重复经颅磁刺激对后肢去负荷小鼠神经元兴奋性及离子通道影响的研究

Abstract

Weightlessness in the space environment affects astronauts’ learning memory and cognitive function. Repetitive transcranial magnetic stimulation has been shown to be effective in improving cognitive dysfunction. In this study, we investigated the effects of repetitive transcranial magnetic stimulation on neural excitability and ion channels in simulated weightlessness mice from a neurophysiological perspective. Young C57 mice were divided into control, hindlimb unloading and magnetic stimulation groups. The mice in the hindlimb unloading and magnetic stimulation groups were treated with hindlimb unloading for 14 days to establish a simulated weightlessness model, while the mice in the magnetic stimulation group were subjected to 14 days of repetitive transcranial magnetic stimulation. Using isolated brain slice patch clamp experiments, the relevant indexes of action potential and the kinetic property changes of voltage-gated sodium and potassium channels were detected to analyze the excitability of neurons and their ion channel mechanisms. The results showed that the behavioral cognitive ability and neuronal excitability of the mice decreased significantly with hindlimb unloading. Repetitive transcranial magnetic stimulation could significantly improve the cognitive impairment and neuroelectrophysiological indexes of the hindlimb unloading mice. Repetitive transcranial magnetic stimulation may change the activation, inactivation and reactivation process of sodium and potassium ion channels by promoting sodium ion outflow and inhibiting potassium ion, and affect the dynamic characteristics of ion channels, so as to enhance the excitability of single neurons and improve the cognitive damage and spatial memory ability of hindlimb unloading mice.

0. 引言

太空环境中，失重是影响航天员认知功能和学习记忆的重要因素，直接影响航天任务的完成。研究人员对一名德国航天员进行为期8天的认知和精神运动功能测试，检测结果发现失重环境影响航天员的逻辑推理和决策功能、记忆检索功能，以及精细的手动控制等认知能力^[1-3]。此外，失重对太空飞行前后航天员的警觉度和认知节律均产生影响^[4]。开展失重环境对航天员认知功能影响潜在机制的研究多采用后肢去负荷（hindlimb unloading，HU）模型^[5]。对大鼠进行不同天数的尾吊，随着尾吊天数的增加，小鼠的空间认知和学习记忆能力出现显著的障碍^[6-7]。模拟失重导致的认知功能障碍可能与神经元变化有关。小鼠经过尾吊14天后，海马齿状回（dentate gyrus，DG）环路的神经节律与能量代谢均发生改变，这些变化对模拟失重小鼠谷氨酸系统和情绪行为产生了显著的影响^[8-9]。

重复经颅磁刺激（repetitive transcranial magnetic stimulation，rTMS）作为一种非侵入式的刺激脑区的新型神经治疗技术，具有临床应用和实验研究价值^[10-11]。它是基于法拉第电磁感应定律，通过作用于大脑皮质层产生的感应电流来影响神经元兴奋性^[12-13]。2015年，美国FDA已批准rTMS用于治疗单向抑郁症。有学者发现5 Hz高频rTMS能显著改善帕金森病患者的执行能力和空间规划任务能力^[14-15]。也有研究表明高频rTMS能通过提高DG区颗粒细胞的神经元兴奋性来改善老年鼠的相关认知障碍^[16-19]。但是关于rTMS对HU小鼠认知功能影响的相关机制还不明确。

神经元兴奋性是神经元在受到刺激后膜电位变化的重要动力学机制^[20-21]。带电粒子的跨膜运动产生膜电位，其变化规律与膜上钠、钾通道的开放与关闭密切相关。其中电压门控型离子通道主要存在于可兴奋细胞上，对膜电位的变化产生重要的影响^[22]。电压门控型钠通道主要作用于动作电位的上升支，电压门控型钾通道主要作用于动作电位的下降支。瞬时外向钾通道（transient outward potassium，I_A）主要参与膜电位的复极化过程，影响细胞膜电位的产生^[23]。延迟整流钾通道（delayed rectifer potassium，I_K）的幅值影响动作电位峰值和频率，对神经元的兴奋性起关键作用^[24]。本文通过研究rTMS对HU小鼠神经元兴奋性的影响，以及对电压门控钠、钾离子通道的调控作用，探究rTMS改善HU小鼠神经元兴奋性的内在作用机制。

1. 材料与方法

1.1. 实验设备

见表1。

表 1. The experimental facilities.

