基质硬化相关lncRNA SNHG8调控卵巢癌化疗敏感性

Abstract

细胞外基质（ECM）对癌症进展和化疗敏感性至关重要。卵巢癌死亡率高、预后差，严重威胁着女性生命健康。但目前ECM硬度对卵巢癌长链非编码RNA(lncRNAs)表达谱和化疗抗性的调控作用尚不清楚。因此，本研究通过分析不同基质硬度卵巢癌细胞转录组数据，发现基质硬化导致大量lncRNAs表达上调，但SNHG8表达显著下调，并利用聚二甲基硅氧烷（PDMS）水凝胶培养的卵巢癌细胞进行验证。研究发现敲低SNHG8降低了同源重组修复效率以及卵巢癌细胞对依托泊苷和顺铂的敏感性。GEPIA数据分析显示，SNHG8在卵巢癌组织中显著下调，其表达水平与卵巢癌患者预后呈负相关。本研究显示基质硬化相关lncRNA SNHG8与卵巢癌化疗敏感性和预后密切相关，可望作为指导卵巢癌化疗用药和预测预后的分子标志物。

0. 引言

卵巢癌（ovarian cancer，OC）是最常见且死亡率最高的妇科恶性肿瘤^[1]。由于缺乏可靠灵敏的早期诊断方法，超过75%的患者确诊时已经处于晚期^[2]。尽管手术切除、放化疗和分子靶向药物等治疗在一定程度上能够缓解患者病情，卵巢癌的5年生存率仍然较差^[3]。以往对卵巢癌的研究和治疗方案主要靶向癌细胞^[4]，很大程度上忽略了卵巢微环境的影响。研究表明，人类卵巢排卵和伤口愈合的反复炎症过程中细胞外基质（extracellular matrix，ECM）胶原蛋白会发生过度沉积及构象变化，引起ECM硬度增加，导致卵巢纤维化^[5]。纤维化不仅是诱发卵巢癌的关键因素，还严重影响着卵巢癌的化疗耐药和预后^[6]，但临床上尚没有用于缓解或者逆转卵巢纤维化的治疗方法，ECM硬度调控卵巢癌发生发展的功能及其内在机制仍知之甚少。

ECM不仅能够支撑细胞结构，还可以响应多种机械信号如张力、压力和剪切力的改变，从而调控基因表达^[7]。研究表明，ECM硬度的增加会促进上皮-间充质转化过程（epithelial-mesenchymal transition，EMT），导致癌细胞的浸润和转移^[6]。长链非编码RNA（long non-coding RNA，lncRNA）是指长度大于200个核苷酸、不具有蛋白编码能力的RNA^[8]，它在调控基因表达、细胞分化、细胞周期等多种生命过程中发挥着重要作用^[6]。越来越多的研究发现，lncRNA表达失调会影响EMT，进而调控肿瘤的发生发展^[6]。例如，HOTAIR、MALALT1、lncROR和H19等多个lncRNA被报道在肿瘤中表达上调并促进EMT，与肿瘤预后呈负相关^[9]。因此，聚焦ECM硬度，寻找卵巢癌细胞lncRNA标志物，对防治卵巢癌和保护女性生殖健康具有重要意义。

本研究基于不同基质硬度卵巢癌细胞系SKOV3的转录组数据，揭示基质硬化相关的卵巢癌lncRNA表达谱，并对差异lncRNAs共表达的mRNA进行GO功能富集分析，利用RT-PCR、shRNA敲低、CCK8等实验及GEPIA数据库进行验证，探究基质硬化相关lncRNA在化疗敏感性及预后方面的价值，从而为指导卵巢癌的化疗用药和预测预后提供新的分子标志物。

1. 材料与方法

1.1. 实验试剂

卵巢癌细胞系SKOV3、HO-8910和A2780以及人胚肾细胞HEK293T（来源于ATCC细胞库），置于含有10%胎牛血清（Biowest，乌拉圭）的RPMI-1640或者DMEM培养基（BI），37 ℃培养箱中培养（5% CO₂）。

1.2. 数据来源

从Gene Expression Omnibus（GEO）数据库中下载GSE178888数据集原始数据。该数据集基于Illumina NovaSeq 6000平台测序，包括在不同基质硬度（0.5、25、106 kPa）生长的卵巢癌细胞系SKOV3的转录组测序结果。

