MicroRNA-191在T淋巴母细胞性白血病/淋巴瘤中的表达及其作用机制研究

Abstract

目的

探讨MicroRNA-191（miR-191）与T淋巴母细胞性白血病/淋巴瘤（T-ALL/LBL）的相关性及其作用机制。

方法

采用荧光实时定量PCR（qRT-PCR）法检测20例T-ALL/LBL患者肿瘤组织和20例淋巴结反应性增生（LRH）患者淋巴结组织中miR-191的表达，并分析其与临床预后的关系。构建反义miR-191慢病毒载体（LV-miR-191-KD）和阴性对照载体（LV-NC-GFP）并转染T-ALL细胞系Jurkat细胞，qRT-PCR法检测miR-191的表达水平。分别用CCK-8法和流式细胞术检测下调miR-191后的细胞活性、细胞周期和凋亡。

结果

T-ALL/LBL患者组miR-191表达水平明显高于LRH患者组（1.875±0.079对1.000，P=0.001），以miR-191表达量的中位数为界，将T-ALL/LBL患者分为高表达组（10例）与低表达组（10例），高表达组患者3年OS率明显低于低表达组（26%对82%，P=0.021）。转染48 h后，LV-miR-191-KD组Jurkat细胞miR-191表达水平（0.578±0.012）较LV-NC-GFP组（1.011±0.053）和未转染对照组（1.000）显著降低（P值分别为0.018和0.021），细胞凋亡比例显著升高（P值均<0.05），细胞周期阻滞于G₀/G₁期，并抑制从G₁期向S期转化。

结论

miR-191在T-ALL/LBL的发生、发展过程中起促进作用，可能作为T-ALL/LBL治疗的潜在靶点。

T淋巴母细胞性白血病/淋巴瘤（T lymphoblastic leukemia/lymphoma，T-ALL/LBL）是来源于不成熟T淋巴细胞的高度侵袭性恶性肿瘤，约占所有ALL/LBL的80%，当前的常规化疗虽可以治愈80%的儿童患者，但成人患者的5年总生存（OS）率只有40%左右[1]。为了提高T-ALL/LBL患者的疗效，尤其是对难治复发性患者，寻找新的治疗方法及特异性强的靶向治疗成为必需。最近有研究者发现，microRNA-191（miR-191）在终端红细胞分化以及肝癌、卵巢癌、糖尿病等多种疾病的发生、发展中起重要调节作用[2]–[5]，在结肠癌、急性髓系白血病、恶性黑色素瘤、乳腺癌和卵巢癌等恶性肿瘤中高表达[6]–[7]。以往的研究表明miR-191的异常表达可能与恶性肿瘤的发生、发展和预后相关，但目前miR-191在淋巴造血系统肿瘤中的表达及作用机制研究鲜有报道。在本研究中我们通过检测miR-191在T-ALL/LBL中的表达，并通过构建反义miR-191慢病毒载体（LV-miR-191-KD）转染T-ALL细胞系Jurkat细胞，旨在探讨miR-191在T-ALL/LBL发生、发展中的作用及可能机制。

病例与方法

1．病例：以2003年1月至2012年1月期间北京大学第三医院和北京大学基础医学院诊疗及会诊的20例T-ALL/LBL患者为研究对象，以同期20例淋巴结反应性增生（LRH）患者为对照，参照世界卫生组织肿瘤分类及诊断标准进行诊断，所有标本均经过2位病理学专家诊断确认。20例T-ALL/LBL患者中男14例，女6例，中位年龄17（2~48）岁。20例LRH患者中男12例，女8例，中位年龄29（17~62）岁。T-ALL/LBL患者治疗方案为VDLD（长春新碱、柔红霉素、左旋门冬酰胺酶、地塞米松）方案，LRH患者主要以观察随访为主。

2．荧光实时定量PCR（qRT-PCR）法检测miR-191的表达：采用TRIzol法提取所有组织标本总RNA，常规检测RNA纯度和浓度。逆转录和PCR按照日本TaKaRa公司提供的说明书操作，以U6作为内参照进行相对定量，每组设3复孔，实验重复3次。在qRT-PCR仪（美国罗氏公司产品）上进行检测。miR-191上游引物序列为5′-ACACTCCAGCTGGGCAACGGAATCCCAAAAGC-3′，下游引物序列为5′-CTCAACTGG TGTCGTGGA-3′，U6上游引物序列为5′-TTATGGGTCCTAGCCTGAC-3′，下游引物序列为5′-CACTATTGCGGGGTCTGC-3′。采用2^−ΔΔCt法计算miR-191的相对表达量。

