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. 2021 Mar 31;57(2):314–320. doi: 10.1055/s-0041-1724076

BMP-4, TGF-β and Smad3 as Modulators of Synovial Fluid Cells Viability *

Eduardo Branco de Sousa 1,✉, Vivaldo Moura Neto 2, Diego Pinheiro Aguiar 3
PMCID: PMC9142237  PMID: 35652012

Abstract

Objective  Our goal was to evaluate the modulation of the synovial fluid cells (SFC) from patients with and without osteoarthritis (OA) by bone morphogenetic protein 4 (BMP-4), Smad-3 and transforming growth factor beta (TGF-β).

Methods  Synovial fluid was collected from patients submitted to knee arthroscopy or replacement and were centrifuged to isolate cells from the fluid. Cells were cultured for 21 days and characterized as mesenchymal stem cells (MSCs) according to the criteria of the International Society of Cell Therapy. Then, we performed an [3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide] assay (MTT) assay after exposing cells with and without OA to TGF-β, Smad3 and BMP-4 pathway inhibitors and to different concentrations of BMP4.

Results  Exposure to the TGF-β, Smad3 and BMP-4 inhibitors modifies the mitochondrial activity of the SFCs. The activity of the SFCs is modified by influences of increasing concentrations of BMP4, but there is no difference in cellular activity between patients with and without OA.

Conclusion  TGF-β, Smad3 and BMP-4 modulate the activity of SFCs from patients with and without knee OA.

Keywords: mesenchymal stem cells, osteoarthritis, synovial fluid cells, TGF-β pathway

Introduction

Cellular therapy has been studied due to its potential application for the treatment of articular cartilage lesions and osteoarthritis (OA). 1 2 3 4 In this context, mesenchymal stem cells (MSCs) have been proven useful in tissue regeneration and treatment of many diseases. 3 Synovial fluid also holds a resident MSC population, which is increased in patients with OA. 5 Moreover, it was demonstrated that the number of cells was proportional to the severity of knee OA. 6

Transforming growth factor beta (TGF-β) seems to have central role in OA development, whether as a protective factor initially or taking part in the pathogenesis of the disease. 7 The TGF-β superfamily is a group of secreted polypeptides, including TGF-β1, 2, 3, activins, inhibin, bone morphogenetic proteins (BMPs), and growth and differentiation factors. 8 9 It acts in all steps of chondrogenesis and is the main trigger through mesenchymal precursors. 10 11 12 In the first stages of chondrocytes differentiation, TGF-β seems to have a stimulatory role. However, in the final stages, its action inhibits chondrocyte terminal differentiation. 12 13 Bone morphogenetic proteins are involved in all steps of chondrogenesis and are essential to endochondral ossification. Besides, many BMPs have been detected both in normal and osteoarthritic cartilage. 9

Senescence has impacts in both TGF-β and BPM pathways due to a decrease in receptors expression, and to a reduction in Smad3 activation. This could explain the close relationship between senescence and OA development. 14 Osteoarthritis patients have elevated levels of BMP-2 15 and BMP-7 16 in plasma and synovial fluid compared with healthy individuals. Besides, BMP-7 levels are correlated to OA radiographic progression magnitude. 17 However, the expression of BMP-4, which stimulates the synthesis of extracellular matrix in chondrocytes, is decreased in OA and rheumatoid arthritis (RA) synovial tissues, indicating an imbalance of joint homeostasis in joint disease. 18 The goal of the present study was to evaluate the role of BMP-4, Smad3 and TGF-β on synovial fluid cells (SFCs) viability from patients with and without OA.

Methods

Population and Collection of Synovial Fluid

The population of the present study was composed of patients submitted to knee surgical treatment in our Institute. Eligible patients from both genders were divided in two groups: patients without knee OA (W/O OA), Kellgren-Lawrence = 0, and patients with knee OA (W/OA), Kellgren-Lawrence > 2. Patients with knee infection, autoimmune diseases or submitted to prior surgery on the knee were excluded. Knee OA was graded according to the Kellgren and Lawrence classification using standard standing radiographs. 19 One milliliter of synovial fluid was collected from the knee joint from patients W/O OA at the beginning of the arthroscopy by syringe aspiration, just after the confection of the portals, and two milliliters from the knee joint of patients W/OA by syringe aspiration after arthrotomy. The present study was performed in line with the principles of the Declaration of Helsinki, and approval was granted by the Institutional Ethics Board (CAAE 08663912.3.0000.5273).

Isolation and Culture of Synovial Fluid Cells

Synovial fluid specimens were firstly centrifuged at 16,6 g for 5 minutes at room temperature, and then centrifuged at 1,600 g for 5 minutes at 4°C. The supernatant was stored in 1 mL aliquots at - 80°C for further analysis. The pellet from the first centrifugation was suspended in Iscove's Modified Dulbecco's Medium (IMDM, Sigma, Saint Louis, MO, USA) supplemented with 10% fetal bovine serum (FBS, Gibco, Thermo Fisher, Waltham, MA, USA). Cells were seeded at 5 to 7 × 10 5 cells per T-75 cm 2 culture flasks. After 24 hours, the cells were washed once with serum-free medium and the medium was changed. Cell cultures were maintained at 37°C in a humidified atmosphere containing 5% CO 2 . The medium was changed every 2 days. Cells were harvested and replated for expansion at 80% of confluence until the 3 rd passage. The identity SFCs was evaluated according to the protocol defined by the International Society of Cell Therapy 20 and was described in a previous study. 21

SFC Mitochondrial Activity by MTT

To evaluate the mitochondrial activity of the SFCs exposed to different BMP-4 concentrations, an essay of mitochondrial activity by MTT (3-[4,5-dimethylthiazol-2-yl]-2,5-diphenyltetrazolium bromide) was performed. In a 96-well plate, 5 × 10 3 of SFCs from patients W/O OA ( n  = 3) and W/OA ( n  = 3) were seeded in 200 μL of medium/well and exposed to progressive concentrations of BMP-4 (0.1 nM, 0.5 nM, 2 nM and 10 nM), and were maintained at 37°C in a humidified atmosphere containing 5% CO 2 .