实验设备

实验仪器	生产厂家	产地
新物体识别实验箱	赛昂斯生物科技有限公司	中国江苏
水迷宫实验设备	赛昂斯生物科技有限公司	中国江苏
重复经颅磁刺激仪	武汉依瑞德医疗设备新技术有限公司	中国武汉
FE28 pH剂量仪	Mettler Toledo	瑞士
刺激隔离器	Plexon	美国
尾吊鼠笼	自制	中国西安
全自动振动切片机	Leica	德国
数显恒温水浴锅	邦西仪器科技有限公司	中国上海
P-97玻璃电极拉制仪	Sutter	美国
Milli-Q纯水仪	Millipore	美国
EPC 10双通道膜片钳放大器	HEKA	德国
渗透压仪	雅森国际集团有限公司	中国北京
CM3050S冷冻切片机	Leica	德国

1.2. 实验设计

实验所用动物为8周龄雄性C57小鼠，从北京华阜康生物科技有限公司购买。动物实验遵守河北工业大学伦理委员会的准则，完全符合实验动物使用标准。C57小鼠在恒温（25 ± 1）℃的笼子里适应性喂养1周，保证充足的水与食物。光照/黑暗周期为12 h。适应性喂养结束后。将18只小鼠随机分成3组：对照组（sham，n = 6），尾吊组（HU，n = 6），尾吊+磁刺激组（HU+rTMS，n = 6）。HU组和HU + rTMS组小鼠尾吊14天，建立尾吊模型，模拟失重环境下实验小鼠的状态。HU模型建立的同时，HU + rTMS组小鼠进行rTMS刺激，连续刺激14天。而对照组和尾吊组小鼠进行假刺激，只能听到磁刺激的声音，但是不进行磁刺激。实验模型建立后立即进行电生理实验。具体实验流程及时间安排如图1所示。

图 1.

Experimental design

实验设计流程图

1.3. 重复经颅磁刺激

实验采用依瑞德公司生产的CCY-IA型高性能磁场刺激仪，线圈采用型号Y064动物标准圆型线圈，外型尺寸为64 mm×30 mm，内线圈外径56 mm，内径14 mm，高23 mm。最大磁场输出强度为3.6 T。刺激方案采用高频15 Hz，刺激强度约为0.3 T，每天刺激1 000个脉冲，连续刺激14天。线圈平行于小鼠顶骨，放置于头皮表面之上2～3 mm处。刺激时间为每天上午8:00―10:00。Sham组和HU组小鼠接受假刺激，将线圈垂直于小鼠头顶放置，不接受刺激。

1.4. 后肢去负荷模型

HU模型是在参考前人研究^[5]的基础上建立的。采用有机玻璃定制25 cm × 25 cm × 30 cm大小的尾吊鼠笼，用医用胶带固定小鼠的尾部。具体方法如下：用温水或75%酒精清洗小鼠尾部，这样可以让后续的胶带粘得更牢；用两条医用胶带垂直粘贴小鼠尾巴的两边，两端之间留一段距离；将两条医用胶带水平粘贴在小鼠尾部的根部和末端，固定垂直胶带；靠近尾部胶带的一端与鼠笼细线连接，另一端固定在专业鼠笼的滚轮上；调整细线的长度，使小鼠后肢处于悬空状态，躯干与水平面之间大约成30°角。需要注意的是，允许小鼠自由活动，获得足够的食物和水。

1.5. 全细胞膜片钳实验

1.5.1. 切片准备

用2%的异氟烷气体麻醉小鼠，小鼠在深度麻醉状态下被迅速断头，剪开头皮和颅骨，完整取出大脑，用刀片修切大脑前后端，保证大脑的平整，把大脑浸入提前准备好的冰水混合状态且氧饱和的切片液中，整个过程不超过3 min；设置震动切片机的切片程序，将大脑切成300 μm厚度的脑片，取其中有完整海马的脑片并将其移入30 ℃恒温的人工脑脊液（artificial cerebrospinal fluid，ACSF）中孵育1 h。在实验记录中，ACSF中充入含95% O₂和5% CO₂的混合气体维持氧饱和状态。相关溶液配方如表2所示。

表 2. Solution formulation.

