β-catenin 和 IQGAP1 的调控环路及其在肠癌细胞增殖中的作用

Abstract

本文主要研究 β 连环蛋白（β-catenin）和含 IQ 基序的 GTP 激酶活化蛋白 1（IQGAP1）的相互调控，及其在肠癌细胞增殖中的功能。利用细胞转染技术改变肠癌细胞 SW1116 中的 β-catenin 或者 IQGAP1 表达后，通过蛋白质印迹法分别检测 SW1116 细胞中 IQGAP1 和 β-catenin 的表达情况。利用 CCK-8 细胞增殖实验检测干扰下调 IQGAP1 对 β-catenin 促进 SW1116 细胞增殖的影响。结果发现在 SW1116 细胞中干扰 β-catenin 可以下调 IQGAP1 表达，过表达 β-catenin 可以上调 IQGAP1 并加强有丝分裂原激活蛋白激酶（MAPK）通路；干扰 IQGAP1 在 SW1116 细胞中反而引起 β-catenin 上升；同时 CCK-8 细胞增殖实验发现干扰 IQGAP1 减弱了 β-catenin 的促肠癌细胞增殖作用。本研究表明 β-catenin 与 IQGAP1 形成负向反馈调控环路，在调控肠癌细胞的增殖中发挥着重要功能。

引言

肠癌是消化道常见的恶性肿瘤之一，其发病率和死亡率在我国呈逐年上升趋势^[1]。研究发现，肠癌中 Wnt/β-catenin 通路和有丝分裂原激活蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）信号通路通常都异常活化，其下游调控的靶基因可促进细胞异常的增殖和分化，在肠癌发生发展中发挥着重要作用^[2-3]。含 IQ 基序的 GTP 激酶活化蛋白 1（IQ motif containing GTPase-activating protein 1，IQGAP1）是一种支架蛋白，拥有多个蛋白结合域，可以作为蛋白信号传递的平台，协调细胞黏附和迁移信号、MAPK 通路和 G 蛋白偶联受体（G protein-coupled receptors，GPCR）等多种信号通路^[4-5]。既往研究发现，IQGAP1 在 MAPK 通路中发挥着重要功能，可以通过多种机制强化信号强度并延长通路激活时间，发挥着桥梁作用。IQGAP1 作为细胞骨架蛋白，可以分别与 Raf 蛋白激酶、丝裂原活化蛋白激酶激酶（mitogen-activated protein kinase kinase，MEK）和细胞外调节蛋白激酶（extracellular regulated protein kinase，ERK）等 MAPK 通路中关键蛋白相互作用，促进 Raf 对 MEK 的磷酸化及 MEK 对 ERK 的磷酸化，从而上调 MAPK 通路活性^[6]。此外，IQGAP1 还可以调节 MAPK 通路上游的表皮生长因子受体（epidermal growth factor receptor，EGFR）的激活，既往研究发现，在敲除 IQGAP1 的细胞中 EGFR 的功能受到明显抑制^[7]。动物实验也发现 IQGAP1 在 MAPK 信号通路驱动的肠癌中发挥着关键功能，在 KRAS 突变诱导的小鼠肠癌模型中敲除 IQGAP1 后，肿瘤的增殖速度明显减慢^[8]。目前，关于 IQGAP1 和 β-catenin 相互间调控和功能影响的报道还很少，β-catenin 是否对 IQGAP1 具有调控作用目前未见报道，并且 IQGAP1 在肠癌细胞中对 β-catenin 的调控作用也不十分清楚。本文将研究 β-catenin 和 IQGAP1 在肠癌细胞中如何相互调控，及其在肠癌细胞增殖中的作用。

1. 材料与方法

1.1. 细胞培养与传代

人肠癌细胞 SW1116 用含 10% 胎牛血清（Gibco，美国）的 DMEM 培养基（Gibco，美国）在 37℃ 的孵箱中培养。生长融合至 70%～80% 时进行传代，弃去旧培养液，加适量磷酸盐缓冲液（phosphate buffer saline，PBS）清洗 2～3 次；加入 0.75 mL 0.25% 的胰酶，37℃ 消化适当时间，待细胞消化完全后加入培养液 3 mL 终止消化反应，重悬细胞；室温，800 r/min，离心 5 min，弃上清；细胞用适量新鲜培养基重悬，根据其数量、生长速度及用量多少，按一定比例进行传代。