The control of mitochondrial activity of the SFCs from patients W/O OA ( n  = 3) and W/OA ( n =3) was evaluated by the blockade of BMP-4, TGFβ and Smad3 pathways. As such, the SFCs were cultivated in the presence of the specific inhibitors of the targets Smad3 (Smad3 SiS3 566405, Millipore, Burlington, Massachusetts, EUA), BMP-4 (BMP inhibitor II DMH1 203646, Merckmillipore, Burlington, Massachusetts, EUA) and TGFβ (TGF-β1 R1 kinase 616451, Merckmillipore, Burlington, Massachusetts, EUA) at 10 nM.

After cell adherence, the culture medium was substituted by Iscove's medium (Sigma-Aldrich, San Luis, Missouri, EUA) supplemented with 1% fetal bovine serum (Sigma-Aldrich, San Luis, Missouri, EUA) containing the specific inhibitors for each treatment. The SFCs were treated with 100 µL of the respective control and experimental solutions at 37°C in a humidified atmosphere containing 5% CO 2 for 24, 48 and 72 hours. Then, the SFCs were washed twice with 200 µL PBS 1x sterile at 37°C, and 100 µL of the MTT solution (0,5mg/mL) was added to each well. The plate was maintained at 37°C in a humidified atmosphere containing 5% CO 2 for 4 hours.

After this period, the MTT solution was removed and 100 µL Dimethyl sulfoxide (DMSO) was added. The plate was agitated for 20 minutes before spectrophotometric analysis at 570 nM wavelength using the Glomaxmulti detection system (Glomaxmulti, detection System, Promega, Madison, Wisconsin, EUA). Analysis of the mitochondrial activity of the SFCs was measured after 24, 48 and 72 hours of exposure to each specific inhibitor and control. Control of mitochondrial activity was determined by MTT both by a well containing only medium with BMP-4 without cells (control/factor), and by wells containing only medium and cells, but without BMP-4.

Statistical Analysis

The MTT data were exported from the Glomaxmulti detection system (Glomaxmulti, detection System, Promega, Madison, Wisconsin, EUA) to a Microsoft Excel (Microsoft Corporation, Redmond, WA, USA) spreadsheet, analyzed in GraphPad Prism for Windows 6.0 (San Diego, California, EUA) and presented as average ± standard deviation (SD). To compare groups, two-way analysis of variance (ANOVA) was used, followed by one-tail unpaired Student t-test . Data were considered significant when p  < 0.05.

Results

BMP-4 Modulates SFCs Viability

Mitochondrial activity by MTT did not evidence any differences between the samples of patients with and without knee OA when analyzed in each experimental situation, independent of BMP-4 concentration (p > 0.05). When the data were analyzed in relation to the rising concentrations of BMP-4, we verified that the mitochondrial activity of the SFCs from patients with OA increased progressively according to the exposition to higher concentrations of BMP-4 (0.1 nM 264.4 ± 11,94 versus 0.5 nM 562.8 ± 26.17, p  < 0.0001; 0.5 nM 562.8 ± 26.17 versus 2 nM 1157 ± 40.45, p  < 0.0001), decreasing at the exposure to the concentration of 10 nM (2 nM 1157 ± 40.45 versus 10 nM 124,9 ± 14.62, p  < 0.0001), showing toxicity. The same was observed for the mitochondrial activity of the SFCs from patients without OA (0.1 nM 141.7 ± 20.83 versus 0.5 nM 496.3 ± 62.44, p  < 0.0001; 0.5 nM 496.3 ± 62.44 versus 2 nM 1134 ± 69.22, p  < 0.0001; 2 nM 1134 ± 69.22 versus 10 nM 168.2 ± 20.33, p  < 0.0001) ( Figure 1 ).

Fig. 1.

Fig. 1

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Evaluation of mitochondrial activity of SFCs exposed to different concentrations of BMP-4. Comparison of the cellular viability of SFCs from patients with (W/OA) and without OA (W/O OA) exposed to different concentrations of BMP-4 did not show statistically significant differences between the groups ( p  > 0.05), although mitochondrial activity has increased up to 2nM ( p  < 0.001) and decreased at 10 nM ( p  < 0.001) in both groups. Control/Cells: Well containing only cells without BMP-4; Control/Factor: Wells containing medium with BMP-4 without cells; * p  < 0.001.

TGF-β, Smad3 and BMP-4 Inhibitors Control SFC Mitochondrial Activity

In the next step, we measured the mitochondrial activity of the SFCs after exposure to TGF-β, Smad3 and BMP-4 inhibitors by MTT (3-[4,5-dimethylthiazol-2-yl]-2,5-diphenyltetrazolium bromide) assay. The SFCs from patients with and without knee OA were exposed to TGF-β (TGF-β1 R1 kinase 616451), Smad3 (Smad3 SiS3 566405) and BMP-4 (BMP inhibitor II DMH1 203646) inhibitors at the concentration of 10 nM. Then, mitochondrial activity was measured after 24, 48 and 72 hours.

