Abstract
本文旨在筛选干扰素（IFN）治疗应答不同的慢性乙型肝炎（CHB）患者间IFN通路的差异表达基因，明确IFN疗效不佳的可能宿主因素，并探索干扰素功能分类基因芯片在预测干扰素治疗CHB患者疗效中的应用前景。从我院干扰素治疗队列中随机选取有应答CHB患者（Rs）、无应答CHB患者（NRs）各3例，在健康体检者中招募受试者3例，利用IFN功能分类基因芯片检测Peg-IFN-α 2a治疗前后CHB患者及健康对照者外周血单个核细胞（PBMCs）中IFN相关基因的表达水平。结果发现，与IFN治疗前相比，治疗后Rs组IFN通路相关的差异表达基因数量多于NRs组。与健康对照者相比，Rs和NRs在治疗前的IFNG、IL7R、IRF1和IRF8均下调；CXCL10、IFIT1、IFITM1在Rs中上调；IL13RA1和IFI35在NRs中上调，IFRD2、IL11RA、IL4R、IRF3、IRF4、PYHIN1和ADAR在NRs中下调。Rs组与NRs组相比，IL15、IFI35和IFI44分子的表达分别下调4.09（t = 10.58，P < 0.001）、5.59（t = 3.37，P = 0.028）和10.83（t = 2.8，P = 0.049）倍。综上，在接受Peg-IFN-α 2a治疗的CHB患者中，IFN功能分类基因芯片能通过检测PBMC中的IFN相关基因表达水平评估治疗后IFN通路的激活情况，可用于预测IFN疗效；治疗前CXCL10、IFIT1和IFITM1的高表达可能提示IFN疗效良好；IL13RA1、IL15、IFI35和IFI44分子的高表达和IFRD2、IL11RA、IL4R、IRF3、IRF4、PYHIN1及ADAR分子的低表达可能提示患者IFN疗效不佳。
Keywords: 慢性乙型肝炎, 干扰素, 基因芯片, 治疗应答
Abstract
This study aims to clarify host factors of IFN treatment in the treatment of chronic hepatitis B (CHB) patients by screening the differentially expressed genes of IFN pathway CHB patients with different response to interferon (IFN) therapy. Three cases were randomly selected in IFN-responding CHB patients (Rs), non-responding CHB patients (NRs) and healthy participants, respectively. The human type I IFN response RT2 profiler PCR array was used to detect the expression levels of IFN-related genes in peripheral blood monocytes (PBMCs) from healthy participants and CHB patients before and after Peg-IFN-α 2a treatment. The results showed that more differentially expressed genes appeared in Rs group than NRs group after IFN treatment. Comparing with healthy participants, IFNG, IL7R, IRF1, and IRF8 were downregulated in both Rs and NRs group before IFN treatment; CXCL10, IFIT1, and IFITM1 were upregulated in the Rs; IL13RA1 and IFI35 were upregulated in the NRs, while IFRD2, IL11RA, IL4R, IRF3, IRF4, PYHIN1, and ADAR were downregulated. The expression of IL15, IFI35 and IFI44 was downregulated by 4.09 (t = 10.58, P < 0.001), 5.59 (t = 3.37, P = 0.028) and 10.83 (t = 2.8, P = 0.049) fold in the Rs group compared with the NRs group, respectively. In conclusion, IFN-response-related gene array is able to evaluate IFN treatment response by detecting IFN-related genes levels in PBMC. High expression of CXCL10, IFIT1 and IFITM1 before treatment may suggest satisfied IFN efficacy, while high expression of IL13RA1, IL15, IFI35 and IFI44 molecules and low expression of IFRD2, IL11RA, IL4R, IRF3, IRF4, PYHIN1 and ADAR molecules may be associated with poor IFN efficacy.