1.2. 细胞转染干扰 RNA 或者质粒

转染前一天将 SW1116 细胞种植于六孔板中，待细胞生长到一定密度（50%～60%）时，用 Lipofectamine TM2000（Thermo Fisher，美国）将干扰 RNA 或者过表达质粒转染到细胞中。将干扰 RNA 或者过表达质粒和 5 μL Lipofectamine TM2000，分别用 opti-MEM（Gibco，美国）补齐到 250 μL，室温孵育 5 min 后，再将二者混匀，注意动作轻柔，室温继续孵育 20 min。弃旧培养液，用 opti-MEM 清洗一次，将孵育好的混合液加到 6 孔板中，置于 37℃ 孵箱中，4～6 h 后换 10% FBS 的 DMEM 继续培养。所用干扰 RNA 序列：

β-catenin：5′-AGCTGATATTGATGGACAGTT-3′

IQGAP1：5′-UUAUCGCCCAGAAACAUCUUGUUGG-3′

阴性对照干扰 RNA（negative control，NC）：5′-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3′

阴性对照干扰 RNA 为无意义的 RNA 序列，不靶定任何基因 mRNA，作为 IQGAP1 和 β-catenin 干扰 RNA 转染的阴性对照。过表达 β-catenin 质粒（pcDNA3.1-β-catenin）和空载质粒（pcDNA3.1）为实验室以前构建。空载质粒 pcDNA3.1 是 β-catenin 质粒的基本骨架，作为 β-catenin 质粒转染的阴性对照。

1.3. 蛋白质免疫印迹法检测处理后 IQGAP1、β-catenin 和 pERK1/2 的表达

细胞按实验要求对应处理一定时间后，弃去旧培养基，加 PBS 洗涤。每孔（6 孔板）加入 80 μL 通用蛋白裂解抽提试剂（碧云天，中国），收集细胞于 1.5 mL EP 管置于冰上，充分裂解细胞后，4℃、12 000 r/min 离心 15 min，吸取上清即为细胞总蛋白。用蛋白定量试剂盒（碧云天，中国）按照说明进行蛋白浓度测定后，配制 12% 的分离胶、5% 的浓缩胶进行 SDS-PAGE 凝胶电泳，待目的蛋白已经被适当分离后即可停止电泳进行转膜；用聚偏二氟乙烯膜（Millipore，美国）进行转膜；5% 的脱脂奶粉封闭 2 h；加入一抗 4℃ 过夜，用含 Tween-20 的 Tris-HCl 缓冲盐溶液（TBST）洗膜 3 次，每次 10 min；按 1∶10 000 的比例加入羊抗兔或羊抗鼠二抗，室温动孵育 2 h，避光；加入适量 TBST 洗膜 3 次，每次 10 min。最后将聚偏二氟乙烯膜（polyvinylidene fluoride，PVDF）直接置于奥德赛红外荧光扫描仪中进行扫描成像。实验中所用一抗为 β-catenin（sc-65480，Santa Cruz，美国）、IQGAP1（ab133490，Abcam，英国）、pERK1/2（ab76299，Abcam，英国）、ERK1（ab32537，Abcam，英国）、C-Myc（ab32072，Abcam，英国）、GAPDH（BM1623，博士德，中国）。所用二抗为羊抗兔和羊抗鼠荧光二抗（Licor，美国）。

1.4. CCK-8 细胞增殖实验检测细胞处理后的增殖速度

实验按 CCK-8 试剂盒说明进行，具体步骤如下：细胞种板、转染见前一步骤；各实验组均设有 3 个复孔，3 个对照；每孔加入 90 μL 新鲜培养液并加入 10 μL CCK-8，轻微振荡，混匀，在 37℃ 孵箱内培养 2 h，根据说明于酶标仪上测得光密度值（OD 值）。CCK-8 实验中共分四组，对照组（Control 组，转染了阴性对照干扰 RNA 和空载质粒），β-catenin 组（转染 β-catenin 质粒和阴性对照干扰 RNA），si-IQGAP1 组（转染 IQGAP1 干扰 RNA 和空载质粒）和共转染组（转染 IQGAP1 干扰 RNA 和 β-catenin 质粒）。OD 值越大细胞增殖速度越快，统计分析时，将 β-catenin 组的 OD 值标定为 100%，根据其他各组与 β-catenin 组的 OD 值比值，算出各组的相对 OD 值，纵坐标标为相对增殖速度。以上实验重复 3 次。

1.5. 统计分析

用图像分析软件 Image-Pro 5.1 对蛋白条带进行灰度分析。所有结果以均数±标准差表示。用 SPSS 19.0 统计软件进行统计学分析，两组间比较采用 t 检验分析，P < 0.05 为差异具有统计学意义。

2. 结果

2.1. β-catenin 正调控肠癌细胞 IQGAP1 的表达

使用 β-catenin 质粒（pcDNA3.1-β-catenin）转染肠癌 SW1116 细胞 72 h 后提取蛋白，利用蛋白质印迹法检测细胞 β-catenin 和 IQGAP1 的表达，结果如图 1 所示。相对于对照组（pcDNA3.1 组），转染组（β-catenin 组）的 β-catenin 蛋白表达量明显上升（P < 0.05），同时 IQGAP1 的蛋白表达量也出现上升（ P < 0.05）。利用 β-catenin 干扰 RNA 转染 SW1116 细胞系 72 h 后，结果如 图 1 所示，相对于对照组（NC 组），干扰组（si-β-catenin 组）的 β-catenin 和 IQGAP1 蛋白表达均出现明显下降（P < 0.05）。这些结果说明在肠癌细胞 SW1116 中，β-catenin 可以正调控 IQGAP1 的蛋白表达。

图 1.