The analysis ( Figure 2 ) evidenced a decrease of SFCs without OA activity after 24 hours in the presence of the TGF-β inhibitor (W/O OA 202.1 ± 6.09 versus W/O OA + TGF-β inhibitor 175.7 ± 9.56; n  = 3/group; p  = 0.016) and an increase of SFCs activity after 48 hours (W/O OA 190 ± 6.5 versus W/O OA + TGF-β inhibitor 242 ± 2.5; n  = 3/group; p  < 0.0001). No differences were found after 72 hours (W/O OA 134.3 ± 5.1 versus W/O OA + TGF-β inhibitor 135 ± 3.01; n  = 3/group; p  > 0.05). Regarding the SFCs from patients with OA, the analysis showed an increase of the SFC activity only after 48 hours in the presence of the TGF-β inhibitor (W/OA 215 ± 2.14 versus W/OA + TGF-β inhibitor 229.3 ± 4.16; n  = 3/group; p  = 0.0046). No differences were found after 24 hours (W/OA 175.2 ± 17.72 versus W/OA + TGF-β inhibitor 173.9 ± 10.34; n  = 3/group; p  > 0.05) and 72 hours (W/OA 140.7 ± 3.2 versus W/OA + TGF-β inhibitor 144 ± 3.6; n  = 3/group; p  > 0.05).

Fig. 2.

Fig. 2

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Mitochondrial activity of SFCs after TGF-β inhibitor treatment. A reduction of mitochondrial activity was observed in SFCs of W/O OA subjects after TGF-β inhibitor treatment for 24 hours ( p  = 0.016) and an increase after 48 hours ( p  < 0.0001), while no differences were found after 72 hours ( p  > 0.05). On the other hand, the SFCs of W/OA subjects showed an increase in activity only after 48 hours in the presence of the inhibitor ( p  = 0.0046), but no differences were observed after 24 hours and 72 hours ( p  > 0.05).

The SFCs without OA activity reduced after 24 hours in the presence of the Smad3 inhibitor (W/O OA 202.1 ± 6.09 versus W/O OA + Smad3 inhibitor 189.7 ± 3.39; n  = 3/group; p  = 0.046), but it increased after 48 hours (W/O OA 190 ± 6.5 versus W/O OA + Smad3 inhibitor 224 ± 4.04; n  = 3/group; p  = 0.0002) and 72 hours (W/O OA 134.3 ± 5.17 versus W/O OA + Smad3 inhibitor 158 ± 6.5; n  = 3/group; p  = 0.006) in the presence of the Smad3 inhibitor. In relation to the SFCs from patients with OA, the analysis evidenced reduction of the activity only after 72 hours in the presence of the Smad3 inhibitor (W/OA 162 ± 3.7 versus W/OA + Smad3 inhibitor 151 ± 2; n  = 3/group; p  = 0.0102), No differences were found after 24 hours (W/OA 180 ± 7.4 versus W/OA + Smad3 inhibitor 318.2 ± 5.99; n  = 3/group; p  > 0.05) and 48 hours (W/OA 212.3 ± 6.5 versus W/OA + Smad3 inhibitor 206.7 ± 5.8; n  = 3/group; p  > 0.05) ( Figure 3 ).

Fig. 3.

Fig. 3

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Mitochondrial activity of SFCs after Smad3 inhibitor treatment. The activity of the SFCs of W/O OA subjects reduced after 24 hours of treatment using Smad3 inhibitor ( p  = 0.046) but increased after 48 hours ( p  = 0.0002) and 72 hours ( p  = 0.006). On the other hand, the SFCs of W/OA subjects showed a reduction in activity only after 72 hours in the presence of the Smad3 inhibitor ( p  = 0.0102), but no differences were found after 24 and 48 hours ( p  > 0.05).

The SFCs without OA activity increased after 48 hours (W/O OA 134.3 ± 5.17 versus W/O + BMP-4 inhibitor 177.3 ± 14.45; n  = 3/group; p  = 0.0064) and 72 hours (W/O 173.3 ± 1.83 versus W/O + BMP-4 inhibitor 243.7 ± 13.15; n  = 3/group; p  < 0.0001) in the presence of the BMP-4 inhibitor. The SFCs with OA activity also increased after 48 hours (W/OA 159 ± 3.21 versus W/OA + BMP-4 inhibitor 218 ± 8.94; n  = 3/group; p  < 0.0001) and 72 hours (W/OA 158 ± 2.29 versus. BMP-4 inhibitor 240.3 ± 0.83; n  = 3/group; p  < 0.0001) in the presence of the BMP-4 inhibitor. There were no differences in the activity of the SFCs without OA (W/O 179.9 ± 16.27 versus W/O + BMP-4 inhibitor 156.8 ± 16.27; n  = 3/group; p  > 0.05) and with OA (W/OA 140.1 ± 14.59 versus BMP-4 inhibitor 172.9 ± 21.15; n  = 3/group; p  > 0.05) after 24 hours) in the presence of the BMP-4 inhibitor ( Figure 4 ).

Fig. 4.

Fig. 4

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Mitochondrial activity of SFCs after BMP4 inhibitor treatment. The activity of the SFCs of W/O OA subjects increased after 48 hours ( p  = 0.0064) and 72 hours ( p  < 0.0001) of treatment with the BMP-4 inhibitor. The activity of the SFCs of W/OA subjects also increased after 48 hours ( p  < 0.0001) and 72 hours in the presence of the BMP-4 inhibitor ( p  < 0.0001). There were no differences in activity neither between the SFCs of W/O OA nor W/OA subjects after treatment with BMP-4 inhibitor after 24 hours ( p  > 0.05).

Discussion

We have previously documented that osteoarthritic synovial fluid modulates SFC viability in vitro . 21 Hence, we decided to investigate if the metabolic activity of SFCs could be modulated by BMP-4, Smad3 and TGF-β, due to the importance of these pathways in chondrogenesis.