1.3. 数据筛选

对于差异表达基因（differentially expressed genes，DEG）的分析，使用R语言中的limma包，以差异倍数2倍（|log₂FC|>1，P<0.05）为标准，获取差异表达基因并利用R包ggplot2作图。对于GO（gene ontology）富集分析，以P<0.05为标准，用clusterProfiler R packages分析所有差异表达基因，获得显著差异的信号通路。对于共表达分析，选取在0.5 kPa组、106 kPa组的所有差异lncRNA和mRNA，纳入共表达分析网络，根据皮尔森相关系数选取|PCC|>0.95和校正后P<0.05的lncRNA和mRNA对。

1.4. 不同硬度基质的制备

按照文章报道的方法^[6]，我们使用聚二甲基硅氧烷（polydimethylsiloxane，PDMS）（SYLGARD184，道康宁）制备两种不同硬度基质：按质量比40∶1（Stiff）和60∶1（Moderate）在PDMS前驱物A剂中加入B剂（固化剂），充分混匀，排除气泡。将制备的PDMS混合液导入60 mm培养皿中，静置1 h后70 ℃烘烤4~6 h。然后在皿内加入0.2 mg/mL的Ⅰ型胶原溶液（C8062，索莱宝），4 ℃孵育过夜，紫外线照射2 h后用PBS清洗3次用于接种细胞。

1.5. 实时荧光定量PCR（RT-PCR）

将细胞接种于不同硬度PDMS基底培养皿72 h后，提取总RNA（TRizol法，全式金），并反转录成cDNA（AU341，全式金），–20 ℃保存。按照实时荧光定量试剂盒（AQ601，全式金）说明操作，验证候选lncRNAs的表达情况。设计RT-PCR引物序列如下：NEAT1-F：AGTGATGTGGAGTTAAGGCGC；NEAT1-R：CGGGCTTACCAGATGACCAG；LINC00894-F：GGGGCTACTTTGTAAACCAC；LINC00894-R：AAATGAAAACTCAGAGAACAGAC；LINC02535-F：AAGGAGCTCTGTTCTCCAGG；LINC02535-R：GCCTCTATGTAGGGCGCTTT；SNHG8-F：ATCCAAGTGGTAATGGGCGAAG；SNHG8-R：AATAGGTGTCCTGATAACTTCC；GAPDH-F：TGTGGGCATCAATGGATTTGG；GAPDH-R：ACACCATGTATTCCGGGTCAAT。

1.6. 同源重组修复效率分析

DR-U2OS细胞是一种含有GFP报告基因的同源重组（homologous recombination，HR）修复报告系统^[10]。I-SceI酶切导致SceGFP内部产生DNA双链断裂，若利用iGFP进行HR修复，则细胞表达GFP绿色荧光。针对候选lncRNA，分别设计一对shRNA寡核苷酸（上海捷瑞生物工程有限公司，中国），然后退火克隆到pLKO.1空载体上，构建shRNA-NEAT1、shRNA-LINC00894、shRNA-LINC02535、shRNA-SNHG8和shRNA-NC病毒载体。利用HEK293T细胞包装上述shRNA病毒，并感染DR-U2OS细胞。24 h后，用I-SceI限制性内切酶的病毒感染敲低候选lncRNA的DR-U2OS细胞，48 h后用流式细胞术分析表达GFP的阳性细胞比例。shRNA引物序列如下：

shNEAT1-F：TAGAGAAAAGTCCAAAAGGAGCTCGAGCTCCTTTTGGACTTTTCTCTA；shNEAT1-R：TAGAGAAAAGTCCAAAAGGAGCTCGAGCTCCTTTTGGACTTTTCTCTA；shLINC00894-F：GAAGTGTGTGTGGCTGGAAGCTCGAGCTTCCAGCCACACACACTTCC；shLINC00894-R：GAAGTGTGTGTGGCTGGAAGCTCGAGCTTCCAGCCACACACACTTC；shLINC02535-F：GCCGATTGTCACAAAGATCTCGAGATCTTTGTGACAATCGGC；shLINC02535-R：GCCGATTGTCACAAAGATCTCGAGATCTTTGTGACAATCGGC；shSNHG8-F：AGGTGGTCCGTGATAATTAAACTCGAGTTTAATTATCACGGACCACCT；shSNHG8-R：AGGTGGTCCGTGATAATTAAACTCGAGTTTAATTATCACGGACCACCT。

1.7. 药物敏感性

用shRNA病毒感染细胞，敲低候选lncRNA 24 h后将细胞种到96孔板（5 000个/孔）。敲低48 h后，用化疗药物依托泊苷（etoposide，ETO）或者顺铂（cisplatin，CDDP）处理细胞24 h，然后加入CCK8试剂，2~4 h后用酶标仪检测吸光值（OD450）。