溶液配方

溶液	配方（浓度单位为 mmol/L）
注：溶液调节pH至7.4
ASCF	NaCl 124、KCl 3、CaCl2 2、MgCl2 2、NaH2PO4 1.625、NaHCO3 26、glucose 11、HEPES 5
切片液	KCl 2.5、CaCl2 1、MgCl2 6、NaH2PO2 1.625、NaHCO3 26、glucose 11、sucrose 220
钠离子记录外液	NaCl 130、KCl 3、CaCl2 2、MgCl2 2、glucose 10、HEPES 10、TEA-Cl 25、4-AP 3、CdCl2 0.2
钠离子电极内液	CsCl 140、MgCl2 2、EGTA 10、HEPES 10、Mg-ATP 2
钾离子记录外液	NaCl 130、KCl 5、CaCl2 2、MgCl2 1、glucose 10、HEPES 10、TTX 0.001、CdCl2 0.2、TEA-Cl 25（IA）、4-AP 3（IK）
钾离子电极内液	KCl 140、MgCl2 2、EGTA 10、HEPES 10、Mg-ATP 2

1.5.2. 电生理实验操作

脑片孵育完成后，选择海马完整的脑片移入培养记录槽中，用盖网进行固定；培养记录槽中加入氧饱和的相关电生理外液，使用正置显微镜下低倍镜观察脑片状态，将海马移入视野中央；切换镜头，高倍镜下找到海马DG区位置，观察DG区颗粒细胞状态，从中挑选一个状态饱满的颗粒细胞作为目标细胞，将细胞移到视野中央并做好标记；将电极内液注射到拉制好的玻璃微电极中，使用微操装置将电极入液，观察Patchmaster软件界面上的入液电阻值，确保电阻在4～10 MΩ之间；将电极尖端与目标细胞膜接触并处于轻压状态，释放正压，直至软件上的电阻达到GΩ完成高阻封接；对电极施加快电容补偿，通过短而迅速的抽吸三通，给予电极负压，直至目标细胞膜破裂，阻值骤降到200～300 MΩ左右达到稳定。相关溶液配方如表2所示。

1.5.3. 信号记录

动作电位的记录：全细胞膜片钳实验以DG区颗粒细胞为实验对象，采用全细胞电流钳记录模式，通过刺激器给目标细胞施加电流刺激产生动作电位，按照设定好的程序，采集细胞膜的静息膜电位和动作电位相关信号变化，记录静息膜电位的幅值、动作电位的放电频数以及单个动作电位的相关指标，如动作电位的峰值、动作电位达峰时间、动作电位阈值、动作电位半波宽，以及动作电位最大上升斜率和最大下降斜率。

钠、钾离子通道的记录：采用电压钳模式，记录电压门控型钠、钾离子通道电流，绘制I-V曲线、激活曲线、失活曲线和复活曲线。通过观察I-V曲线的电流峰值的变化，分析激活、失活和复活过程中相关动力学特征的变化。

1.5.4. 离子通道电流I-V、激活、失活及复活程序的设定

I_Na的I-V曲线的刺激程序：采用Whole-cell膜片钳技术，利用电压钳模式，设定膜电位为−70 mV，刺激器对目标细胞施加–80 ～ +50 mV的脉冲电压，以10 mV为增量依次增加，每个脉冲的刺激时间为20 ms，在PatchMaster软件上记录到全细胞电流峰值的变化情况。

I_Na的激活曲线的刺激程序：采用Whole-cell膜片钳技术，利用电压钳模式，设定膜电位为–70 mV，对目标细胞施加–120 mV条件脉冲电压，每个脉冲的刺激时间为100 ms，再次施加–90 ～ +10 mV的刺激脉冲电压，以10 mV为增量依次增加，每个脉冲的刺激时间为20 ms，通过先条件脉冲刺激、后测试脉冲刺激的方式记录到I_Na的激活过程。

I_Na的失活曲线的刺激程序：用Whole-cell膜片钳技术，利用电压钳模式，设定膜电位为–70 mV，对目标细胞施加–100 ～ +10 mV的条件脉冲刺激，以10 mV为增量依次增加，每个脉冲的刺激时间为100 ms，再次施加–30 mV的刺激脉冲电压，每个脉冲的刺激时间为20 ms，通过这种先条件脉冲刺激、后测试脉冲刺激的方式记录到I_Na的失活过程。

I_Na的复活曲线的刺激程序：采用Whole-cell膜片钳技术，利用电压钳模式，设定膜电位为–70 mV，对目标细胞施加–30 mV条件脉冲电压，每个脉冲的刺激时间为25 ms，再次施加同样条件的刺激脉冲电压，两个脉冲电压之间保持膜电位为–70 mV，刺激间隔为2 ～ 26 ms，以2 ms为增量依次增加，通过双脉冲刺激记录得到I_Na复活过程。