Bone morphogenetic protein 4 stimulates aggrecan and collagen type II synthesis and suppresses chondrogenic hypertrophy, suggesting that it may be promising agent for cartilage repair induction. Bone morphogenetic protein modulation can be useful in chronic joint diseases since it can help the equilibrium between joint destruction and repair. 22 To elucidate how SFCs behave in the presence of exogenous BMP-4, in the present study, we showed that the metabolic activity of SFCs increases after exposure to progressive BMP-4 concentrations from 0.1 to 2 nM, suggesting that the SFCs are responding to BMP-4 induction in order to promote repair, maybe by stimulation of chondrogenic commitment, decreasing at 10 nM, which seems to be a concentration at which the system is already saturated, no longer influencing the fate of the SFCs. Moreover, there were no differences in this activity when comparing SFCs from patients with and without OA, indicating that, despite the inflammatory influence of OA on SFCs, they still maintain the ability to respond to BMP-4 signaling.

On the other hand, we also observed that mitochondrial activity raised after 48 and 72 hours in the presence of the BMP-4 inhibitor. It is widely known that BMP-4 modulates chondrogenesis and endochondral ossification, 23 and also participates in signaling for chondrocyte proliferation and hypertrophy to apoptosis and angiogenesis, which allows osteoblasts migration and ossification. Bone morphogenetic protein 4 receptor blockade led to decreased expression of BMP-4 signaling, and raised the metabolic activity of SFCs, suggesting that the chondrogenic step of SFC differentiation remained in the proliferative stage, which could explain the increased metabolic activity of SFCs. Despite the importance of BMP-4, we did not find studies regarding its influence on the behavior of SFCs . Other studies, however, verified that pretreatment of SFCs with TNF-α 24 and IL-1β 25 promoted their proliferation. Our results indicated that SFCs treatment both with BMP-4 or BMP-4 inhibitor may influence SFCs proliferation, depending on the magnitude of the stimuli.

The presence of TGF-β in the synovial fluid of patients with OA has an important role in the recruitment of MSC. Besides, synovial fluid from patients with OA can stimulate the expansion of MSC in culture of synovium cells of patients with OA, through stimulation of cell migration. 26 Another study showed that the continuous expression of TGF-β1 over synovium MSC stimulated their proliferation and chondrogenic potential. 27

During chondrogenesis, TGF-β is important for chondrocyte differentiation at the early stages and, ultimately, in chondrogenic induction, it inhibits terminal chondrocyte differentiation. 12 Moreover, TGF-β promotes growth, maintenance and articular cartilage repair through a fine regulation of its signaling pathway, which targets a set of transcription and growth factors. 28 Regulated cell phenomena include proliferation, migration, inflammation, carcinogenesis, extracellular matrix expression, protein synthesis and degradation, up to immune system functions. Therefore, many authors have affirmed that TGF-β pathway signaling has a central role in the development of OA. 7 12 14 29 As we observed in the present study, TGF-β blockade promoted a dynamic change in mitochondrial activity. In the first 24 hours, a reduction was observed in patients without OA in the presence of the TGF-β inhibitor. Smad3 receptor inhibition decreased activity only in the SFCs from patients without OA. Surprisingly, after 48 hours of inhibition, activity increased in the SFCs from patients with and without OA in the presence of the TGF-β inhibitor. Smad3 inhibition promoted an increase in the activity of SFCs only from patients without OA in this same period. After 72 hours of exposure to the TGF-β inhibitor, activity was similar in both group of SFCs, but it was increased in the presence of the Smad3 inhibitor in the case of SFCs from patients without OA and decreased in the ones with OA.

Conclusion

In conclusion, there are no differences in the mitochondrial activity of SFCs from patients with and without OA, independent of the BMP-4 concentration to which they have been exposed. Moreover, the activity of SFCs from patients with and without OA is modulated by TGF-β, Smad 3 and BMP-4 inhibitors.

Agradecimentos

Os autores agradecem ao Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico, à Fundação de Apoio à Pesquisa do Estado do Rio de Janeiro e ao Ministério da Saúde pelo apoio.

Acknowledgements

The authors thank the Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico , the Fundação de Apoio à Pesquisa do Estado do Rio de Janeiro and the Ministério da Saúde for the support.

Conflitos de Interesse Os autores declaram não haver conflitos de interesse.

Contribuições autorais

de Sousa EB Conceito e projeto, fornecimento de material de estudo ou pacientes, coleta e montagem de dados, análise e interpretação de dados, redação de manuscritos, aprovação final do manuscrito.

Moura Neto V.: Análise e interpretação de dados, aprovação final do manuscrito.

Aguiar D. P.: Conceito e projeto, coleta e montagem de dados, análise e interpretação de dados, redação de manuscritos, aprovação final do manuscrito.

Todos os autores leram e aprovaram o manuscrito final.

Author Contributions

de Souza E. B.: Concept and design, provision of study material or patients, collection and assembly of data, data analysis and interpretation, manuscript writing, final approval of the manuscript.

Moura Neto V.: Data analysis and interpretation, final approval of the manuscript.

Aguiar D. P.: Concept and design, collection and assembly of data, data analysis and interpretation, manuscript writing, final approval of the manuscript.

All authors read and approved the final manuscript.

*

Trabalho desenvolvido na Divisão de Ensino e Pesquisa, Instituto Nacional de Ortopedia e Traumatologia Jamil Haddad, Rio de Janeiro, RJ, Brasil.

*

Work developed at the Divisão de Ensino e Pesquisa, Instituto Nacional de Ortopedia e Traumatologia Jamil Haddad, Rio de Janeiro, RJ, Brazil.

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BMP-4, TGF-β e Smad3 como moduladores da viabilidade das células do líquido sinovial *

Resumo

Objetivo  Nosso objetivo foi avaliar a modulação das células do líquido sinovial (SFCs, na sigla em inglês) de pacientes com e sem osteoartrite (OA) por proteína morfogenética óssea 4 (BMP-4), Smad3 e transformador do fator de crescimento β (TGF-β).