β-catenin positively regulates the expression of IQGAP1 in SW1116 cells

β-catenin 正调控 SW1116 肠癌细胞系 IQGAP1 的表达

*: P < 0.05

*：P < 0.05

2.2. β-catenin 通过上调 IQGAP1 表达加强 MAPK 信号通路

IQGAP1 可以调节 ERK1/2 的磷酸化，如图 2 所示，利用 IQGAP1 干扰 RNA 转染 SW1116 细胞系 72 h 后，相对于对照组（NC 组），干扰组（si-IQGAP1 组）中 ERK1/2 的磷酸化水平出现明显下降（P < 0.05）。那么 β-catenin 能否通过 IQGAP1 调节 MAPK 信号通路呢？将细胞分为四组：对照组（Control 组，转染阴性对照 NC 干扰 RNA 和空载质粒 pcDNA3.1），β-catenin 组（转染 β-catenin 质粒和阴性对照 NC 干扰 RNA），si-IQGAP1 组（转染 IQGAP1 干扰 RNA 和空载质粒 pcDNA3.1）和共转染组（转染 IQGAP1 干扰 RNA 和 β-catenin 质粒）。如 图 2 所示，β-catenin 组相对于对照组（Control 组），磷酸化 ERK1/2 明显上升（P < 0.05）。但共转染组（β-catenin 质粒+si-IQGAP1）相对于 si-IQGAP1 组（si-IQGAP1+pcDNA3.1），磷酸化 ERK1/2 的变化并不明显，差异无统计学意义。表明在干扰 IQGAP1 表达的情况下，过表达 β-catenin 并不能上调 pERK1/2。这些结果说明 β-catenin 是通过上调 IQGAP1 的表达促进 ERK1/2 的磷酸化，从而加强 MAPK 通路。

图 2.

β-catenin acts through up-regulateing IQGAP1 to enhance MAPK signaling

β-catenin 通过上调 IQGAP1 表达加强 MAPK 信号通路

*: P < 0.05; #： P > 0.05

*：P < 0.05；#： P > 0.05

2.3. 干扰 IQGAP1 减弱 β-catenin 的促肠癌细胞增殖作用

通过 CCK-8 细胞增殖实验检测发现，如图 3 示，干扰 IQGAP1（si-IQGAP1 组）后，相对于对照组（Control 组），SW1116 细胞增殖速度显著下降（P < 0.05），证明 IQGAP1 可以调节 SW1116 细胞的增殖。β-catenin 的异常活化可以促进肠癌细胞的增殖，那么 IQGAP1 在 β-catenin 促进肠癌细胞增殖中发挥着什么功能呢？如 图 3 所示，过表达 β-catenin（β-catenin 组）后，相对于对照组（Control 组），SW1116 细胞增殖速度明显增加（P < 0.05）。但过表达 β-catenin 的同时干扰 IQGAP1（共转染组）后，相对于 β-catenin 组，SW1116 细胞的增殖速度明显下降（ P < 0.05），证明干扰 IQGAP1 减弱了 β-catenin 促肠癌细胞增殖的作用。但共转组相对于对照组，SW1116 细胞的增殖速度仍然有轻度地上升（ P < 0.05），说明 β-catenin 还存在其他机制促进肠癌细胞增殖。

图 3.

IQGAP1 silencing inhibits β-catenin-mediated proliferation in SW1116 cells

干扰 IQGAP1 减弱 β-catenin 的促肠癌细胞增殖作用

*: P < 0.05

*：P < 0.05

2.4. 干扰 IQGAP1 促进 SW1116 肠癌细胞 β-catenin 表达上调

利用 IQGAP1 干扰 RNA 转染 SW1116 细胞 72 h 后提取蛋白，利用蛋白质印迹法检测细胞 β-catenin 和其下游 C-Myc 的表达。结果如图 4 所示，相对于对照组（NC 组），IQGAP1 干扰组（si-IQGAP1）的 β-catenin 和其下游 C-Myc 的蛋白表达均出现上升（P < 0.05），说明 IQGAP1 的下调可以促进 SW1116 肠癌细胞 β-catenin 表达上调。

图 4.

