唑来膦酸对破骨细胞黏附及整合素α_v、β₃基因表达的影响

Abstract

目的

研究唑来膦酸（ZOL）对破骨细胞黏附以及整合素α_v和β₃基因表达的影响。

方法

体外诱导小鼠RAW264.7细胞向破骨细胞分化，通过抗酒石酸酸性磷酸酶（TRAP）染色及牙本质吸收陷窝检测以评价破骨细胞生成情况。将细胞分为对照组及ZOL处理组两组，后者用1×10⁻⁶ mol·L⁻¹的ZOL处理2 d，用结晶紫染色法检测细胞黏附情况，用实时荧光定量聚合酶链反应、Western blot和免疫荧光化学法检测整合素α_v、β₃ mRNA及蛋白表达水平。

结果

TRAP染色及牙本质吸收陷窝检测提示有多核破骨细胞生成。ZOL处理组破骨细胞黏附能力较对照组显著降低（P<0.01）。ZOL处理组整合素α_v、β₃ mRNA水平分别为0.66±0.05、0.59±0.08，显著低于对照组的1.01±0.01和1.01±0.02（P<0.01）；蛋白表达水平分别为31 934.84±112.91、18 812.79±194.13， 较对照组（52 517.81±211.72、31 441.93±456.87）分别下降了39.19%和40.17%（P<0.01）。免疫荧光化学检测显示，ZOL处理使整合素α_v、β₃荧光强度（9.491±0.748、4.744±0.759）较对照组（15.159±1.143、11.418±1.095）分别降低了37.39% 和58.45%（P<0.01）。

结论

ZOL可抑制破骨细胞黏附并下调整合素α_v、β₃表达；ZOL的上述作用可能参与对破骨细胞性骨吸收的抑制。

破骨细胞介导的骨吸收参与了骨质疏松、Paget's病、多发性骨髓瘤等多种骨代谢疾病的病理过程[1]。整合素α_v和β₃在破骨细胞表面高表达，可以介导破骨细胞与骨基质的黏附，并在破骨细胞封闭区形成和维持骨吸收微环境中起重要作用[2]。唑来膦酸（zoledronate，ZOL）是目前治疗骨过度吸收性疾病的代表药物[3]，主要通过抑制破骨细胞性骨吸收，降低骨改建来发挥作用，但其确切的分子机制尚不十分明确。本研究通过在破骨细胞分化过程中应用ZOL，检测ZOL对细胞黏附能力及整合素α_v和β₃基因表达的影响，以探讨ZOL抑制破骨细胞性骨吸收的分子机制。

1. 材料和方法

1.1. 实验材料

小鼠单核巨噬细胞株RAW264.7购自北京军事医学科学院；核因子κB受体活化因子配体（receptor activator of nuclear factor kappa B ligand，RANKL）（Biovision公司，美国）；RPMI1640培养基、胎牛血清（Hyclone公司，美国）；抗酒石酸酸性磷酸酶（tartrate-resistant acid phosphatase，TRAP）染色试剂盒（Sigma公司，美国）；整合素α_v、β₃兔抗鼠多克隆抗体（Biolegend公司，美国）。

1.2. 破骨细胞诱导及实验分组

RAW264.7细胞株用50 ng·mL⁻¹ RANKL诱导，使之向破骨细胞分化；诱导5 d后进行TRAP染色及牙本质磨片吸收陷窝检测[4]，评价破骨细胞生成及骨吸收功能情况。

实验分组：细胞分为对照组和ZOL处理组，均用50 ng·mL⁻¹ RANKL诱导5 d；其中ZOL组在RANKL诱导3 d后用1×10⁻⁶ mol·L⁻¹的ZOL处理2 d。5 d后收获细胞，进行相关检测。

1.3. 破骨细胞黏附功能检测

将两组细胞按每孔5×10³个细胞的密度接种于明胶包被的96孔板中，每组3孔，37 °C孵育2 h；然后用4%多聚甲醛固定10 min，PBS洗3次；再用2%结晶紫染液染色15 min，PBS洗3次后过夜；上酶标仪，595 nm波长处测每孔的光密度（optical density，OD）值。OD值越高，提示结晶紫染色越强，细胞黏附数目越多。

1.4. 整合素α_v、β₃基因和蛋白表达检测

免疫荧光化学检测：培养5 d收获细胞，兔抗鼠整合素α_v、β₃多克隆抗体4 °C孵育过夜，以异硫氰酸荧光素（fluorescein isothiocyanate，FITC）标记的羊抗兔IgG为二抗，37 °C杂交2 h；碘化丙啶（propidium iodide，PI）复染，封片；激光扫描共聚焦显微镜（laser scanning confocal microscope，LSCM）观察。实时荧光定量聚合酶链反应（realtime fluorescence quantitative polymerase chain reaction，real-time PCR）检测mRNA表达：Trizol提取总RNA，逆转录合成cDNA；在Rotor-Gene 3000型荧光定量聚合酶链反应仪上进行实时检测，所用引物见表1。反应条件：95 °C，15 s；60 °C，40 s；72 °C，15 s；共40个循环。实验结果用Rotor-Gene软件进行分析。

表 1. real-time PCR所用目的基因及引物.