3．细胞培养和转染：Jurkat细胞由北京大学第一医院皮肤科实验室馈赠，于含10%胎牛血清的RPMI 1640培养基中常规培养。LV-miR-191-KD及其阴性对照LV-NC-GFP的构建、包装和鉴定由上海吉凯基因化学技术有限公司完成。LV-miR-191-KD序列为：5′-TCAAAGTTCGTTCATTTCC GTTAAGATCTAGGGCTAACATTTTTTTCCGTTACATATGTAATTTTTTGGAAGTTTCCGTTATCTAGATATTTTGGGAATCTTTTCCGTTT-3′。取对数生长期细胞进行转染，以每孔3×10⁵个细胞接种于6孔板。按照感染复数（multiplicity of Infection，MOI）=30加入LV-miR-191-KD和LV-NC-GFP感染细胞，24 h后换为正常培养液继续培养。感染48 h后于倒置荧光显微镜下观察转染效果，应用qRT-PCR仪检测miR-191表达水平并用于后续实验。Mir-X™ miRNA逆转录试剂盒与Mir-X™ miRNA qRT-PCR试剂盒均购于日本TaKaRa公司。

4．CCK-8法检测miR-191对Jurkat细胞增殖的影响：实验分组：实验组：LV-miR-191-KD转染的Jurkat细胞；阴性对照组：LV-NC-GFP转染的Jurkat细胞；未转染对照组：未转染的Jurkat细胞。取对数生长期Jurkat细胞，调整细胞密度至2×10⁵/ml。以每孔100 µl接种于96孔板，每组设3个复孔，置于恒温培养箱中（37 °C、5%CO₂）常规培养。分别于培养24、48、72和96 h时每孔加入10 µl的CCK-8溶液，继续孵育2 h后，在450 nm波长处测定吸光度（A）值。实验重复3次。

5．流式细胞术检测miR-191对Jurkat细胞细胞周期和凋亡的影响：实验分组同上。慢病毒转染Jurkat细胞48 h后，每组收集细胞1×10⁶个，用PBS洗涤细胞2次。常规固定处理后每管加100 µl RNaseA，37 °C水浴30 min，再加入400 µl碘化丙锭染色，4 °C避光30 min，上流式细胞仪检测细胞周期。同上细胞常规固定处理后加100 µl缓冲液悬浮细胞，加入5 µl AnnexinⅤ-FITC和5 µl碘化丙锭混匀，室温下避光反应15 min。再加入400 µl缓冲液，上流式细胞仪检测细胞凋亡率。

6．随访：通过电话进行随访，随访截止日期为2014年12月31日。总生存（OS）时间定义为确诊日至患者死亡或末次随访时间。

7．统计学处理：采用SPSS18.0软件进行统计学分析，计量资料数据以x±s表示，组间比较采用t检验或单因素方差分析，计数资料采用χ²检验,采用Kaplan-Meier法绘制生存曲线，并运用Log-rank检验比较OS率差异。以P<0.05为差异有统计学意义。

结果

1．miR-191在T-ALL/LBL和LRH患者中的表达：结果显示，T-ALL/LBL患者组miR-191表达水平显著高于LRH患者组，差异有统计学意义（1.875±0.079对1.000，P=0.001）。

2．miR-191与T-ALL/LBL患者预后的关系：参照文献[6]–[7]以miR-191表达量的中位数为界，将T-ALL/LBL患者分为高表达组（10例）与低表达组（10例）。结果显示，高表达组患者3年OS率明显低于低表达组，差异有统计学意义（26%对82%，P=0.021）（图1）。

图1. MicroRNA（miR）-191表达对T淋巴母细胞性白血病/淋巴瘤患者总生存的影响.

3．LV-miR-191-KD转染Jurkat细胞后miR-191的表达：慢病毒转染Jurkat细胞48 h后，细胞感染率为80%，实验组Jurkat细胞miR-191表达水平（0.578±0.012）低于阴性对照组（1.011±0.053）和未转染对照组（1.000），差异有统计学意义（P值分别为0.018和0.021）；而阴性对照组和未转染对照组比较差异无统计学意义（P=0.779）。

4．miR-191表达抑制对Jurkat细胞周期和凋亡的影响：转染48 h后结果显示，与阴性对照组和未转染对照组比较，实验组Jurkat细胞G₁期细胞比例升高，S期细胞比例降低，凋亡细胞比例显著增加，差异均有统计学意义（P值均<0.05）（表1、图2）。

表1. MicroRNA（miR）-191表达抑制对Jurkat细胞周期和凋亡的影响（%，x±s）.