Keywords: Chronic hepatitis B, Interferons, Gene array, Treatment response
0. 引言
乙型肝炎病毒（hepatitis B virus，HBV）感染是一个世界范围内的重大公共卫生问题，全球约有2.96亿慢性HBV感染者，每年约有88.7万人死于HBV感染相关疾病，如肝硬化和肝细胞癌[1]。慢性乙型肝炎（chronic hepatitis B，CHB）的有效抗病毒治疗可通过最大限度地长期抑制HBV复制，减轻肝脏炎症和坏死，从而降低并发症的发生率并提高患者的生存率[2]。当前核苷（酸）类似物（nucleoside/nucleotide analogues，NAs）和聚乙二醇干扰素-α（peginterferon-α，Peg-IFN-α）是推荐的抗HBV药物[3]，其中Peg-IFN-α具有疗程有限、无耐药风险、乙型肝炎e抗原（hepatitis B e antigen，HBeAg）和乙型肝炎表面抗原（hepatitis B surface antigen，HBsAg）血清转化率相对较高且更加持久等优点[4]。然而现有临床数据表明，目前IFN的抗病毒有效率，尤其血清学转化率并不令人满意。既往研究报道，接受Peg-IFN-α治疗的患者HBeAg血清转化率较低，HBsAg血清转化率也不佳[5-7]。因此，提高CHB患者对IFN-α的应答率是目前临床面临的重要问题。
生理条件下，体内IFN-α表达水平较低，病毒感染可刺激细胞产生大量Ⅰ型IFN，Ⅰ型IFN通过Ⅰ型IFN受体激活细胞内信号通路，诱导抗病毒基因的表达，这些基因被翻译成抗病毒蛋白发挥抑制或清除病毒的作用[8-9]。导致IFN-α治疗失败的分子机制尚不清楚，但有证据表明病毒和宿主因素均在其中起到重要作用。病毒因素包括HBV基因型、HBV基因组内的突变和病毒载量的基线水平等。如感染了HBV-C和D基因型的个体、HBV在前核心和/或基础核心启动子区域有突变、基线病毒载量较高的患者更有可能对IFN-α治疗应答不佳。除病毒因素外，宿主因素在CHB患者对IFN-α治疗的应答率方面也起着同样关键的作用。部分宿主因子可以通过抑制IFN产生或干扰IFN相关信号通路影响IFN-α的疗效[10]，因此探明对IFN疗效产生重要影响的宿主因子能够为CHB患者接受IFN-α治疗前预测疗效提供一定帮助。功能分类基因芯片是一种研究功能基因表达模式的有效手段，本研究采用此方法分析并对比了IFN-α治疗有应答和无应答CHB患者在治疗前后，以及CHB患者治疗前与健康对照者之间的IFN通路相关基因的表达水平和差异表达情况，筛选与IFN-α治疗应答不佳相关的宿主因子，从而探索干扰素功能分类基因芯片在预测干扰素治疗CHB患者疗效中的应用前景，识别靶向干预的关键位点，为进一步优化干扰素疗效的靶向干预策略提供理论支撑。
1. 对象与方法
1.1. 研究对象
纳入在2021年1月至2022年6月间在四川大学华西医院感染性疾病中心就诊的接受干扰素治疗的CHB患者，建立干扰素诊疗临床随访队列。队列纳入标准：① 患有乙型肝炎6个月及以上，治疗前均为HBeAg阳性，诊断标准采用《慢性乙型肝炎防治指南（2019年版）》[11]中确立的临床诊断标准；② 四川大学华西医院为首诊医院，以确保患者就诊前未接受其他抗病毒治疗；③ 符合IFN-α抗病毒治疗标准。排除标准：① 过去6个月内曾接受抗病毒或免疫抑制治疗；② 合并自身免疫性疾病或其他类型肝炎病毒感染者；③ 曾存在血细胞减少症或失代偿性肝病。研究方案经四川大学华西医院生物医学伦理委员会批准［2019年临床试验（上市）审（28）号］。全部患者均签署知情同意书。
在建立的队列中匹配选择对Peg-IFN-α 2a有应答的CHB男性患者、无应答的CHB男性患者各3例，在体检中心匹配健康体检男性3例作为对照组。CHB患者的治疗方案均采用Peg-IFN-α 2a（Roche Pharma Ltd.，瑞士）180 μg，每周皮下注射一次，持续48周。根据随访结果，对Peg-IFN-α 2a有应答者（Rs）定义为治疗结束后12周内谷丙转氨酶（alanine aminotransferase，ALT）恢复正常和HBeAg发生血清学转换，且无法检测到HBV-DNA（最低检测限为1 × 102 IU/mL）；无应答者（NRs）定义为未达到上述标准。为排除性别、年龄、病程及病情严重程度等影响，研究团队对最终纳入分析的三组参与者的年龄、性别等因素进行了匹配，保持了同质性（P > 0.05），Rs组和NRs组患者感染HBV的基因分型均为B型，治疗前ALT水平和HBV-DNA水平的差异无统计学意义（P > 0.05），纳入患者的临床基线指标及病毒学指标见附表1。
表 1. Differentially expressed genes in CHB patients before and after treatment.