Tab 1 Primers of genes used in real-time PCR

基因	GenBank号	引物序列	产物长度/bp
整合素αv	NM-008402.2	上游：5′-AGGCTGGAACTCAACTGCCT-3′	364
		下游：5′-TTGGCCCGTCAATGTCGTAA-3′
整合素β3	NM-016780.2	上游：5′-GCCTTCGTGGACAAGCCTGT-3′	390
		下游：5′-GGACAATGCCTGCCAGTCTT-3′
GAPDH	NM-008084.2	上游：5′-AATGTGTCCGTCGTGGATCT-3′	263
		下游：5′-TCCACCACCCTGTTGCTGTA-3′

Western blot检测蛋白质表达：提取细胞总蛋白，煮沸变性5 min，凝胶电泳并转膜，5%牛血清白蛋白室温封闭2 h，兔抗鼠整合素α_v、β₃多克隆一抗孵育过夜；二抗孵育2 h，四唑硝基蓝（5-bromo-4-chloro-3-indolyl phosphate/tetranitroblue tetrazolium chloride，BCIP/NBT）显色1 min；以甘油醛-3-磷酸脱氢酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）作为对照；用Image J分析软件检测膜上每个条带的相对灰度值。上述检测每组均检测3个样本。

1.5. 统计学分析

原始数据用Excel 2003建库，应用SPSS 13.0统计学软件对数据进行两独立样本t检验，检验水准为双侧α=0.05。

2. 结果

2.1. 破骨细胞生成及骨吸收功能检测

RAW264.7细胞经RANKL诱导5 d后，可见许多体积较大的细胞，呈圆形、梭形、椭圆形或不规则状；TRAP染色呈阳性，细胞内含有多个细胞核，一般为5~7个（图1A）。经扫描电子显微镜（scanning electron microscope，SEM）观察，这些细胞在牙本质磨片上可形成吸收陷窝（图1B），直径20~40 µm。上述结果表明，RAW264.7细胞被成功诱导成为具有骨吸收功能的破骨细胞。

图 1. 破骨细胞TRAP染色及牙本质磨片吸收陷窝.

Fig 1 Detection of osteoclasts by TRAP staining and dentin resorptive lacunae examination

A：TRAP × 200；B：SEM × 500。

2.2. ZOL对破骨细胞黏附功能的影响

对照组和ZOL处理组的OD值分别为0.231±0.018和0.152±0.010，ZOL组显著低于对照组（P<0.01）；提示ZOL可以抑制破骨细胞的黏附功能。

2.3. 免疫荧光化学检测破骨细胞整合素α_v、β₃蛋白表达

整合素α_v、β₃的免疫荧光化学染色结果见图2、3。经LSCM观察，整合素α_v、β₃在两组破骨细胞（多核）及其前体细胞质内均呈阳性表达（绿色荧光），其中整合素β₃还部分表达于细胞核（图2、3）；两组比较，整合素α_v、β₃在对照组细胞中表达较强，而在ZOL组中表达较弱。应用Photoshop CS4对荧光灰度值进行测量，对照组α_v、β₃荧光强度分别为15.159±1.143和11.418±1.095，均显著高于ZOL组的9.491±0.748和4.744±0.759（P<0.01）；ZOL处理使α_v、β₃荧光强度分别降低了37.39%和58.45%。该结果提示，ZOL可显著抑制整合素α_v、β₃蛋白表达水平。

图 2. 免疫荧光化学法检测破骨细胞中整合素α_V的表达 LSCM × 400.

Fig 2 Detection of integrin α_v expression within osteoclasts by immunofluorescent chemistry LSCM × 400

上：对照组；下：ZOL处理组；A1、B1：FITC标记整合素α_v蛋白（绿色）；A2、B2：PI标记细胞核（红色）；A3、B3：融合图像；A4、B4：无荧光视野。

图 3. 免疫荧光化学法检测破骨细胞中整合素β₃的表达 LSCM × 400.

Fig 3 Detection of integrin β₃ expression within osteoclasts by immunofluorescent chemistry LSCM × 400

上：对照组；下：ZOL处理组；A1、B1：FITC标记整合素β₃蛋白（绿色）；A2、B2：PI标记细胞核（红色）；A3、B3：融合图像；A4、B4：无荧光视野。

2.4. real-time PCR检测整合素α_v、β₃ mRNA表达

ZOL处理组整合素α_v、β₃ mRNA的表达水平分别为0.66±0.05、0.59±0.08，明显低于对照组的1.01±0.01和1.01±0.02（P<0.01）；提示ZOL可显著抑制破骨细胞中整合素α_v、β₃ mRNA的表达水平。

2.5. Western-blot检测整合素α_v、β₃蛋白表达

对照组和ZOL处理组整合素α_v、β₃蛋白表达见图4。ZOL组整合素α_v、β₃蛋白灰度值分别为31 934.84±112.91和18 812.79±194.13，均低于对照组的52 517.81±211.72和31 441.93±456.87，差异有统计学意义（P<0.01）。与对照组比较，ZOL组整合素α_v、β₃分别下降了39.19%和40.17%。该结果提示ZOL能够显著抑制整合素α_v、β₃的蛋白表达。

图 4. Western blot检测整合素α_v、β₃蛋白的表达.