Métodos  O do líquido sinovial foi coletado de pacientes submetidos a artroscopia ou artroplastia do joelho, e centrifugados para isolar as células do liquido sinovial. As células foram cultivadas por 21 dias e caracterizadas como células-tronco mesenquimais (MSCs, na sigla em inglês) de acordo com os critérios da International Society of Cell Therapy . Em seguida, realizamos um ensaio de brometo de 3-4,5-dimetil-tiazol-2-il-2,5-difeniltetrazólio (MTT) depois de expor células com e sem OA para TGF-β, inibidores de via Smad3 e BMP-4 e para diferentes concentrações de BMP-4.

Resultados  A exposição aos inibidores TGF-β, Smad3 e BMP-4 modifica a atividade mitocondrial das SFCs. A atividade das SFCs é modificada por influências sobre o aumento das concentrações de BMP-4, mas não há diferença na atividade celular entre pacientes com e sem OA.

Conclusão  TGF-β, Smad3 e BMP-4 modulam a atividade das SFCs de pacientes com e sem OA do joelho.

Palavras-chave: células-tronco mesenquimais, osteoartrite, células do líquido sinovial, caminho TGF-β

Introdução

A terapia celular tem sido estudada devido a sua possível aplicação para o tratamento de lesões de cartilagem articular e osteoartrite (OA). 1 2 3 4 Neste contexto, as células-tronco mesenquimais (MSCs) têm sido comprovadamente úteis na regeneração tecidual e no tratamento de muitas doenças. 3 O líquido sinovial também possui uma população residente de MSCs, que é aumentada em pacientes com OA. 5 Além disso, demonstrou-se que o número de células era proporcional à gravidade da OA do joelho. 6

O transformador do fator de crescimento β (TGF-β) parece ter papel central no desenvolvimento da OA, seja inicialmente como fator protetor ou participando da patogênese da doença. 7 A superfamília TGF-β é um grupo de polipeptídios secretos, incluindo TGF-β1, 2, 3, ativações, inibinas, proteínas morfogenéticas ósseas (BMPs, na sigla em inglês), e fatores de crescimento e diferenciação. 8 9 Ela atua em todas as etapas de condrogênese e é o principal gatilho através de precursores mesenquimais. 10 11 12 Nos primeiros estágios de diferenciação dos condrócitos, o TGF-β parece ter papel estimulante. No entanto, nos estágios finais, sua ação inibe a diferenciação da terminação do condrócito. 12 13 AS BMPs estão envolvidas em todas as etapas da condrogênese e são essenciais para a ossificação endocondral. Além disso, muitas BMPs foram detectadas tanto na cartilagem normal quanto na osteoartrítica. 9

A senescência tem impactos nas vias TGF-β e BPM devido à diminuição da expressão dos receptores e à redução da ativação do Smad3. Isso poderia explicar a estreita relação entre senescência e desenvolvimento de OA. 14 Pacientes com OA têm níveis elevados de BMP-2 15 e BMP-7 16 em plasma e líquido sinovial em comparação com indivíduos saudáveis. Além disso, os níveis de BMP-7 estão correlacionados com a magnitude de progressão radiográfica da OA. 17 No entanto, a expressão de BMP-4, que estimula a síntese da matriz extracelular em condrócitos, é diminuída nos tecidos sinoviais de OA e artrite reumatóide (AR), indicando um desequilíbrio da homeostase articular na doença articular. 18 O objetivo do presente estudo foi avaliar o papel de BMP-4, Smad3 e TGF-β na viabilidade de células do líquido sinovial (SFCs, na sigla em inglês) de pacientes com e sem OA.

Métodos

População e Coleta de Líquido Sinovial

A população do estudo foi composta por pacientes submetidos ao tratamento cirúrgico do joelho em nosso Instituto. Os pacientes elegíveis de ambos os sexos foram divididos em dois grupos: pacientes sem OA do joelho (W/O OA), Kellgren-Lawrence = 0, e pacientes com OA do joelho (W/OA), Kellgren-Lawrence > 2. Foram excluídos pacientes com infecção do joelho, doenças autoimunes ou submetidos a cirurgias anteriores no joelho. A OA de joelho foi classificada de acordo com a classificação de Kellgren e Lawrence usando radiografias padrão em pé. 19 Um mililitro de fluido sinovial foi coletado da articulação do joelho dos pacientes W/O OA no início da artroscopia por aspiração de seringa, logo após a confecção dos portais, e dois mililitros foram coletados da articulação do joelho dos pacientes W/OA por aspiração de seringa após artrotomia. O presente estudo foi realizado de acordo com os princípios da Declaração de Helsinque e foi aprovado pelo Conselho de Ética Institucional (CAAE 08663912.3.0000.5273).

Isolamento e Cultura de Células do Líquido Sinovial

Os espécimes de líquido sinovial foram primeiro centrifugados a 16,6 g por 5 minutos em temperatura ambiente, e depois a 1.600 g por 5 minutos a 4°C. O sobrenadante foi armazenado em partes de 1 mL a - 80°C para análise posterior. O pellet da primeira centrifugação foi suspenso no Meio de Dulbecco Modificado por Iscove (IMDM, Sigma, Saint Louis, Missouri) complementado com 10% de soro bovino fetal (FBS, Gibco, Thermo Fisher, Waltham, MA, EUA). As células foram semeadas em 5 a 7 × 10 5 células por frascos de cultura T-75 cm 2 . Após 24 horas, as células foram lavadas uma vez com meio livre de soro e o meio foi trocado. As culturas celulares foram mantidas a 37°C em uma atmosfera umidificada contendo 5% de CO 2 . O meio era trocado a cada 2 dias. As células foram colhidas e rebanhadas para expansão em 80% da confluência até a 3ª passagem. A identidade das SFCs foi avaliada de acordo com o protocolo definido pela International Society of Cell Therapy 20 e descrita em um estudo anterior. 21