CHB患者治疗前后的基因差异表达情况
| IFN-α治疗应答情况 | 基因符号 | 基因名称 | 下调/上调倍数 | t 值 | P 值 |
| 应答者 | IFNGR2 | 干扰素γ受体2 | 2.01 | –8.33 | 0.001 |
| IL20RB | 白细胞介素20受体β | –2.55 | 2.79 | 0.049 | |
| ADAR | 腺苷脱氨酶 | 2.82 | –3.17 | 0.034 | |
| IFI6 | 干扰素诱导蛋白6 | 3.35 | –3.68 | 0.021 | |
| ISG15 | 干扰素刺激基因15 | 8.5 | –3.60 | 0.023 | |
| LEPR | 瘦素受体 | –2.67 | 2.82 | 0.048 | |
| 无应答者 | IRF2BP1 | 干扰素调节因子2结合蛋白1 | –3.48 | 7.88 | 0.001 |
1.2. 主要材料
所用芯片为美国SABioscience公司生产的功能分类基因芯片RT² Profiler™ PCR Array Human Interferons & Receptors（PAHS-064Z，Qiagen，美国），其中包括IFN基因、干扰素受体（interferon-α/β receptor，IFNAR）基因、干扰素调节因子（interferon regulatory factor，IRF）基因和干扰素刺激基因（interferon-stimulated gene，ISGs）等84个基因，每张芯片包含5个独立的管家基因（ACTB、B2M、HPRT1、GAPDH和RPLP0），用于样本数据的标准化。
1.3. 方法
1.3.1. 人外周血单核细胞的分离
在无菌条件下采集入选的6例CHB患者治疗前（时间编号为A）和治疗48周后（时间编号为B）的外周静脉血，以及入选的3例健康对照的外周静脉血样本，用Ficoll分离液分离外周血单核细胞（peripheral blood mononuclear cell，PBMC），使用磷酸盐缓冲液（phosphate-buffered saline，PBS）洗涤后取细胞沉淀，–80℃保存备用。
1.3.2. RNA的提取与纯化
采用Trizol试剂（Invitrogen，美国）从PBMC样本中提取总RNA，使用NanoDrop® ND-1000测定RNA浓度和纯度，使用RNeasy Mini Kit（Qiagen，美国）进一步纯化总RNA。通过变性琼脂糖凝胶电泳评估样品RNA的质量。
1.3.3. 逆转录-多聚酶链反应（reverse transcription-polymerase chain reaction，RT-PCR）
将变形琼脂糖凝胶电泳评估后符合标准的RNA样本逆转录合成cDNA，反应体系为20 μL。将第一链cDNA与2 × SuperArray PCR master mix和ddH2O混合，并将混合物加入PCR芯片中。在ABI PRISM 7900系统（Applied Biosystems，美国）上进行PCR反应，获得每个扩增产物的Ct值。PCR反应体系20 μL，反应条件：95 ℃ 10 min，随后95 ℃ 10 s，60 ℃ 1 min，进行40个循环。
1.4. 统计学方法
用管家基因的Ct值归一目标基因的Ct值，得到芯片中每个基因的ΔCt，用2-ΔΔCt方法将芯片数据进行针对管家基因的标准化。两样本之间各基因表达校正值的比值 ≥ 2.0为上调基因，≤ –2.0为下调基因。采用SPSS25.0软件进行统计学处理，经正态分布检验，所得数据符合正态分布，组间差异比较采用独立样本t检验，检验水准为0.05。
2. 结果
2.1. 不同应答组在IFN治疗前后IFN通路相关基因表达分析
与Peg-IFN-α 2a治疗前相比，Rs组治疗后出现了6个差异表达基因，包括4个上调基因和2个下调基因，其中腺苷脱氨酶（adenosine deaminase，ADAR）、干扰素诱导蛋白6（interferon induced protein 6，IFI6）和干扰素刺激基因15（interferon-stimulated gene，ISG15）均为ISGs，且在治疗后发生上调。NRs组治疗后仅有1个基因表达与治疗前有差异，为干扰素调节因子2结合蛋白1（interferon regulatory factor 2 binding protein 1，IRF2BP1），下调倍数为3.48（t = 7.88，P = 0.001）（见图1、表1）。提示无应答患者在IFN治疗过程中，IFN相关通路难以被激活。
图 1.