I_A和I_K的I-V刺激参数为：采用Whole-cell膜片钳技术，利用电压钳模式，I_A设定膜电位为–100 mV，I_K设定膜电位为–50 mV，刺激器对目标细胞施加–50 ～ +90 mV的脉冲电压，以10 mV为增量依次增加，I_A每个脉冲的刺激时间为150 ms，I_K每个脉冲的刺激时间为300 ms。在PatchMaster软件上记录到全细胞电流峰值的变化情况。

I_A和I_K的激活刺激参数：采用Whole-cell膜片钳技术，利用电压钳模式，设定I_A膜电位为–100 mV，I_K膜电位为–50 mV，对目标细胞施加–110 mV条件脉冲电压，每个脉冲的刺激时间为400 ms，I_A再次施加–40 ～ +70 mV的刺激脉冲电压，I_K再次施加–50 ～ +90 mV的刺激脉冲电压，以10 mV为增量依次增加，每个脉冲的刺激时间为150 ms，通过这种先条件脉冲刺激、后测试脉冲刺激的方式记录到I_A和I_K的激活过程。

I_A的失活刺激参数为双脉冲刺激：用Whole-cell膜片钳技术，利用电压钳模式，设定膜电位为–100 mV，对目标细胞施加–100 ～ +10 mV的条件脉冲刺激，以10 mV为增量依次增加，每个脉冲的刺激时间为80 ms，再次施加+50 mV的刺激脉冲电压，每个脉冲的刺激时间为80 ms，通过这种先条件脉冲刺激、后测试脉冲刺激的方式记录到I_Na的失活过程。

I_A的复活刺激参数：采用Whole-cell膜片钳技术，利用电压钳模式，设定膜电位为–100 mV，对目标细胞施加+50 mV条件脉冲电压，每个脉冲的刺激时间为80 ms，再次施加同样条件的刺激脉冲电压，两个脉冲电压之间保持膜电位为–100 mV，刺激间隔为2 ～ 256 ms，以2 ms为增量依次增加，通过双脉冲刺激记录得到I_A复活过程。

1.5.5. 离子通道电流I-V、激活、失活及复活曲线的绘制

① I-V曲线：以脉冲电位为横轴，电流峰值为纵轴绘制离子通道的I-V曲线。

② 激活曲线：刺激器通过给目前细胞施加递增的脉冲电压，记录的离子通道电流的变化情况。利用式(1)将记录到的电流值变化转为电导值，以施加的脉冲电压（V_m）为横轴，G/G_max为纵轴，绘制离子通道的激活曲线。

1

式中，G为脉冲电压下离子通道的电导值，V_m为不同的脉冲电压，V_r为反转电位。

之后利用式(2) Boltzmann方程进行拟合：

2

式中，G_max为所有脉冲电压下离子通道的最大电导值，V_1/2为离子通道激活一半的膜电位，叫做半数激活电压。k为斜率因子。

③ 失活曲线：刺激器通过对目标细胞施加条件脉冲和测试脉冲，记录离子通道失活过程。以施加的脉冲电压（V_m）为横轴，以I/I_max为纵轴，绘制离子通道的失活曲线。用式(3) Boltzmann方程I/I_max进行拟合。

3

式中，I和I_max分别是每条测试脉冲下离子通道电流的峰值和最大电流峰值。V_m为不同的脉冲电压，V_1/2为离子通道失活一半的膜电位，叫做半数失活电压。k为斜率因子。

④ 复活曲线：刺激器通过对目标细胞施加相同的条件脉冲和测试脉冲，记录离子通道复活过程。以恢复间隔时间t为横轴，I₂/I₁为纵轴，利用公式(4)单指数方程进行拟合。

4

式中，I₂为不同恢复时间的电流峰值，I₁为条件脉冲诱发的电流峰值，t为恢复间隔时间，τ为恢复时间常数。

1.5.6. 数据及统计分析

膜片钳实验所有信号数据均由德国HEKA公司的PatchMaster软件采集记录。Origin软件和GraphPad Prism软件对信号进一步处理和统计学分析，采用单因素方差分析方法统计比较各组之间的差异，事后分析（即组间的多重比较）使用由Bonferroni检验修正的配对t检验进行。统计结果以mean ± SEM表示，检验标准为0.05。

2. 数据分析结果

2.1. rTMS对HU小鼠海马DG区神经元兴奋性的影响

rTMS对静息膜电位和动作电位放电频数的影响如图2所示。三组小鼠的静息膜电位存在显著差异。HU组的静息膜电位显著低于sham组（P < 0.001），HU + rTMS组的静息膜电位显著高于HU组（P < 0.001）。三组小鼠动作电位放电频数也表现出显著差异，HU组动作电位放电频数显著低于sham组（P < 0.001），HU + rTMS组动作电位放电频数显著高于HU组（P < 0.001）。

图 2.