Atividade Mitocondrial SFC por MTT

Para avaliar a atividade mitocondrial do SFC exposta a diferentes concentrações de BMP-4, foi realizado um ensaio de atividade mitocondrial por ensaio de brometo de 3-4,5-dimetil-tiazol-2-il-2,5-difeniltetrazólio (MTT) (4-[4,5-dimetilthiazol-2-yl]-2,5-diphenyltetrazolium brometo). Em uma placa de 96 poços, 5 × 10 3 SFC de pacientes W/O OA ( n  = 3) e W/OA ( n  = 3) foram semeados em 200µL de meio/poço e expostos a concentrações progressivas de BMP-4 (0,1 nM, 0,5 nM, 2 nM e 10 nM) e mantido a 37°C em uma atmosfera umidificada contendo 5% de CO 2 .

O controle da atividade mitocondrial do SFC dos pacientes W/O OA ( n  = 3) e W/OA ( n  = 3) foi avaliado pelo bloqueio das vias BMP-4, TGF-β e Smad3. Como tal, o SFC foi cultivado na presença dos inibidores específicos dos alvos Smad3 (Smad3 SiS3 566405, Millipore, Burlington, Massachusetts, EUA), BMP-4 (inibidor de BMP II DMH1 203646, Merckmillipore, Burlington, Massachusetts, EUA) e TGF-β (TGF-β1 R1 quinase 616451, Merckmillipore, Burlington, Massachusetts, EUA) a 10 nM.

Após a adesão celular, o meio de cultura foi substituído pelo meio de Iscove ( Sigma-Aldrich , San Luis, Missouri, EUA) suplementado com 1% de soro bovino fetal ( Sigma-Aldrich , San Luis, Missouri, EUA) contendo os inibidores específicos para cada tratamento. O SFC foi tratado com 100 μL das respectivas soluções de controle e experimentais em 37°C em uma atmosfera umidificada contendo 5% de CO 2 para 24, 48 e 72 horas. Em seguida, o SFC foi lavado 2 vezes com 200 μL PBS 1x estéril a 37°C e 100 μL da solução MTT (0,5mg/mL) foi adicionado a cada poço. A placa foi mantida a 37°C em uma atmosfera umidificada contendo 5% de CO 2 durante 4 horas.

Após esse período, a solução MTT foi removida e 100 μL dimetilsulfóxido (DMSO) foi adicionada. A placa foi agitada por 20 minutos antes da análise espectrofotométrica em comprimento de onda de 570 nM usando o sistema de detecção Glomaxmulti (Glomaxmulti, Sistema de detecção, Promega, Madison, Wisconsin, EUA). A análise da atividade mitocondrial do SFC foi medida após 24, 48 e 72 horas de exposição a cada inibidor e controle específico. O controle da atividade mitocondrial foi determinado pelo MTT tanto por poços contendo apenas meio com BMP4 sem células (controle/fator) quanto por poços contendo apenas meio e células, mas sem BMP4.

Análise Estatística

Os dados MTT foram exportados do sistema de detecção Glomaxmulti (Glomaxmulti, Sistema de Detecção, Promega, Madison, Wisconsin, EUA) para uma planilha de Microsoft Excel (Microsoft Corporation, Redmond, WA, EUA), analisada no GraphPad Prism para Windows 6.0 (San Diego, California, EUA) e apresentada como ± desvio-padrão médio. Para comparar grupos, foi utilizada a análise de variância (ANOVA) bidirecional, seguida pelo teste t de Student não pareado unicaudal . Os dados foram considerados significativos quando p  < 0,05.

Resultados

BMP-4 modula a viabilidade de SFC

A atividade mitocondrial por MTT não aumentou as diferenças entre as amostras de pacientes com e sem OA de joelho quando analisadas em cada situação experimental, independentemente da concentração de BMP-4 (p > 0,05). Quando analisados os dados em relação às concentrações crescentes de BMP-4, verifica-se que a atividade mitocondrial das SFCs de pacientes com OA aumentou progressivamente de acordo com a exposição a maiores concentrações de BMP-4 (0,1 nM 264,4 ± 11,94 versus 0,5 nM 562,8 ± 26,17, p  < 0.0001; 0,5 nM 562,8 ± 26,17 versus 2 nM 1157 ± 40,45, p < 0,0001), diminuindo na exposição à concentração de 10 nM (2 nM 1157 ± 40,45 versus 10 nM 124,9 ± 14,62, p < 0,0001), mostrando toxicidade. O mesmo foi observado para a atividade mitocondrial das SFCs de pacientes sem OA (0,1 nM 141,7 ± 20,83 versus 0,5 nM 496,3 ± 62,44, p < 0,0001; 0,5 nM 496,3 ± 62,44 versus 2 nM 1134 ± 69,22, p  < 0,0001; 2 nM 1134 ± 69,22 versus 10 nM 168,2 ± 20,33, p  < 0,0001) ( Figura 1 ).

Fig. 1.

Fig. 1

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Avaliação da atividade mitocondrial das SFCs expostas a diferentes concentrações de BMP4. A comparação da viabilidade celular de SFCs de pacientes com (W/OA) e sem OA (W/O OA) exposta a diferentes concentrações de BMP-4 não apresentou diferenças estatisticamente significativas entre os grupos ( p  > 0,05), embora a atividade mitocondrial tenha aumentado até 2nM ( p  < 0,001) e diminuído em 10 nM ( p  < 0,001) em ambos os grupos. Controle/Células: Poço contendo apenas células sem BMP-4; Controle/Fator: Poços contendo meio com BMP-4 sem células; *p < 0,001.