1.8. 统计学分析

采用PRISM软件（Graphpad Software Inc.）进行双尾t检验。P值保留小数点后4位，检验水准为0.05。

2. 结果

2.1. 基质硬度调控卵巢癌细胞lncRNAs表达

为了探究不同基质硬度卵巢癌细胞中的lncRNA表达情况及其相关功能，首先对不同基质硬度（Soft组：0.5 kPa；Moderate组：25 kPa；Stiff组：106 kPa）卵巢癌细胞系SKOV3转录组数据（RNA-Seq）进行基因表达主成分分析（principal component analysis，PCA）。结果显示，三种不同基质硬度培养的SKOV3细胞有较好的区分度，重复性较好（见图1a）。利用R软件的limma包筛选不同基质硬度SKOV3细胞的差异表达lncRNAs发现，基质变软或者变硬均会导致细胞内lncRNAs表达发生明显变化。Soft组与Moderate组的lncRNAs表达更为相似，而Stiff组lncRNA的表达谱与Soft组和Moderate组显著不同（见图1b）。以Moderate组为对照，Soft组有35个差异表达lncRNAs（包括28个上调lncRNAs，7个下调lncRNAs）（见图1c），Stiff组有174个差异表达lncRNAs（包括165个上调lncRNAs，9个下调lncRNAs）（见图1d）。进一步地，我们对Soft和Stiff组的所有差异表达lncRNAs进行差异表达基因的共表达分析和GO功能注释。结果显示，基质硬度变化显著影响了卵巢癌细胞的二价无机阳离子平衡、内质网、胶原合成与代谢、平滑肌细胞增殖、内质网细胞分化、质膜黏附分子介导的亲和性细胞黏附、细胞外结构重塑和ECM重塑等生命过程（见图1e）。以上结果表明，基质硬化导致大量lncRNAs的表达上调，基质硬度的确参与了调控卵巢癌细胞lncRNAs的表达并影响卵巢癌细胞的多种生物学过程。

图 1.

Regulation of matrix stiffness on lncRNA expression in ovarian cancer

基质硬度对卵巢癌lncRNA表达的调控

a. PCA分析；b. 差异lncRNA热图；Soft组 (c) 和Stiff组 (d) 差异表达lncRNAs火山图；e. 差异表达lncRNAs共表达的DEG GO功能富集

a. PCA analysis; b. heat map of differentially expressed lncRNAs; volcanic plots of differentially expressed lncRNAs in Soft group (c) and Stiff group (d) respectively; e. GO enrichment analysis of the DEGs correlated with differentially expressed lncRNAs

2.2. 基质硬化相关lncRNAs验证

如图2a所示，与Moderate组相比，Stiff组差异表达lncRNA（174个）的数量明显高于Soft组（35个），而两组共有差异表达lncRNA仅有8个。已知肿瘤的发生发展常常伴随着ECM硬化，为了筛选可能参与应答卵巢癌ECM硬度增加的lncRNAs，我们首先比较了Stiff组174个差异表达lncRNAs的reads数目，从中筛选出28个表达量较高（raw count>100）的lncRNAs（包括26个上调lncRNAs，2个下调lncRNAs）。通过分析26个上调lncRNAs的差异表达倍数（|log₂FC|），从Top 10表达上调lncRNAs中挑选出了2个上调lncRNAs（NEAT1和LINC00894），与上述2个下调lncRNAs（LINC02535和SNHG8）作为4个候选lncRNAs用于后续研究（见图2b）。我们利用PDMS制备Moderate（60∶1）和Stiff（40∶1）两种不同硬度的水凝胶，培养卵巢癌细胞SKOV3 72 h后，收集总RNA并采用RT-PCR技术进一步验证基质硬化对候选lncRNAs（NEAT1、LINC00894、LINC02535和SNHG8）表达的调控作用。如图2c所示，SKOV3细胞在两种硬度PDMS基底上形态良好、增殖正常。与Moderate组相比，Stiff组中NEAT1和LINC00984显著上调，LINC02535和SNHG8明显下调（见图2d），该结果与RNA-Seq结果一致，验证了RNA-Seq测序和分析的重复性和准确性。此外，我们将卵巢癌细胞A2780和HO8910在上述两种硬度的PDMS基底培养72 h后，发现4个候选lncRNAs的表达变化与SKOV3细胞的结果一致（见图2e~f）。

图 2.

