活细胞超分辨荧光显微成像技术前沿与进展

Abstract

本文系统综述了活细胞超分辨荧光显微成像技术相关研究进展，探讨了领域内研究现状及热点问题，并归纳总结了超分辨技术在活细胞成像中的应用。本文具体概括了该技术在相关领域取得的多方面研究进展，其中结构光照明显微术、受激发射损耗显微术以及最低光子通量显微术是当前研究的热点和前沿。根据当前领域内的发展态势，本文预计未来基于人工智能和荧光探针及其标记方法的创新将是该领域未来一段时间的重点发展方向。

0. 引言

荧光显微成像技术是探索生命科学和生物医学问题的重要工具，具有其它研究手段不可替代的优势。目前有多类适用于人体疾病模型的可用于荧光显微成像的细胞系，而相较于其他观察方法，细胞成像具有不可比拟的高通量、重复性、可操纵性，是激光共聚焦等主流荧光显微成像方法的核心模型。超分辨荧光显微成像技术可以绕过光学衍射极限对传统光学显微成像分辨率的限制（约200 nm），让激光共聚焦等常规成像模式下观察不到的纳米级结构可视化，从而实现活细胞超微结构的动态超高分辨率追踪，例如对神经细胞突起及树突棘^[1]、线粒体分裂及融合^[2]，以及对内质网^[3]等的观察是其重要的应用场景。活细胞超分辨荧光显微成像是较为新兴的领域，相关研究及应用技术于2 000年之后开始出现，并随着时间呈波动上升趋势，这些研究主要由美国、德国、英国、中国主导。该技术历经20年的发展，至今受到了越来越多的关注和重视，相关领域的研究与应用也越来越广泛。本文旨在全面梳理这一领域的研究现状，并总结相关前沿进展，为读者在该领域的探索提供参考。

1. 活细胞超分辨荧光显微成像技术研究前沿与热点

活细胞超分辨荧光显微成像技术目前的研究热点主要集中于结构光照明显微术（structured illumination microscopy，SIM）、受激发射损耗显微术（stimulated emission depletion microscopy，STED）、最低光子通量显微术（minimal photon fluxes，MINFLUX）这三大方向。

1.1. 结构光照明显微术

SIM是Gustafsson^[4]提出的一种基于频域调制的超分辨技术，基本原理是通过对样品的高频信息和已知的高频光栅进行调制编码后得到低频的摩尔条纹，经相机接收后通过傅里叶变换调整空间域和频域，从而解码出样品细节。相较于能将分辨率提升至20 nm的单分子定位等显微成像技术，SIM受限于成像原理，其横向分辨率普遍最多只能提升至100 nm左右，因而远不及其他超分辨技术。但SIM所具备的快速和大视野宽场成像能力、对荧光标记物的非特异性需求，以及较低的激发光强所带来的低光毒性，使其成为活细胞成像方面最适合、应用最多的超分辨技术^[5-6]。

相较于常规高分辨共聚焦成像，SIM依赖更强的激发光，并且需要捕获多幅原始图以组建最终图像。自该技术普及以来，相继产生了很多致力于缩减捕获原始图像的数量以控制曝光程度并提升时间分辨率的新算法。但总的来说，相较于常规SIM算法，经处理后的图像质量存在偏差并且需要额外调整参数^[7]。随着技术不断进步，深度学习的应用对图像质量的保持起到了较大的改善，在实现高通量成像的同时维持了分辨率等指标^[7-8]。Jin等^[8]将卷积神经网络架构的U型网络（U-Net）用于SIM，经训练后将所需的原始图像数量缩减了5倍，并在低光照（光子数<100×）条件下产出了分辨率接近于常规SIM重构算法的图像，该方法在不同细胞结构下均经过了验证。这项研究首次实现了深度学习方法在低光照条件下对SIM超分辨成像速率的有效提升。后来另一卷积神经网络架构—循环一致性生成对抗网络（cycle-consistent generative adversarial networks，CycleGAN）也被应用于SIM超分辨重构，该方法无需自定义参数，能较简便地在任何SIM数据集中执行，并且不依赖样品结构信息的先验知识^[7]。相较而言，U-Net的训练由于需耗费大量计算资源，其训练效率远不及CycleGAN方法。