Differentially expressed genes between Rs and NRs group before and after Peg-IFN-α 2a treatment
Rs组和NRs组在Peg-IFN-α 2a治疗前后的差异表达基因
a. 治疗后/治疗前基因表达差异热图；b. 治疗后/治疗前基因表达的火山图：黑色实线代表前后基因改变倍数为1，粉色实线表示上调/下调倍数为2，蓝色实线表示P = 0.05
a. heat map of differential gene expression in Rs and NRs (after/before treatment); b. volcano plot of gene expression (after/before treatment): black solid liner represents a gene change fold of 1, the pink solid line represents an upregulation/downregulation fold of 2, and the blue solid line represents P = 0.05
2.2. 不同应答者在IFN治疗前的IFN相关基因表达差异分析
与健康对照者相比，在Rs组治疗前样本中筛选出7个差异表达基因，其中3个为上调基因，4个为下调基因（见图2b、表2）。上调的基因包括CXC趋化因子配体10（C-X-C motif chemokine ligand 10，CXCL10，t = –4.58，P = 0.010）、具有四肽重复序列的干扰素诱导蛋白1（interferon-induced protein with tetratricopeptide repeats 1，IFIT1，t = –3.94，P = 0.017）和干扰素诱导的跨膜蛋白1（interferon-induced transmembrane protein 1，IFITM1，t = –14.3，P＜0.001）基因，下调的基因包括干扰素γ（interferon-gamma，IFNG，t = 2.79，P = 0.050）、白细胞介素7受体（interleukin 7 receptor，IL7R，t = 2.96，P = 0.042）、干扰素调节因子1（interferon regulatory factor 1，IRF1，t = 3.93，P = 0.017）和IRF8（t = 3.96，P = 0.017）基因。
图 2.
Differentially expressed genes in Rs and NRs group compared to healthy controls before Peg-IFN-α 2a treatment
在Peg-IFN-α 2a治疗前Rs和NRs与健康对照者相比的差异表达基因
a. 与健康对照相比，治疗前Rs和NRs的下调基因韦恩图；b. 治疗前患者/健康对照者基因表达差异热图；c. 治疗前患者/健康对照者基因表达的火山图：其中黑色实线代表前后基因改变倍数为1，粉色实线表示上调/下调倍数为2，蓝色实线表示P = 0.05
a. Wayne plot of downregulated genes in Rs and NRs comparing to healthy controls; b. heat map of differential gene expression of patients before treatment comparing to healthy controls; c. volcano plot of gene expression of patients before treatment comparing to healthy controls: black solid line represents a gene change fold of 1, the pink solid line represents an upregulation/downregulation fold of 2, and the blue solid line represents P = 0.05
表 2. Baseline differentially expressed genes in Rs group before treatment comparing to healthy controls.