The change in resting membrane potential and frequency of the AP (^*** P < 0.001)

静息膜电位和动作电位频数变化（^*** P < 0.001）

对于单个诱发动作电位，分析动作电位的峰值、达峰时间、阈值、半波宽度、最大上升斜率和最大下降斜率。rTMS对单个动作电位的影响如图3所示。

图 3.

The individual AP changes in each indicator (^* P < 0.05, ^*** P < 0.001)

单个动作电位各项指标变化（^* P < 0.05，^*** P < 0.001）

三组小鼠的动作电位峰值无显著差异。三组小鼠的达峰时间存在显著差异，HU组小鼠的动作电位达峰值时间显著高于sham组和HU + rTMS组（P < 0.001）。三组小鼠的动作电位的阈值存在显著差异，HU组阈值显著高于sham组（P < 0.001），HU + rTMS组阈值显著低于HU组（P < 0.001）。三组小鼠的动作电位的半波宽存在显著差异，HU组的半波宽显著高于sham组（P < 0.001），HU + rTMS组的半波宽显著低于HU组（P < 0.001）。三组小鼠动作电位最大上升斜率存在显著差异，HU组动作电位的最大上升斜率显著低于sham组（P < 0.001），HU + rTMS组最大上升斜率显著高于HU组（P < 0.05），但低于sham组。三组小鼠动作电位最大下降斜率存在显著差异，HU组的最大下降斜率显著低于sham组和HU + rTMS组（P < 0.001）。

通过对静息膜电位以及动作电位的分析，实验发现单个动作电位相关指标在HU模型中大都表现出显著的下降，而在rTMS的作用下，这些下降指数都表现出显著的改善。AP相关电生理指标分析，在刺激电流的作用下，HU小鼠的动作电位放电频数更少，表明在静息状态下HU小鼠神经元的幅值更低，更难以兴奋，受到外界刺激时，产生相同诱发电位所需要的刺激更大。AP达峰时间的变化与最大上升斜率的变化趋势基本相同，达峰时间越短，表明膜电位变化的速度越快，斜率也越大。而这些HU引起的神经元兴奋性的减弱在rTMS的作用下有显著的改善，表明rTMS改善HU引起的认知障碍与神经元兴奋性的增强有关。

2.2. rTMS对海马DG区电压门控钠离子通道的影响

2.2.1. rTMS对I_Na电压和电流（I-V）曲线的影响

钠离子通道的电流示意图和I-V曲线如图4所示，分析同一脉冲电压下三组小鼠的电流峰值，研究发现HU组小鼠的钠离子通道电流显著低于sham组，而HU + rTMS组的钠通道电流峰值显著高于HU组。并当膜电位等于–20 mV时，三组小鼠的钠离子电流峰值差异达到最大。研究表明，rTMS可以显著地提高HU小鼠钠离子通道的电流，但不能恢复到正常水平。

图 4.

The I-V curve of I_Na (^* P < 0.05, ^** P < 0.01, ^*** P < 0.001 vs. HU; ^### P < 0.001 vs. sham)

三组小鼠I_Na的I-V变化（^* P < 0.05，^** P < 0.01，^*** P < 0.001 vs. HU；^### P < 0.001vs. sham）

2.2.2. rTMS对I_Na激活过程的影响

I_Na的激活过程的电流示意图和激活曲线如图5所示。与HU组相比，sham组和HU+rTMS组的激活曲线在–40 mV处显著左移。经过统计学分析发现，sham组的V_1/2与HU组相比有所减小（P < 0.05），HU + rTMS组与HU组的V_1/2之间无显著差异。三组的斜率因子k无显著差异，表明rTMS对钠离子通道的激活过程无显著影响。钠离子通道激活过程的动力学参数变化见表3。

图 5.

The activation curve of I_Na

I_Na激活动力学变化曲线

表 3. The activation parameters of I_Na (n = 6).