超分辨成像中的伪影部分源自于活细胞中移动速率偏快的荧光标记对象。基于此Förster等^[9]提出了一种具备定位活体运动伪影的SIM重构算法，首次在超分辨结果图像中精准定位并标记了运动伪影。该方法让用户能够有机会判断产出的SIM图像是否被活体的运动所影响。该检测程序经修正和完善后增强了稳定性，对偏暗对象的检测灵敏度大幅提升，能够对定位到的运动伪影进行分类^[10]。此外，针对SIM重构算法的固有缺陷导致的重构伪影，Wen等^[11]开发出了基于点扩散函数（point spread function，PSF）工程优化的高保真SIM（high-fidelity SIM，HiFi-SIM）重构算法用于有效去除常规SIM算法产生的重构伪影。通过两部频谱优化流程，Hifi-SIM可在识别活细胞精细结构和偏暗结构的基础上更有效地抑制残留背景荧光信号等常见伪影，并且高背景下常规SIM的光学层切能力也获得了提升。同时，该方法对一些常用的重构相关参数的不敏感性降低了成像后对PSF等参数修正的复杂要求，提升了易用性。

为有效提升活细胞超分辨显微镜的时间分辨率和成像时间，陈良怡团队开发了基于海森矩阵（Hessian matrix）的SIM反卷积算法（Hessian-SIM），利用连续性的多维度生物样品结构作为先验知识指导图像重构^[12]。Hessian-SIM能够以88 nm空间分辨率和188 Hz的速度对活细胞内质网中移动的囊泡和网环进行快速成像并有效屏蔽噪音，首次捕捉到了线粒体嵴与内质网之间的动态相互作用与变化，其特有的高灵敏度及相应的高采集速率大大降低了光漂白，进而显著增强了对活细胞的超分辨连续成像。该方法在低光照下对时间分辨率和成像时间的提升相对于其他算法有极其显著的优势，同时适用于各类SIM模块，但是其空间分辨率仍普遍维持于90～100 nm。基于此，该团队进一步在新计算原理的基础上开发了两部迭代解卷积算法，即稀疏反卷积（sparse deconvolution）方法，将活细胞成像的最高空间分辨率拓展至了60 nm，帧率达到了564 Hz^[13]。相较于常规深度学习超分辨显微重构，sparse deconvolution不依赖于样本形态与荧光显微镜种类，而是基于信号的时空连续性和荧光超分辨图像的相对稀疏性这两个先验知识，因此是可通用的荧光超分辨成像算法，可处理不同荧光显微成像平台产出的各类样品。例如，该方法可用于增进搭载于转盘式激光共聚焦的SIM的分辨率，即便在低信噪比条件下也可获得90 nm空间分辨率的四通道三维活细胞成像。

1.2. 受激发射损耗显微术

STED是由Hell等^[14]的研究团队研发出的远场超分辨显微成像技术，其基本工作原理是在常规点扫描激光共聚焦显微成像系统的基础上添加一束与共聚焦激发光共线的受激发射损耗激光同时照射样品，在荧光团被激发后处于高能态阶段时，STED损耗光以环状的形式重叠在激发光斑中边沿区域，使得这部分的荧光团迅速返回基态而不再发出荧光，从而起到了压缩有效PSF尺寸、提高分辨率的效果。目前商用STED系统的细胞成像经优化可普遍达到50～60 nm的横向分辨率^[15]。STED是仅有的成像过程无需算法处理的纯光学超分辨技术，因而完全规避了引入数学计算所导致的不确定性，同时其工作方式及成像速率类似于常规点扫描共聚焦显微镜，总体而言在活细胞成像领域的应用具有很大的优势。用户可实时调节STED损耗光的功率来调整分辨率，持续增强的损耗光会进一步压缩中央有效激发区域从而解析出更好的分辨率。但分辨率同等程度的提升需要损耗光功率非线性的增强，由此将大幅增加光漂白和光毒性，例如将分辨率提升至30～50 nm需要约10～100 MW/cm²的高功率STED激光^[15]。近年来相继产生了基于时间门控(clock-gating)的STED（gated-STED）以及基于全脉冲匹配的STED（pulsed-STED）等各类改进型成像方法，可在维持分辨率的同时将损耗光功率有效降低^[16-20]。其中比较重要的一项进展是基于人工智能的自适应照明方式的最小动态强度STED (dynamic intensity minimum STED，DyMIN-STED) 的推出，即在扫描中通过样品的标记密度实时调节STED损耗光强，例如仅当荧光团位于扫描区域的中心位置时提供最高功率的损耗光^[21-22]。相较于仪器本身的更新，新型荧光探针的开发与改进在STED的活细胞超分辨成像应用中有着更为直接和重要的影响，因而是该方向目前主要的研究热点^[6]。