Rs组治疗前与健康对照者比较的差异表达基因
| 基因符号 | 基因名称 | 下调/上调倍数 | t 值 | P 值 |
| IFNG | 干扰素γ | –9.97 | 2.79 | 0.050 |
| IL7R | 白细胞介素7受体 | –2.94 | 2.96 | 0.042 |
| CXCL10 | CXC趋化因子配体10 | 3.23 | –4.58 | 0.010 |
| IRF1 | 干扰素调节因子1 | –2.03 | 3.93 | 0.017 |
| IRF8 | 干扰素调节因子8 | –3.30 | 3.96 | 0.017 |
| IFIT1 | 具有四肽重复序列的干扰素诱导蛋白1 | 9.44 | –3.94 | 0.017 |
| IFITM1 | 干扰素诱导的跨膜蛋白1 | 2.75 | –14.30 | < 0.001 |
与健康对照者相比，在NRs组治疗前样本中发现了13个差异表达基因，包括了2个上调基因和11个下调基因（见图2b、表3）。其中上调基因为白细胞介素13受体α 1亚基基因（interleukin 13 receptor subunit alpha 1，IL13RA1）和IFI35，上调倍数分别为2.65（t = –3.42，P = 0.027）和4.49倍（t = –2.79，P = 0.049）。下调基因包括IFNG、干扰素相关生长调节因子2（interferon related developmental regulator 2，IFRD2）、IL11RA、IL4R、IL7R、IRF1、IRF3、IRF4、IRF8、Pyrin和HIN域家族成员1（pyrin and HIN domain family member 1，PYHIN1）和ADAR，其中IFNG、IL7R、IRF1和IRF8分子在Rs和NRs中均下调（见图2a），提示HBV能够抑制IFN通路的激活，并且在无应答患者中，该抑制作用更加明显。
表 3. Baseline differentially expressed genes in NRs group comparing to healthy controls.
NRs组治疗前与健康对照者比较的差异表达基因
| 基因符号 | 基因名称 | 下调/上调倍数 | t 值 | P 值 |
| IFNG | 干扰素γ | –60.40 | 3.04 | 0.038 |
| IFRD2 | 干扰素相关生长调节因子2 | –4.66 | 3.95 | 0.017 |
| IL11RA | 白细胞介素11受体α亚基 | –9.55 | 6.40 | 0.003 |
| IL13RA1 | 白细胞介素13受体α1亚基 | 2.65 | –3.42 | 0.027 |
| IL4R | 白细胞介素4受体 | –6.22 | 3.12 | 0.036 |
| IL7R | 白细胞介素7受体 | –11.04 | 4.35 | 0.012 |
| IRF1 | 干扰素调节因子1 | –5.36 | 7.22 | 0.002 |
| IRF3 | 干扰素调节因子3 | –3.18 | 2.87 | 0.045 |
| IRF4 | 干扰素调节因子4 | –7.95 | 3.00 | 0.04 |
| IRF8 | 干扰素调节因子8 | –3.83 | 5.02 | 0.007 |
| IFI35 | 干扰素诱导蛋白35 | 4.49 | –2.79 | 0.049 |
| PYHIN1 | Pyrin和HIN域家族成员1 | –19.48 | 3.55 | 0.024 |
| ADAR | 腺苷脱氨酶 | –2.52 | 4.54 | 0.011 |
为进一步明确Peg-IFN-α 2a治疗前的有应答者与无应答者的干扰素相关基因表达差异，并明确影响IFN疗效的宿主因子，我们直接对比了Rs组和NRs组治疗前样本的差异表达基因，发现Rs组的IL15、IFI35和IFI44基因的表达较NRs组低，分别下调4.09（t = 10.58，P < 0.001）、5.59（t = 3.37，P = 0.028）和10.83（t = 2.80，P = 0.049）倍（见表4），其中IFI35和IFI44均为ISGs。说明部分ISGs（IFI35、IFI44）和IL15在IFN治疗前的激活与IFN疗效不佳相关。
表 4. Baseline differentially expressed genes in Rs and NRs before treatment.