I_Na激活曲线的动力学参数（n = 6）

组别	V1/2/mV	斜率因子k
注：*P<0.05 vs. HU
sham	–24.85 ± 1.37*	8.86 ± 1.22
HU	–22.74 ± 0.58	4.68 ± 0.49
HU+rTMS	–23.41 ± 0.93	4.50 ± 0.76

2.2.3. rTMS对I_Na失活过程的影响

I_Na的失活过程的电流示意图和失活曲线如图6所示。观察发现与HU组相比，sham组和HU + rTMS组的失活曲线显著右移，sham组的失活曲线与HU + rTMS组相比，右移更显著。经过统计学分析发现，与HU组相比，sham组和HU + rTMS组的V_1/2发生显著变化，sham组的V_1/2为（–44.61 ± 1.08）mV（P < 0.01），HU + rTMS组的V_1/2为（–53.81 ± 0.86）mV（P < 0.05）。斜率因子k的差异没有统计学意义。I_Na的稳态失活过程的动力学参数见表4。

图 6.

The inactivation curve of I_Na

I_Na失活动力学变化曲线

表 4. The inactivation and recovery parameters of I_Na.

I_Na失活和复活曲线的动力学参数

组别	INa失活曲线参数（n = 6）			INa复活曲线参数（n = 6）
	V1/2/mV	斜率因子k		时间常数τ/ms
注：* P<0.05，** P<0.01 vs. HU
sham	–44.61 ± 1.08**	5.93 ± 0.93		9.63 ± 1.10**
HU	–61.09 ± 0.82	6.74 ± 0.72		35.55 ± 8.05
HU + rTMS	–53.81 ± 0.86*	7.39 ± 0.77		8.48 ± 0.63**

2.2.4. rTMS对I_Na复活过程的影响

I_Na的复活过程的电流示意图和复活曲线如图7所示。观察发现与HU组相比，sham组和HU + rTMS组的复活曲线显著左移，sham组与HU + rTMS组相比无显著差异。经过统计学分析发现，与HU组相比，sham组和HU + rTMS组的恢复时间常数τ发生显著变化，sham组的τ为（9.63 ± 1.10）ms（P < 0.01），HU+rTMS组的τ为（8.48 ± 0.63） ms（P < 0.01）。I_Na的复活过程的动力学参数见表4。

图 7.

The recovery curve of I_Na

I_Na复活动力学变化曲线

2.3. rTMS对海马DG区电压门控型钾离子通道的影响

2.3.1. rTMS对I_A和I_K的电压-电流（I-V）曲线的影响

I_A和I_K的电流示意图和I-V拟合曲线图如图8所示。统计学分析表明，rTMS对HU小鼠I_A和I_K的电流峰值有显著影响。观察I_A和I_K的I-V曲线，发现HU组的峰值电流显著高于rTMS组和sham组。实验结果表明rTMS对峰值电流有一定的抑制作用，但rTMS组并没有回到sham组的水平。具体来说，电流峰值表现出明显的电压依赖性，不同的电压刺激下，电流峰值以不同的方式下降。

图 8.

I-V curve of I_A andI_K (^* P < 0.05, ^** P < 0.01, ^*** P < 0.001 vs. HU; ^# P < 0.05, ^###P < 0.001 vs. sham)

I_A和I_K的I-V变化曲线（^* P < 0.05，^** P < 0.01，^*** P < 0.001 vs. HU；^# P < 0.05，^### P < 0.001 vs. sham）

2.3.2. rTMS对I_A和I_K的激活曲线的影响

I_A和I_K的激活过程的电流示意图和激活曲线如图9所示。与HU组相比，sham组和HU + rTMS组的激活曲线显著向右偏移。分析I_A的激活动力学参数发现，与HU组相比，sham组的V_1/2显著增大为（–9.84 ± 2.03）mV（P < 0.001），HU + rTMS组的V_1/2也显著增大为（–12.34 ± 1.58）mV（P < 0.01）。分析I_K的激活动力学参数发现，与HU组相比，sham组的V_1/2显著增大为（8.46 ± 0.58）mV（P < 0.001），HU + rTMS组的V_1/2也显著增大为（–4.76 ± 1.47）mV（P < 0.05）。sham组的斜率因子k与HU组相比略微增大，HU组和HU + rTMS组之间斜率因子k的差异无统计学意义。结果表明rTMS影响了I_A激活过程。I_A激活过程的动力学参数变化见表5，I_K激活过程的动力学参数变化见表6。

图 9.