D’Este等^[23]在初期基于耐漂白性、高渗透性且细胞膜渗透性强的硅基罗丹明构建了硅基罗丹明-肌动蛋白（silicon rhodamine actin，SiR-Actin）标签，对活海马神经元进行标记并用STED成功表征了先前始终无法清楚判定的肌动蛋白在神经元和轴突始段的分布状态。该实验通过观测活神经元树突与轴突中广泛存在的周期性细胞骨架相关结构，阐明了肌动蛋白对神经元极性的维护作用，同时表明了细胞骨架蛋白在控制和调配神经元功能、发育及可塑性方面存在新的作用。该方法在活神经元中的有效应用，推进了神经生物学的研究，强调了开发合适的特异性荧光探针应用于前沿超分辨成像的重要性，很大程度地刺激了STED活细胞成像应用的需求和发展。后续研究中，Lukinavicius等^[24] 使用新型荧光染料连接紫杉醇以标记微管蛋白，合成了适用于活体和活细胞成像的荧光探针。探针经优化后用STED系统以29 nm空间分辨率对标记的活体人成纤维细胞的微管蛋白进行超分辨成像，超出了先前所有STED活细胞成像所达到的分辨度，而针对荧光基团和配体的进一步优化则可使之标记其他细胞结构。这些工作帮助构建了发展相应结构探针的平台，并有效推进了后续STED超分辨在这些活体结构成像的应用。

活细胞成像很重要的一方面是可对动力学过程进行较长时程的有效观测，但高功率STED利用受激损耗激光对荧光团的快速光漂白以及对细胞的光损伤很大程度限制了这方面的应用。基于此，Wang等^[25]开发出了一种新型黄色高效线粒体靶向（MitoPB Yellow）荧光探针，能够在gated-STED成像下观测活细胞线粒体内膜的动态变化，该探针具备光稳定性强、荧光寿命长、能对活细胞线粒体内膜进行特异性标记等特点。该实验还对活细胞线粒体内膜进行了1.54 帧/s的超过1 000帧的动力学成像，并成功捕捉到了单个线粒体内嵴的快速合并以及线粒体之间的相互融合过程。另外，Yang等^[26]研发出了一种适用于活细胞的低饱和强度和高光稳定性的新型芳酸变体染料，相较于其他同类标记物，其主要优势在于能够在偏低功率的STED光下产生受激辐射，进而让细胞在更加原生状态下进行成像。经完善后的标记方法在实验中以35 nm的分辨率实现了对线粒体内膜长达50 min的延时成像，并清晰地观测到了线粒体融合与裂变过程中线粒体嵴的状态演变。该染料的高特异性以及在低功率STED中的突出表现显示其可作为活细胞线粒体动态超高分辨成像的下一代标准，并能被广泛应用于线粒体相关的细胞行为的研究以及线粒体进化之谜的探索^[26]。

1.3. 最低光子通量显微术

近年来，Balzarotti等^[27]研发出一种新型的单分子定位成像（single molecule localization microscopy，SMLM）方法——最低光子通量显微术（minimal photon fluxes，MINFLUX），并将其用于超分辨成像。该方法利用中心光强为0而往外逐渐增强的环形激发光对同一荧光分子4个特定位置的采集，并依据获得的光子数之前的比例关系来确立荧光分子的空间位置。传统SMLM需要相机持续采集尽量多的衍射极限像点，然后通过算法估算单个荧光分子的中心位置进而重建出结果图像，其定位精度依赖于捕获的光子数而需要较长的采集时间。采集时，如果耗时过长，一方面很大程度限制了成像的时间分辨率，另一方面生物样品（尤其是活体）不可避免的微移也会影响定位精度；再加上长时间成像所导致的光漂白、相机背景、发射态分子未知的极性方向及湍动等因素对相机上光点精度的影响，导致其在生物样品上实际产生的最好分辨率仅约为20 nm。而MINFLUX方法则以尽可能小的激发强度和最少信号光子数（仅为传统质心定位法的1/22），即时标定荧光分子的位置，从而显著提升了定位精度和时间分辨率。