Fig 4 Detection of protein level of integrin α_v and β₃ by Western blot

从上到下依次为整合素α_v、β₃和GAPDH。

3. 讨论

整合素是细胞表面重要的黏附受体，是由α、β两个亚基组成的异源二聚体，参与细胞与基质、细胞与细胞间的接触[2]。破骨细胞表面主要表达整合素α_v和β₃，通过与骨桥蛋白、骨涎蛋白、玻连蛋白等骨基质蛋白内的精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸（Arg-Gly-Asp，RGD）序列结合，调控破骨细胞的黏附、迁移、封闭区形成及骨吸收[5]。

研究[2],[6]表明，许多信号分子参与了整合素α_v、β₃介导的信号调控。整合素α_v、β₃与骨基质蛋白中RGD序列结合，从而使细胞质与其结合的c-Src活化，并与适配蛋白脾酪氨酸激酶（spleen tyrosine kinase，Syk）形成复合体。Syk通过SH2功能域与破骨细胞表面DNAX活化蛋白12（DNAX-activating protein 12，Dap12）的免疫酪氨酸活化基序（immunoreceptor tyrosine-based activation motif，ITAM）功能域结合。活化的c-Src使Syk磷酸化，进而激活下游信号分子SLP-76（含有SH2结构域的相对分子质量为7.6×10⁴的白细胞蛋白）和鸟嘌呤转换因子Vav3，使无活性的Rac转变成活性Rac，从与二磷酸鸟苷（guanosine diphosphate，GDP）结合转变成与三磷酸鸟苷（guanosine triphosphate，GTP）结合；从而诱发破骨细胞的细胞骨架重排形成肌动蛋白环。整合素α_v、β₃分布于肌动蛋白环的内侧和外侧，形成封闭区，为骨吸收提供所需的微环境。

整合素α_v、β₃功能改变会对破骨细胞黏附、细胞骨架重排及封闭区形成产生重要影响。整合素β₃基因敲除小鼠表现出明显的骨量增加，这与破骨细胞介导的骨吸收障碍有关[7]。即使在RANKL和巨噬细胞集落刺激因子（macrophage colony stimulating factors，M-CSF）作用下，整合素β₃^-/-破骨细胞也不能形成肌动蛋白环，骨吸收活性明显下降[8]；整合素β₃点突变会使破骨细胞迁移能力显著降低[9]。双膦酸盐作为破骨细胞的有效抑制药物，能否通过影响整合素α_v、β₃来发挥对破骨细胞的抑制作用，目前尚不清楚。在本研究中，应用RANKL诱导RAW263.7细胞向破骨细胞分化，同时用1×10⁻⁶ mol·L⁻¹ ZOL处理；发现ZOL处理组整合素α_v、β₃ mRNA水平较对照组明显下降，蛋白水平也分别下降了39.19%和40.17%；免疫荧光检测也表明，ZOL组整合素α_v、β₃荧光强度显著降低，分别下降了37.39%和58.45%。上述结果提示，ZOL可显著抑制破骨细胞中整合素α_v、β₃基因表达，从而影响α_v、β₃在破骨细胞黏附、细胞骨架重排及骨吸收中的作用。结晶紫染色实验进一步表明，ZOL处理组OD值显著低于对照组，证实了ZOL对破骨细胞黏附的抑制作用。国外学者[10]应用人成骨细胞作为研究对象，发现ZOL同样可抑制细胞黏附及整合素α_v、β₃基因的表达。研究[11]发现，接受双膦酸盐长期治疗的患者体内存在巨大的破骨细胞，不能贴附于骨组织表面，这也可能与双膦酸盐对破骨细胞表面整合素α_v、β₃的抑制有关。

研究整合素在破骨细胞功能中的作用有极其重要的价值。破骨细胞在骨质疏松、多发性骨髓瘤、骨转移瘤等多种病理性骨吸收中发挥着重要作用[1]；而其进行骨吸收的前提是通过整合素α_v、β₃与骨基质表面发生黏附，使细胞骨架重排，形成封闭区和皱褶缘，为骨吸收提供局部微环境[2],[5]–[6]。临床前研究表明，整合素α_v、β₃靶向药物，如多肽（S247、ATN-161、cilengitide）及非肽类小分子（PSK1404），均可有效抑制骨吸收及肿瘤骨转移[12]–[13]；从而为以整合素α_v、β₃为靶向进行药物干预，抑制上述病理状态下的骨吸收开辟了新途径。

本研究表明，在体外ZOL可有效地抑制破骨细胞整合素α_v、β₃的基因表达，降低细胞的黏附能力；ZOL的上述作用可能与其对破骨细胞性骨吸收的抑制有关。

Funding Statement

[基金项目] 国家自然科学基金资助项目（81270965，81101448）；河北省自然科学基金资助项目（C2011401044）