Inibidores TGF-β, Smad3 e BMP-4 controlam atividade mitocondrial das SFCs

No passo seguinte, medimos a atividade mitocondrial das SFCs após a exposição aos inibidores TGF-β, Smad3 e BMP-4 por ensaio MTT [4-(4,5-dimetilthiazol-2-yl)-2,5-difeniltetrazolium]. As SFCs de pacientes com e sem OA de joelho foram expostas a inibidores TGF-β (TGF-β1 R1 quinase 616451), Smad3 (Smad3 SiS3 566405) e BMP-4 (inibidor de BMP II DMH1 203646) na concentração de 10 nM. Em seguida, a atividade mitocondrial foi medida após 24, 48 e 72 horas.

A análise ( Figura 2 ) evidencia uma diminuição das SFCs sem atividade de OA após 24 horas na presença do inibidor de TGFβ (W/O OA 202,1 ± 6,09 versus W/O OA + inibidor de β 175,7 ± 9,56; n  = 3/grupo; p  = 0,016) e aumento da atividade das SFCs após 48 horas (W/OA 190 ± 6,5 versus W/OA + TGF-inibidor de β 242 ± 2,5; n  = 3/grupo; p  < 0,0001). Não foram encontradas diferenças após 72 horas (W/O OA 134,3 ± 5,1 versus W/O OA + inibidor TGF-β 135 ± 3,01; n  = 3/grupo; p  > 0,05). Em relação às SFCs de pacientes com OA, a análise mostrou aumento da atividade das SFCs somente após 48 horas na presença do inibidor de TGF-β (W/OA 215 ± 2,14 versus W/OA + inibidor TGF-β 229,3 ± 4,16; n  = 3/grupo; p  = 0,006). Não foram encontradas diferenças após 24 horas (W/OA 175,2 ± 17,72 versus W/OA + inibidor TGF-β 173,9 ± 10,34; n  = 3/grupo; p  > 0,05) e 72 horas (W/OA 140,7 ± 3,2 versus W/OA + inibidor TGF-β 144 ± 3,6; n  = 3/grupo; p  > 0,05).

Fig. 2.

Fig. 2

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Atividade mitocondrial de SFC após tratamento inibidor com TGF-β. Observou-se redução da atividade mitocondrial nas SFCs do grupo W/O OA após tratamento inibidor TGF-β por 24 horas ( p  = 0,016) e aumento após 48 horas ( p  < 0,0001), enquanto não foram encontradas diferenças após 72h ( p  > 0,05). Por outro lado, as SFCs do grupo W/OA apresentaram aumento da atividade somente após 48 horas na presença do inibidor ( p  = 0,0046), mas não foram observadas diferenças após 24 horas e 72 horas ( p  > 0,05).

A atividade das SFCs sem OA reduziu após 24 horas na presença do inibidor Smad3 (W/O OA 202.1 ± 6,09 versus W/O OA + inibidor Smad3 189,7 ± 3,39; n  = 3/grupo; p  = 0,046), mas aumentou após 48 horas (W/O OA 190 ± 6,5 versus W/OA + inibidor Smad3 224 ± 4,04; n  = 3/grupo; p  = 0,0002) e 72 horas (W/O OA 134,3 ± 5,17 versus W/O OA + inibidor Smad3 158 ± 6,5; n  = 3/grupo; p  = 0,006) na presença do inibidor Smad3. Em relação às SFCs de pacientes com OA, a análise evidencia a redução da atividade somente após 72 horas na presença do inibidor Smad3 (W/OA 162 ± 3,7 versus inibidor W/OA + Smad3 151 ± 2; n  = 3/grupo; p  = 0,0102). Não foram encontradas diferenças após 24 horas (W/OA 180 ± 7,4 versus W/OA + inibidor Smad3 318,2 ± 5,99; n  = 3/grupo; p  > 0,05) e 48 horas (W/OA 212,3 ± 6,5 versus W/OA + inibidor Smad3 206,7 ± 5,8; n  = 3/grupo; p  > 0,05) ( Figura 3 ).

Fig. 3.

Fig. 3

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Atividade mitocondrial das SFCs após tratamento inibidor de Smad3. A atividade de SFC W/O OA reduziu após 24 horas de tratamento usando inibidor Smad3 ( p  = 0,046), mas aumentou após 48 horas ( p  = 0,0002) e 72 horas ( p  = 0,006). Por outro lado, as SFCs do grupo W/OA apresentaram redução da atividade somente após 72 horas na presença do inibidor Smad3 ( p  = 0,0102), mas não foram encontradas diferenças após 24 e 48 horas ( p  > 0,05).

A atividade das SFCs sem OA aumentou após 48 horas (W/O OA 134,3 ± 5,17 versus W/O + inibidor BMP4 177,3 ± 14,45; n  = 3/grupo; p  = 0,0064) e 72 horas (W/O 173,3 ± 1,83 versus W/O + inibidor BMP4 243,7 ± 13,15; n  = 3/grupo; p  < 0,0001) na presença do inibidor BMP-4. As SFCs com atividade OA também aumentaram após 48 horas (W/OA 159 ± 3,21 versus W/OA + inibidor BMP4 218 ± 8,94; n  = 3/grupo; p  < 0,0001) e 72 horas (W/OA 158 ± 2,29 versus inibidor BMP4 240,3 ± 0,83; n  = 3/grupo; p  < 0,0001) na presença do inibidor BMP-4. Não houve diferenças na atividade das SFCs sem OA (W/O 179,9 ± 16,27 versus W/O + inibidor BMP4 156,8 ± 16,27; n  = 3/grupo; p  > 0,05) e com OA (W/OA 140,1 ± 14,59 versus inibidor BMP4 172,9 ± 21,15; n  = 3/grupo; p  > 0,05) após 24 horas na presença do inibidor BMP-4 ( Figura 4 ).

