用下都呈现出收缩、变高的趋势，并伴随 PMPs 的产生释放，直至血小板破碎、消失，这直接证明了胞内钙离子浓度和细胞骨架蛋白在血小板活化及 PMPs 的形成中发挥了重要作用；同时发现，较之于扁平型血小板，突起型血小板对胞内钙离子诱导剂 A23187 和细胞松弛素 D 更敏感，更容易被活化释放 PMPs，这为研究凝血功能调节提供了新的方向。本研究填补了国内利用非接触式扫描探针显微镜技术高分辨率研究血小板活化及 PMPs 形成的空白，对今后进一步利用该技术开展血小板活化与出凝血功能之间关系等相关研究具有示范及指导意义。

Funding Statement

天津市科技计划（14ZCZDSY00020）；天津市滨海新区塘沽科技兴区项目（2012XQ15-11）；国家自然科学基金青年科学基金项目（31300828）