The activation dynamics curve of I_A and I_K (^* P < 0.05, ^** P < 0.01, ^*** P < 0.001 vs. HU)

I_A和I_K的激活动力学变化曲线（^* P < 0.05，^** P < 0.01，^*** P < 0.001 vs. HU）

表 5. The activation parameters of I_A (n = 6).

I_A激活曲线的动力学参数（n = 6）

组别	V1/2/mV	斜率因子k
注：* P < 0.05，** P < 0.01，*** P < 0.001 vs. HU
sham	–9.84 ± 2.03***	27.95 ± 2.04*
HU	–26.47 ± 0.66	24.13 ± 0.68
HU + rTMS	–12.34 ± 1.58**	24.94 ± 1.54

表 6. The activation parameters of I_K (n = 6).

I_K激活曲线的动力学参数（n = 6）

组别	V1/2/mV	斜率因子k
注：* P < 0.05， *** P < 0.001 vs. HU
sham	8.46 ± 0.58***	23.53 ± 0.62*
HU	–21.21 ± 2.17	21.78 ± 1.24
HU + rTMS	–4.76 ± 1.47*	24.17 ± 1.25***

2.3.3. rTMS对I_A的失活曲线的影响

I_A的失活过程的电流示意图和失活曲线如图10所示。观察发现与HU组相比，sham组和HU+rTMS组的失活曲线显著左移，sham组的失活曲线与HU + rTMS组相比，左移更显著。经过统计学分析发现，与HU组相比，sham组和HU + rTMS组V_1/2发生显著变化，sham组的V_1/2为（–54.26 ± 40.32）mV（P < 0.01），HU + rTMS组的V_1/2为（–45.45 ± 0.39）mV（P < 0.05）；sham组的斜率因子k增大为7.64 ± 0.25（P < 0.05）。I_A的失活过程的动力学参数见表7。

图 10.

The inactivation dynamics curve of I_A (^* P < 0.05, ^** P < 0.01, ^*** P < 0.001 vs. HU)

I_A的失活动力学变化曲线（^* P < 0.05，^** P < 0.01，^*** P < 0.001 vs. HU）

表 7. The inactivation and recovery parameters of I_A.

I_A失活和复活曲线的动力学参数

组别	IA失活曲线参数（n = 6）		IA复活曲线参数（n = 6）
	V1/2/mV	斜率因子k	时间常数τ/ms
注：* P < 0.05，** P < 0.01 vs. HU
sham	–54.26 ± 40.32**	7.64 ± 0.25*	10.32 ± 1.75*
HU	–39.04 ± 0.28	8.61 ± 0.29	6.65 ± 0.63
HU + rTMS	–45.45 ± 0.39*	7.73 ± 0.35	8.44 ± 1.05*

2.3.4. rTMS对I_A的复活曲线的影响

I_A的复活过程的电流示意图和复活曲线如图11所示。三组之间无显著变化。经过统计学分析发现，与HU组相比，sham组和HU + rTMS组的恢复时间常数τ明显增大，sham组的τ为（10.32 ± 1.75）ms（P < 0.05），HU + rTMS组的τ为（8.44 ± 1.05）ms（P < 0.05）。I_A的复活过程的动力学参数见表7。

图 11.

The recovery dynamics curve of I_A

I_A的复活动力学变化曲线

3. 讨论

DG区颗粒神经元细胞在海马学习记忆和神经传递中起着十分关键的作用。当DG区产生新的神经元时，被试者的认知功能和情绪能力都会发生显著的变化^[25]；当DG区受损时，大部分海马依赖的记忆功能也会降低^[26]。因此，提高DG颗粒细胞的神经元兴奋性可能成为改善认知功能障碍的潜在研究机制。本文将rTMS作为神经调控手段，以海马为目标区域，神经细胞为目的神经元，研究rTMS对HU引起的认知损伤的改善作用。实验从神经电生理角度进行研究，探究rTMS对认知功能改善的电生理机制。