组别	细胞周期分布			凋亡细胞比例
	G1期	S期	G2/M
LV-miR-191-KD转染组	67.38±8.01	22.46±3.12	10.15±2.23	15.89±5.76
LV-NC-GFP转染组	50.32±9.74	38.17±10.09	11.51±1.12	1.08±0.09
未转染对照组	48.93±10.92	40.81±8.83	10.26±0.98	1.02±0.11
aP值	0.032	0.041	0.580	0.009
bP值	0.026	0.019	0.810	0.007

注：a：为LV-miR-191-KD转染组与LV-NC-GFP转染组比较；b：为LV-miR-191-KD转染组与未转染对照组比较。每组设3个复孔，实验重复3次

图2. 流式细胞术检测MicroRNA（miR）-191表达对Jurkat细胞凋亡的影响.

A：未转染对照组；B：LV-NC-GFP转染组；C：LV-miR-191-KD转染组

5．miR-191表达对Jurkat细胞增殖的影响：结果显示，转染LV-miR-191-KD后，随着转染时间的延长，Jurkat细胞增殖明显降低。转染72和96 h时，与阴性对照组和未转染对照组比较，实验组Jurkat细胞增殖显著下降，差异有统计学意义（P值分别为0.032和0.027）（图3）。

图3. CCK-8法检测MicroRNA（miR）-191表达对Jurkat细胞增殖的影响（每组设3个复孔，实验重复3次）.

讨论

miRNA是一类内源性保守的非编码的小分子RNA，是目前研究较多的非编码RNA[8]。自1993年Lee等[9]在线虫中发现了第一个miR-Lin-4后，随即在许多的真核生物中都发现了这种小分子RNA，这些miRNA可特异性识别靶mRNA的3′-非翻译区（3′UTR）并与之结合，引起靶mRNA的降解或翻译抑制，从而在转录后发挥负调控基因表达的作用[10]。T-ALL/LBL中存在众多miRNA表达的异常，其可能通过对肿瘤相关靶基因的调控发挥作用[11]–[12]。因此，对T-ALL/LBL中表达异常的miRNA进行研究可为T-ALL/LBL的临床诊治提供重要的理论依据。

MiR-191定位于染色体3p21.31，在胰腺癌、大肠癌、肺癌及前列腺癌均高表达[13]–[14],[6]。Ueda等[15]采用基因芯片技术对353份胃癌标本进行分析，发现miR-191呈高表达。所以，miR-191可能与恶性肿瘤的发生、发展有着密切关系。

在本研究中我们发现，T-ALL/LBL患者miR-191表达水平显著高于LRH患者，与miR-191在其他实体肿瘤患者中的报道基本一致，提示miR-191过表达与患者不良预后密切相关，有可能作为T-ALL/LBL预后观察指标。有报道称miR-191在肝癌细胞中高表达，抑制miR-191可以减缓细胞增殖和诱导细胞凋亡，在鼠模型中有减小瘤块体积的作用。我们的研究结果也显示，抑制miR-191表达后，Jurkat细胞增殖受到抑制，细胞周期阻滞于G₀/G₁期，细胞凋亡增加。提示miR-191在T-ALL/LBL发生、发展中起重要作用。

但miR-191通过何种机制促进T-ALL/LBL的发生，需要进一步实验证实。SOX4是与胚胎细胞发育和调节细胞分化增殖有关的转录因子，其在多种肿瘤中高表达。研究表明，miR-191参与了MAPK/ERK、TGF-β及MAPK/JNK等通路，SOX4、IL-1A、TMC-7可能是miR-191的靶基因[3]，对于miR-191在T-ALL/LBL发生、发展过程中的作用，需要进一步验证，并阐明其作用机制。

综上，miR-191在T-ALL/LBL患者中高表达且与其OS呈负相关。下调miR-191表达，可抑制T-ALL肿瘤细胞增殖、阻滞细胞周期，促进细胞凋亡。以上研究结果为T-ALL/LBL的防治及预后提供了一个新的潜在靶点，值得进一步深入研究。