Validation of matrix stiffness related lncRNAs

基质硬化相关lncRNAs的验证

a. Stiff组和Soft组差异表达lncRNAs韦恩图；b. 基质硬化相关的候选lncRNAs；c. 不同硬度PDMS基底培养的SKOV3细胞；候选lncRNAs在不同硬度PDMS基底培养的SKOV3（d）、A2780（e）和HO-8910（f）中的表达水平

a. Venn diagrams of differentially expressed lncRNAs in Stiff and Soft groups; b. candidate lncRNAs related to matrix stiffness; c. SKOV3 cells cultured in PDMS substrates with different stiffness; gene expression levels of candidate lncRNAs in SKOV3 (d), A2780 (e) and HO8910 (f) cells cultured in PDMS substrates with different stiffness

2.3. lncRNA SNHG8调控卵巢癌化疗敏感性

目前治疗癌症的化疗药物多为DNA损伤试剂，可以损伤肿瘤细胞DNA，例如造成DNA双链断裂（double-strand break，DSB），进而诱发癌细胞凋亡。已知HR修复是细胞内修复DSB损伤的主要通路，我们首先构建了候选lncRNAs的shRNA病毒载体，利用shRNA在HR报告系统中分别敲低候选lncRNAs（见图3a~b）。结果显示，敲低LINC00894、LINC02535和SNHG8均导致细胞内GFP阳性细胞比例显著降低，而敲低NEAT1则没有明显变化（见图3c~d），暗示LINC00894、LINC02535和SNHG8促进HR通路，很有可能调控DSB修复进程进而影响化疗药物的治疗效果。

图 3.

LINC00894, LINC02535 and SNHG8 participate in HR repair

LINC00894、LINC02535和SNHG8参与HR修复

a. 候选lncRNAs的shRNA敲低效果；b. HR报告系统示意图；c. GFP阳性细胞的流式细胞术代表图；d. HR修复效率

a. gene expression levels of candidate lncRNAs after shRNA transfection; b. schematic diagram of HR reporter; c. representative images of GFP-positive cells analyzed by flow cytometry; d. LINC00894, LINC02535 and SNHG8 knockdown impairs HR repair

依托泊苷作为临床上治疗卵巢癌的有效药物，它主要通过与DNA拓扑异构酶II结合，导致细胞内产生DSB达到抗肿瘤的效果。为了进一步探究基质硬化相关lncRNAs是否影响卵巢癌化疗敏感性，我们在SKOV3细胞中分别敲低候选lncRNAs，48 h后用ETO处理，发现敲低SNHG8显著降低了SKOV3对ETO药物的敏感性，而NEAT1、LINC00894和LINC02535敲低的SKOV3细胞对ETO敏感性没有明显改变（见图4a）。此外，我们还发现SNHG8下调导致SKOV3细胞对顺铂的敏感性也显著降低（见图4b）。与SKOV3细胞结果一致，在卵巢癌细胞系A2780和HO-8910中敲低SNHG8同样导致细胞对ETO和CDDP的敏感性显著降低（见图4c~d）。以上结果说明，基质硬化相关lncRNA SNHG8表达下调严重降低了化疗药物ETO和CDDP对卵巢癌的抗肿瘤效果，暗示lncRNA SNHG8可能与卵巢癌化疗耐药的产生相关。

图 4.

SNHG8 regulates chemotherapy sensitivity of ovarian cancer to etoposide (ETO) and cisplatin (CDDP)

SNHG8调控卵巢癌对依托泊苷（ETO）和顺铂（CDDP）的化疗敏感性

敲低SNHG8降低SKOV3细胞对ETO (a)和CDDP (b)的敏感性；c. 敲低SNHG8降低A2780细胞对ETO和CDDP的药物敏感性；d. 敲低SNHG8降低HO-8910细胞对ETO和CDDP的药物敏感性

SNHG8 knockdown impairs the cellular sensitivity of SKOV3 to ETO (a) and CDDP (b); c. SNHG8 knockdown impairs the cellular sensitivity of A2780 to ETO and CDDP; d. SNHG8 knockdown impairs the cellular sensitivity of HO-8910 to ETO and CDDP

2.4. lncRNA SNHG8与卵巢癌预后呈负相关

通过GEPIA数据库分析，我们发现相比于正常组织，SNHG8在卵巢癌中的表达确实显著下降（见图5a），与基质硬度的增加导致SNHG8表达下调一致（见图2d~f）。此外，如图5b所示，与SNHG8低表达卵巢癌患者相比，SNHG8高表达卵巢癌患者的生存期明显缩短（P=0.011），暗示基质硬化相关lncRNA SNHG8很有可能作为一个新的卵巢癌预后分子标志物。

图 5.