Fig. 4.

Fig. 4

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Atividade mitocondrial das SFCs após tratamento inibidor BMP4. A atividade dass SFCs do grupo W/O OA aumentou após 48 horas ( p  = 0,0064) e 72 horas ( p  < 0,0001) de tratamento com inibidor de BMP4. A atividade das SFCs do grupo W/OA também aumentou após 48 horas ( p  < 0,0001) e 72 horas na presença do inibidor BMP4 ( p  < 0,0001). Não houve diferenças na atividade nem entre as SFCs do grupo W/O OA, nem do grupo W/OA após tratamento com inibidor BMP4 após 24 horas ( p  > 0,05).

Discussão

Documentamos anteriormente que o líquido sinovial osteoartrítico modula a viabilidade das SFCs in vitro . 21 Por isso, decidimos investigar se a atividade metabólica das SFCs poderia ser modulada por BMP-4, Smad3 e TGF-β, devido à importância dessas vias na condrogênese.

O BMP-4 estimula a síntese de aggrecan e colágeno tipo II e suprime a hipertrofia condrogênica, sugerindo que pode ser um agente promissor para a indução de reparação de cartilagem. A modulação do BMP pode ser útil em doenças articulares crônicas, pois pode ajudar no equilíbrio entre destruição articular e reparação. 22 Para elucidar como as SFCs se comportam na presença de BMP-4 exógeno, no presente estudo, mostramos que a atividade metabólica das SFCs aumenta após a exposição às concentrações progressivas de BMP-4 de 0,1 a 2 nM, sugerindo que as SFCs estão respondendo à indução de BMP-4 a fim de promover a reparação, talvez por estímulo ao comprometimento condrogênico, diminuindo a 10 nM, que parece ser uma concentração na qual o sistema já está saturado, não influenciando mais no destino das SFCs. Além disso, não houve diferenças nessa atividade ao comparar as SFCs de pacientes com e sem OA, indicando que, apesar da influência inflamatória da OA nas SFCs, elas ainda mantêm a capacidade de responder à sinalização BMP-4.

Por outro lado, observou-se também que a atividade mitocondrial aumentou após 48 e 72 horas na presença do inibidor BMP-4. É amplamente conhecido que o BMP-4 modula a condrogênese e a ossificação endocondral, 23 assim como participa da sinalização para proliferação de condrócitos e hipertrofia à apoptose e angiogênese que permite a migração e ossificação dos osteoblastos. O bloqueio do receptor BMP-4 levou à diminuição da expressão da sinalização BMP-4, e elevou a atividade metabólica das SFCs, sugerindo que o passo condrogênico da diferenciação das SFCs permaneceu no estágio proliferativo, o que poderia explicar o aumento da atividade metabólica das SFCs. Apesar da importância do BMP-4, não encontramos estudos sobre sua influência no comportamento das SFCs. Outros estudos, no entanto, verificaram que o pré-tratamento das SFCs com TNF-β 24 e IL-1β 25 promoveu sua proliferação. Nossos resultados indicados no tratamento das SFCs tanto com inibidor BMP-4 ou BMP-4 podem influenciar a proliferação de SFCs, dependendo da magnitude dos estímulos.

A presença de TGF-β no líquido sinovial de pacientes com OA tem um papel importante no recrutamento de MSC. Além disso, o líquido sinovial de pacientes com OA pode estimular a expansão do MSC na cultura de células sinoviais de pacientes com OA, através da estimulação da migração celular. 26 Outro estudo mostrou que a expressão contínua de TGF-β1 sobre o MSC sinovial estimulou sua proliferação e potencial condrogênico. 27

Durante a condrogênese, a TGF-β é importante para a diferenciação de condrócitos em estágios iniciais e, por fim, na indução condrogênica, inibe a diferenciação de condrócitos terminais. 12 Além disso, a TGF-β promove o crescimento, a manutenção e a reparação da cartilagem articular por meio de uma boa regulação de sua via de sinalização, que visa um conjunto de fatores de transcrição e crescimento. 28 Fenômenos celulares regulados incluem proliferação, migração, inflamação, carcinogênese, expressão de matriz extracelular, síntese proteica e degradação, até funções do sistema imunológico. Muitos autores afirmaram que a sinalização de vias TGF-β tem um papel central no desenvolvimento da OA. 7 12 14 29 Como observamos no presente estudo, o bloqueio de TGF-β promoveu uma mudança dinâmica na atividade mitocondrial. Nas primeiras 24 horas, foi observada uma redução em pacientes sem OA na presença do inibidor TGF-β. A inibição do receptor Smad3 diminuiu a atividade apenas nas SFCs de pacientes sem OA. Surpreendentemente, após 48 horas de inibição, a atividade aumentou nas SFCs de pacientes com e sem OA na presença do inibidor TGF-β. A inibição do Smad3 promoveu um aumento na atividade das SFCs apenas de pacientes sem OA neste mesmo período. Após 72 horas de exposição ao inibidor TGF-β, a atividade foi semelhante em ambos os grupos de SFCs, mas aumentou na presença do inibidor Smad3 no caso de SFCs de pacientes sem OA e diminuiu nos com OA.

Conclusão

Em conclusão, não há diferenças na atividade mitocondrial das SFCs de pacientes com e sem OA, independentemente da concentração BMP-4 à qual foram expostas. Além disso, a atividade das SFCs de pacientes com e sem OA é modulada pelos inibidores de TGF-β, Smad 3 e BMP-4.

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