IQGAP1 silencing up-regulates the expression of β-catenin in SW1116 cells

干扰 IQGAP1 促进 SW1116 肠癌细胞 β-catenin 表达上调

*: P < 0.05

*：P < 0.05

3. 讨论

经典 Wnt 信号通路的关键分子是 β-catenin，通过调节下游靶基因的表达控制着细胞多种生物学进程^[9-10]。当 Wnt 信号存在时，Wnt 蛋白与细胞膜上的卷曲蛋白（frizzled）受体和低密度脂蛋白受体相关蛋白 5 或 6（LDL receptor related protein 5/6，LRP5/6）发生结合形成受体复合体，激活的 LRP5/6 的羧基端与 Axin 结合，破坏了 β-catenin 降解复合体 APC/Axin/GSK3β 的形成，使 GSK-3β 无法磷酸化 β-catenin，进而激活 β-catenin 信号通路^[11-12]。约有 90% 的肠癌在腺瘤早期就存在 APC 的突变，导致 β-catenin 的异常激活，促进肠癌发生^[13]。

IQGAP1 是一种支架蛋白，通过调节 MAPK 信号通路可以影响细胞增殖和分化^[6]，也能与细胞骨架和黏附分子相互作用，在细胞黏附和迁移的信号网络中发挥关键作用^[14]。IQGAP1 位于染色体 15q26 上，是基因扩增热点，其所在位点基因变异和表达增加已在多种肿瘤组织和不同肿瘤细胞株中被观察到^[15-16]。异常激活的 MAPK 信号通路是肠癌分子分型中的一大类，约有 40% 的肠癌存在 KRAS 突变，5%～8% 的肠癌存在 NRAS 突变，10% 左右的肠癌存在 BRAF 突变^[13]。而 MAPK 信号通路的顺利传递明显依赖 IQGAP1^{[6, 17-19]}，在 KRAS-MAPK 通路驱动的肿瘤中敲除 IQGAP1 可以显著抑制肿瘤的进展^[8]，说明 IQGAP1 的表达增加对 MAPK 通路的重要性。

肠癌的发生发展通常伴随着一系列的信号通路的异常活化，通路间的调控网络共同促进了肠癌的进展^[20]。Wnt/β-catenin 和 MAPK 通路的相互交联已有报道^[21]。研究发现 β-catenin 在肝癌和前列腺癌中可以直接上调 EGFR 的表达，进而促进 RAS/ERK 通路活化^[22-23]。而 ERK1/2 也可以使 GSK3β 失活，导致 β-catenin 的活化^[24]。

本文首次发现 β-catenin 可以在肠癌细胞中调节 IQGAP1 的蛋白表达。其次，本文证明了 β-catenin 可以通过上调 IQGAP1 的表达加强 MAPK 通路，进而促进肠癌细胞的增殖。IQGAP1 还在细胞的黏附和迁移以及 G 蛋白偶联受体信号通路中发挥着重要功能，β-catenin 能否通过 IQGAP1 发挥更多的功能值得进一步的研究。最后本文发现干扰 IQGAP1 后在肠癌中反而可以上调 β-catenin 的表达。既往研究发现在肝癌中 IQGAP1 可以促进 β-catenin 的表达^[25]，说明 IQGAP1 的功能具有组织特异性，至于干扰 IQGAP1 如何上调 β-catenin 的机制还不清楚，需要更多的研究。

β-catenin 的异常活化通常是启动肠癌发生的第一环节^[26]，对 β-catenin 是如何促进肿瘤发生发展的研究不断在深入。本文首次发现 β-catenin 可以调控 IQGAP1，扩展了 β-catenin 的功能，更新了 Wnt/β-catenin 和 MAPK 通路的交联网络，加深了对 β-catenin 这一关键癌基因在肠癌细胞中如何发挥促增殖功能的理解。更有趣的是，在肠癌细胞 SW1116 中干扰 IQGAP1 后 β-catenin 反而出现上升，提示了肠癌细胞维持 β-catenin 水平稳定的可能机制，即 β-catenin 的下调会引起 IQGAP1 降低，而 IQGAP1 的降低又会反馈地上调 β-catenin，阻止 β-catenin 的持续降低。这种 β-catenin 和 IQGAP1 的负向反馈环路也提示了一种新的 β-catenin 靶向治疗的耐药机制，即在靶向抑制 β-catenin 功能后引起的 IQGAP1 下调，极有可能又会相对地重新上调 β-catenin 表达。综上所述，本文发现 IQGAP1 与 β-catenin 构成负向反馈环路，对解析肿瘤细胞如何维持相对高强度的 Wnt/β-catenin 和 MAPK 信号的机制提供了新的思路。

Funding Statement

国家自然科学基金（81572731）