IFN-α有应答（Rs）与无应答者（NRs）比较治疗前的差异表达基因
| 基因符号 | 基因名称 | 下调/上调倍数 | t 值 | P 值 |
| IL15 | 白细胞介素15 | –4.09 | 10.58 | < 0.001 |
| IFI35 | 干扰素诱导蛋白35 | –5.59 | 3.37 | 0.028 |
| IFI44 | 干扰素诱导蛋白44 | –10.83 | 2.80 | 0.049 |
3. 讨论与结论
HBV感染机体后，被宿主免疫系统识别，与靶细胞相互作用，诱导宿主细胞产生一系列抗病毒应答反应，包括内源性IFN的产生。IFN的抗病毒作用主要是通过激活JAK-STAT信号转导通路实现的。IFN-α主要激活Ⅰ型IFN通路，通过与IFNAR1和IFNAR2组成的异二聚体跨膜受体结合，激活Janus激酶1（Janus kinase 1，JAK1）和酪氨酸激酶2（tyrosine kinase 2，Tyk2），进而磷酸化信号转导和转录激活因子1（signal transducer and activator of transcription 1，STAT1）和STAT2分子，并促进STAT1和STAT2核转位和与IRF9连接形成IFN刺激基因因子3（interferon stimulated gene factor 3，ISGF3）。ISGF3与IFN刺激的反应元件（IFN-stimulated response elements，ISRE）结合，导致ISGs的表达。以这种方式，IFN-α诱导大量ISGs表达，从而发挥抗病毒作用[12]。因此，IFN通路中相关基因的激活水平与IFN治疗疗效密切相关，深入探索其表达水平对研究疗效预测措施与干预优化策略有重要的指导价值。
本研究应用IFN功能分类基因芯片对CHB患者及健康对照者PBMC中IFN相关的基因进行检测，并进行了探索性分析。研究证实该基因芯片能够较为快速且准确地利用患者PBMC识别患者治疗前后IFN通路分子的激活情况，显示关键基因的表达水平。通过自身前后对比分析，我们发现IFN疗效不佳者其IFN相关基因在Peg-IFN-α 2a治疗前后仅有IRF2BP1基因的表达出现差异，而IFN治疗有效的CHB患者在治疗后出现了6个IFN通路相关基因的表达差异，其中包括了干扰素受体基因（IFNGR2）、干扰素刺激基因（ADAR、IFI6、ISG15）、瘦素受体（leptin receptor，LEPR）和IL20RB基因，从分子水平证实了IFN无应答者在外源性IFN治疗后，体内IFN相关通路难以被有效激活，因此出现应答不佳。我们推测这一现象可能与治疗前无应答患者的IFN通路就处于抑制状态有关。
为探究IFN治疗无应答的CHB患者在治疗前IFN通路是否处于抑制状态，并筛选可能与IFN疗效相关的宿主因子，本研究对比分析了IFN治疗前组间基因的表达差异，从84个IFN相关基因中筛选出了Rs组的3个上调基因（CXCL10、IFIT1、IFITM1）和4个下调基因（IFNG、IL7R、IRF1、IRF8）。从NRs筛选出了2个上调基因（IFI35、IL13RA1）和11个下调基因（IFNG、IFRD2、IL11RA、IL4R、IL7R、IRF1、IRF3、IRF4、IRF8、PYHIN1和ADAR）。其中Rs和NRs组在IFN-α治疗前的IFNG、IL7R、IRF1和IRF8的水平均低于健康对照组，这表明HBV感染能够抑制部分IFN调节因子的表达；而除以上4个分子外，NRs组的IFRD2、IL11RA、IL4R、IRF3、IRF4、PYHIN1和ADAR分子在治疗前的表达也较低，说明与应答患者相比，在治疗前无应答患者的IFN通路处于更强的抑制状态，因此出现应答不佳。IRF家族的转录因子参与Ⅰ型IFN通路的作用，既往研究发现IRF3是诱导内源性IFN-α表达的最重要的转录因子[13]，能够促进内源性IFN的产生。本研究发现IFN治疗无应答患者的IRF3表达显著低于健康对照，说明无应答患者的内源性IFN产生能力降低，因此我们推测，当接受外源性IFN刺激后，由于大量IRFs被抑制，无应答者内源性IFN的产生可能大幅减少，从而难以激活IFN相关下游通路，宿主清除HBV的能力降低，并且该过程与IRF3、IRF4的低表达密切相关。PYHIN1能够调节促炎细胞因子的基因启动子，诱导促炎细胞因子IL-6和TNF-α的产生，从而发挥抗病毒作用，然而其在HBV中的作用仍有待探究[14]。