Balzarotti等^[27]的研究显示，MINFLUX技术高达1 nm左右的定位精度可很好地分辨出间距仅6 nm的DNA折纸结构。相较于传统SMLM方法，对活大肠杆菌中单个30 S核糖体蛋白亚单位的动态监测可使时间分辨率提升100倍。随后的实验中，Eilers等^[28]以纳米级别的分辨率将采集时间间隔缩短至1 ms以内。应用MINFLUX技术，后续还实现了对活细胞的三维多通道超分辨成像，以接近单个荧光标记物的分辨率（约2 nm）观察到了人骨肉瘤细胞（U2OS）活细胞中的核孔复合物Nup96蛋白^[29]。该技术同样以纳米级别的分辨率和分子水平的定位精度对线粒体接触位点和嵴组织系统复合物进行了解析^[30]。需要指出的是，MINFLUX偏小的成像视野使其应用相对局限于单分子追踪，难以达到基于相机宽场成像的SIM技术对生物样品大范围特征的把控程度，其实际通量相较于其他超分辨方法尚存较大差距，因而很大程度限制了从中挖掘出具有统计学意义的生物信息的能力^[31]。

目前商用的MINFLUX系统局限于其开创团队德国Abberior公司，相关研发和应用依赖于其自身特殊的定制化显微镜。为扩展应用范围，很重要的一环是抗振系统相关的设计。近期，该团队成功地将MINFLUX在一套标准显微镜上以普通实验流程实现了1～3 nm分辨率等一系列指标，促进了该技术在其他荧光显微成像平台的拓展^[32]。在显微成像的分辨度达到分子级别（1～5 nm）的情况下，对波动和漂移的控制便成为了分辨率进一步提升的重要因素^[32]。另外，荧光探针的标记是超分辨技术发展中的一大关键制约因素，当前光学超分辨成像仅能从所标记的抗原表位的位置信息解析出整体结构，受限于标记物的大小和标记密度，所能达到的分辨率极限在1 nm左右^[31]，突破此限制需要全新的标记策略。

2. 总结与展望

本文全面回顾了近阶段以活细胞超分辨荧光显微成像技术为主题的研究，该领域的研究整体呈现逐年上升趋势，在国内外已形成一定规模的研究群体。该技术的主要发文期刊涵盖了生物物理、生物化学、细胞生物学、分子生物学、信息技术以及材料等各类专业领域，指向该技术多学科交叉的特征。结合近年来各大研究机构的研发动向与活跃度，针对该领域的研究大致是美国与德国处于主导地位，尤其是Hell等^[14]团队开创了STED与MINFLUX两大方向并且主导了其后续的重要进展。总体而言，超分辨技术作为生物成像的一项新兴工具极大推动了生物学的进步，今后也将发挥越来越重要的作用。

SIM是活细胞成像中应用得最早、最广泛、最成熟的超分辨技术，目前主要的工作和研究热点集中于对重构算法的更新，但受其成像原理的制约最多仅能将横向分辨率提升至传统光学显微镜的2倍多。STED和单分子定位术等其他超分辨方法理论上可以将分辨率提升至单分子级别，但实际活体成像中受限于各种因素，难以达到预期的水平。STED这几年研究的主要热点在于各类荧光探针的更新和优化，并且侧重于降低成像方式对活细胞的光毒性。MINFLUX则是目前唯一的三维分辨率可达到2～3 nm的光学成像系统，但其应用范围局限于单分子追踪，后续各方面的推广和发展有待观察。值得关注的是，新型荧光探针及标记方法的开发可能在未来技术突破中起到关键性的作用。另外，人工智能算法对超分辨技术各方面的拓展和更新也起到了很大的作用，一直是医学成像领域中的热门课题，预计未来基于这方面的新兴应用和探索会逐渐增多，并产出能进一步助力生物医学科研的成果。

重要声明

利益冲突声明：本文全体作者均声明不存在利益冲突。

作者贡献声明：程雨飞撰写论文初稿，李薇、金婷婷、吴思思参与修改论文，张龙浩指导、修改及审校论文。

Funding Statement

四川大学华西医院学科卓越发展1·3·5工程项目（ZYGD18014）

West China Hospital of Sichuan University