GEPIA analysis

GEPIA分析

a. 正常组织和肿瘤组织中的SNHG8表达水平；b. SNHG8与卵巢癌生存期呈负相关

a. expression levels of SNHG8 in normal and tumor tissues; b. SNHG8 is negatively correlated with the overall survival of ovarian cancer

3. 讨论

卵巢纤维化是诱发卵巢癌的关键因素^[11]，其特点是ECM硬化^[12]。ECM硬化引起的EMT还会导致肿瘤细胞化疗耐药性的产生^[13]。研究报道，ECM硬度可以通过Hippo通路不依赖的方式调控YAP蛋白入核进而促进癌细胞增殖^[14-15]。基质变软会引起铂类化疗药物耐药相关基因ERBB2、BCL-2、MAP3K5、PIK3R1和BIRC3的表达显著升高，导致卵巢癌细胞SKOV3对顺铂的敏感性降低^[16]。另外，越来越多lncRNAs被报道调控肿瘤增殖和转移等过程^[17-19]。例如，MALAT1是目前研究最清楚的肿瘤相关lncRNA^[20]，它通过激活Wnt/β-catenin、EMT、PI3K/AKT和ERK/MAPK多种通路同时促进肿瘤的发生发展^[21]。虽然ECM硬度已经成为直接影响卵巢癌进展和化疗敏感性的重要因素^[22]，但是目前ECM硬度对卵巢癌lncRNA表达谱的影响尚不清楚，基质硬化相关lncRNAs对卵巢癌化疗抗性的具体影响也仍未可知。

以Moderate（25 kPa）组为对照，基质变软对整体lncRNA的表达影响不大，仅有少量lncRNAs表达发生变化。而基质硬度的增加则引起了大量lncRNAs表达上调和少量lncRNAs下调，这与肿瘤发生过程中常常伴随着基质硬度的增加和大量基因的表达上调相一致^[13]。同时，基质硬度调控的差异表达lncRNA主要参与胶原合成代谢、平滑肌细胞增殖、ECM重塑等生物过程。

lncRNA SNHG8是一种小的核仁RNA^[23]，不仅参与转录、翻译、RNA剪切等多种生物学过程^[24]，还与多种恶性肿瘤的发生密切相关，包括非小细胞肺癌^[25]、胃癌^[26]、胰腺癌^[27]、乳腺癌^[28]等。最近，SNHG8被报道能够激活Wnt/β-catenin信号通路^[29]促进卵巢癌进展，沉默SNHG8能显著抑制卵巢癌细胞增殖、迁移和EMT等过程^[30]。我们发现SNHG8参与应答卵巢癌基质硬度的变化，基质硬化导致其表达显著下调，说明SNHG8与卵巢纤维化和卵巢癌的发生密切相关，有可能作为卵巢癌早期诊断的分子标志物，对防治卵巢癌和保护女性生殖健康具有重要意义。敲低SNHG8不仅降低了卵巢癌细胞HR的修复效率，还导致卵巢癌细胞对化疗药物ETO和CDDP的敏感性明显降低，暗示SNHG8参与HR修复，并与卵巢癌化疗耐药呈负相关，但其在DSB损伤修复中的具体功能和分子机制值得进一步深入研究。

4. 结论

本研究成功分析出基质硬化相关的卵巢癌lncRNAs表达谱，筛选出基质硬化相关的关键lncRNA SNHG8。SNHG8在基质硬化过程和卵巢癌组织中的表达均显著下降。SNHG8敲低显著降低了细胞HR修复效率以及对化疗药物ETO和CDDP的敏感性。同时，SNHG8的表达水平与卵巢癌患者的生存期呈负相关。

重要声明

利益冲突说明：本文全体作者均声明不存在利益冲突。

作者贡献声明：程子娜是本研究的实验设计者及实验研究的执行人，负责数据收集、数据分析、论文写作；马晓璐参与本研究的实验设计，数据分析，论文写作；张全有参与本研究的实验设计；陈维毅是本研究的构思者及负责人，指导实验设计、数据分析、论文写作与修改。

Funding Statement

国家自然科学基金项目（11632103，31800684，11872263）；中国博士后科学基金（2021M703206）