我们通过离体脑片膜电位实验，研究rTMS对HU小鼠的神经元兴奋性的影响。通过分析发现，在刺激电流的作用下，HU小鼠的动作电位放电频数更少，静息膜电位向去极化方向移动，整体动作电位水平下降，在静息状态下HU小鼠神经元的幅值更低，更难以兴奋，当受到外界刺激时，产生相同诱发电位所需要的刺激更大，表明HU小鼠的神经元兴奋性降低。单个动作电位的相关指标在HU模型中大都表现出显著的变化，AP达峰时间、半波宽和阈值等指标明显上升，而达峰时间越长，半波宽越大，膜电位变化的速度越慢，最大上升斜率也越小，均提示神经元兴奋性的减弱。而这些HU引起的神经元兴奋性的减弱在rTMS的作用下有显著的改善，表明rTMS改善HU引起的认知障碍与神经元兴奋性的增强有关。

膜电位是带电粒子的跨膜运动产生的，在哺乳动物中枢神经系统中，细胞膜上动作电位的变化与离子通道的打开和关闭有关^[27]。AP的达峰时间越短，半波宽越小，代表离子通道开放和关闭的速度越快^[28]，最大上升斜率越大，代表膜电位水平变化的最大速度越大。rTMS明显改善了HU引起的神经元动作电位的相关电生理指标，表明离子通道发生了相应的变化。离子通道具有选择透过性，可以帮助生物体细胞与外界环境进行能量传递和物质交换。其中钠通道主要作用于AP的上升支，钾通道主要作用于AP的下降支。I_A主要参与膜电位的复极化过程，影响细胞膜电位的产生^[23]。I_K的幅值则对动作电位峰值和频率产生重要的作用，从而影响神经元的兴奋性^[24,29]。

我们的研究结果证实了rTMS对HU小鼠神经元细胞钠、钾离子通道的调节作用。实验通过全细胞膜片钳技术研究rTMS对HU小鼠相关离子通道的影响。rTMS增加了I_A和I_K的峰值电流和激活曲线的斜率因子，说明激活的电压灵敏度降低，激活曲线右移，半数激活电压V_1/2增大，说明钾离子通道较难激活。对于I_A失活动力学曲线，在rTMS作用下，失活曲线左移，半数失活电压V_1/2减小。这说明rTMS后的失活过程显著缩短。这些钾离子通道的动态特性表明，rTMS通过抑制I_A和I_K，降低了钾离子流出量。I_Na的激活、I_A和I_K的抑制共同提高了神经元的兴奋性。已有类似的研究揭示了调控离子通道可影响神经元兴奋性的变化。研究人员发现通过减少I_A和I_K通道的开放数量可以抑制钾离子通道电流，从而增加神经元的兴奋性^[30]。另一项研究发现，对老年小鼠施加连续14天的高频rTMS，膜片钳记录显示，经过rTMS刺激后，老化小鼠的海马角1区（CA1）锥体神经元放电显著增加，后极化现象减少，动作电位个数显著增加，这些指标的变化与本研究中的结果变化一致，而这些动作电位指标的变化可能与电压依赖型Ca⁺通道的电生理变化有关，表明神经元兴奋性的变化与离子通道的开放和关闭密切相关，可能是rTMS改善认知功能的潜在机制之一^[31-33]。

本研究表明rTMS在刺激小鼠脑部过程中，产生的磁场可能会影响钠、钾离子通道蛋白，导致带电离子的跨膜运动从而改变细胞膜内外的电位水平，从而改变神经元兴奋性，为治疗失重导致的认知损伤提供了一定的理论基础。目前，关于rTMS改善太空失重导致的认知功能损伤的作用机制尚无定论。因此，深入研究磁刺激对神经调控的电生理机制仍是未来神经电磁调控的研究重点。

4. 结论

rTMS通过影响钠离子和钾离子通道的激活、失活和失活后再复活过程的动力学特性，改变了离子通道活性，激活了I_Na，抑制了I_A和I_K，从而提高神经元的兴奋性，改善后肢去负荷小鼠的认知功能。本文结果表明rTMS通过改变电压门控钠离子和钾离子通道的动力学特性，改善了后肢去负荷小鼠的认知功能损伤与海马DG区的神经元相关电特性，为改善太空失重导致的认知损伤提供了一定的理论基础。

重要声明

利益冲突声明：本文全体作者均声明不存在利益冲突。

作者贡献声明：丁冲负责实验的整体安排和最终论文的修改，侯文涛是实验的主要完成者和论文的主要撰稿人。朱海军、付蕊、朱明强在实验过程中提供了帮助。所有作者都阅读并通过了最终草案。

伦理声明：本研究通过了河北工业大学动物伦理委员会的审批（批文编号：HEBUTacuc2022028）。

Funding Statement

国家自然科学基金面上项目（52077057）