ADAR是MDA5-MAVS抗病毒反应中的正调节因子[15]，但同时有研究提示IFN-α通过促进ADAR1的表达，抑制MAVS的抗HBV作用，因此有关ADAR的作用目前尚不明确，需进一步在临床及基础实验中进行验证[16]。除此之外，研究结果也提示CXCL10、IFIT1和IFITM1在治疗前的高表达能够在一定程度上预测患者接受IFN治疗后可能应答更佳。既往研究发现，CXCL10是CHB疾病进展和治疗反应的有效预测指标；IFIT1和IFITM1蛋白在抑制肝炎病毒复制中都起到了重要调节作用。CXCL10在血清和组织中的较高基线值与Peg-IFN治疗后HBeAg的血清学转换相关，可用于预测IFN治疗CHB的疗效[17]，与本研究的结果相符。IFIT1可通过抑制HBV和丙型肝炎病毒（hepatitis C virus，HCV）的复制来限制HBV和HCV感染[18]，并且其多态性被证明与IFN治疗CHB的疗效相关[19]。IFITM1蛋白能够通过破坏HCV辅助受体CD81和occludin的相互作用，发挥抗HCV的作用[20]，在HBV中的作用有待进一步探究。
无论是患者自身前后对照，还是不同应答组间比较分析，前述研究结果均提示：CHB患者治疗前部分IFN通路相关基因的基线表达水平与疗效相关，可以作为疗效预测的指标。因此，为了进一步明确影响疗效的关键宿主因子，我们比较分析了IFN治疗前Rs和NRs的差异表达基因，发现NRs的IL15、IFI35和IFI44基因的表达显著增高，其中IFI35和IFI44均属于Ⅰ型IFN通路下游的ISGs，这提示在IFN治疗前IFN信号通路的基础激活状态可能与CHB患者对IFN治疗反应差有关。有研究表明，IFI35能够负向调节视黄酸诱导基因（retinoic acid-inducible gene I，RIG-I）的抗病毒信号，并促进水疱性口炎病毒（vesicular stomatitis virus，VSV）在细胞中的复制[21]。IFI44分子被发现能够限制呼吸道合胞病毒（respiratory syncytial virus，RSV）感染[22]，在被HCV感染的细胞中则会抑制细胞的生长分裂[23]。然而，这些因子针对HBV感染的作用，以及是否在IFN通路的负性调控环节发挥作用，仍有待进一步探究。
综上，本研究探索了IFN功能分类基因芯片在利用患者PBMC评估患者治疗后IFN通路分子激活情况的应用，并发现HBV感染能够抑制IFNG、IL7R及干扰素转录因子IRF1、IRF8的表达。研究筛选出了提升IFN治疗CHB疗效的正性调控因子CXCL10、IFIT1和IFITM1，它们在治疗前的高表达可能提示IFN疗效佳；IL13RA1、IL15、IFI35和IFI44分子的高表达和IFRD2、IL11RA、IL4R、IRF3、IRF4、PYHIN1及ADAR分子的低表达可能提示患者IFN疗效不佳。本研究以健康人群为对照，在IFN治疗有应答患者和无应答患者中，利用IFN相关基因芯片，筛选出了可能与IFN治疗疗效相关的IFN通路差异表达基因，识别出了与疗效可能密切相关的基线宿主基因，有助于完善拟行干扰素治疗患者的基线评估，优化治疗策略，实现CHB患者的个体化与精准化管理。但干扰素相关通路涉及复杂的信号网络，本研究样本例数有限，所涉及的宿主因子仅有84个关键基因。未来仍需要扩大样本进行探索，深入研究机制，并对研究发现的候选因子进行验证。
重要声明
利益冲突声明：所有作者均声明不存在利益冲突。
作者贡献声明：王嘉毅主要负责实验操作、数据分析、论文撰写与修改；卢家桀主要负责实验操作、数据记录与分析、论文撰写；周宸主要负责数据处理与分析、协助论文撰写；杜凌遥主要负责数据管理与分析指导、论文修订；唐红主要负责实验指导与安排、论文审阅修订并提供基金支持。
伦理声明：本研究通过了四川大学华西医院生物医学伦理委员会审批［批文编号：2019年临床试验（上市）审（28）号］。
本文附表见本刊网站的电子版本（www.biomedeng.cn）。
Funding Statement
国家自然科学基金（82172254）；四川大学华西医院学科卓越发展1·3·5工程项目（ZYGD20009）
The National Natural Science Foundation of China; West China Hospital, Sichuan Univerisity
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