复方积雪草减轻小鼠日本血吸虫引起的肝纤维化：通过调控TLR4/MyD88通路抑制炎症-纤维化级联反应

Abstract

目的

基于网络药理学和分子对接，联合日本血吸虫（Sj）感染小鼠引起肝纤维化实验验证，探究复方积雪草（CCA）有效成分抗Sj病肝纤维化的作用机制。

方法

利用传统中药系统药理学数据库筛选CCA的活性成分及其作用靶点，与Sj病肝纤维化发病机制相关的靶点进行比对，获得CCA抗Sj病肝纤维化的潜在作用靶点；采用STRING数据库，构建药物疾病交集靶点的PPI网络，筛选核心靶点；通过Cytoscape 3.9.1构建“药物-成分-靶点-通路-疾病”网络图；运用David数据库进行GO和KEGG富集分析；利用PyMol和AutoDockVina1.1.2对CCA主要活性成分与核心靶点使用分子对接技术进行活性验证。将36只小鼠随机均分为正常对照组（control）、模型组（Sj）、复方积雪草组（Sj+CCA）；control组不做任何处理，其余经腹部皮肤感染血吸虫尾蚴建模成功8周后，分别每天灌胃生理盐水和CCA水煎剂，连续8周。采用HE、Masson染色法检测小鼠肝组织病理变化；免疫组化染色检测肝脏Collagen-Ⅰ、Collagen-Ⅲ的表达水平；ELISA法测定小鼠血清中IL-6和TNF-α水平变化；蛋白质印迹法检测肝组织TLR4（TOLL样受体4）、MyD88（髓分化因子88）蛋白表达。

结果

筛选得到107种CCA活性成分（OB≥30%，DL≥0.18），791个成分靶点，Sj病肝纤维化靶点集和CCA靶点集进行交集分析后共得到37个关键靶点。其中TNF、TP53、JUN、MMP9、CXCL为核心靶点，涉及的主要信号通路为 Lipid and atherosclerosis、IL-17 signaling pathway、Fluid shear stress and atherosclerosis、Chagas disease、Pathways in cancer等。分子对接结果提示，CCA107个活性成分中槲皮素与 TNF、TP53、JUN、MMP9有较好的结合活性。在小鼠Sj病肝纤维化模型中，CCA处理能够减轻炎性细胞浸润，减少Collagen-I、Collagen-III沉积（P<0.001，P<0.01），改善肝组织结构，降低其炎症因子IL-6、TNF-α的含量（P<0.05），下调TLR4、MyD88蛋白表达（P<0.01）。

结论

CCA可能作用于TNF、MMP9、JUN、TP53靶点，调控TLR4/MyD88信号通路，抑制IL-6、TNF-α等促炎因子释放，进而减少HSC活化及胶原纤维产生，降低ECM的沉积，阻断Sj虫卵肉芽肿的形成，发挥抗Sj感染引起的肝纤维化和保肝的作用。

肝纤维化是一种严重的肝脏疾病，其成因多样，包括病毒性肝炎、酒精滥用、非酒精性脂肪肝病、药物或代谢异常等；这些病因常通过长期的炎症、脂肪堆积、氧化应激等途径激活肝星状细胞或其他肝脏成纤维细胞，引发纤维化。日本血吸虫（Sj）病引起的肝纤维化，是由于Sj寄生在人体门静脉系统引起的一种严重的地方性寄生虫病。在中国、菲律宾、印尼、日本等国广泛传播，尤其是长江流域^［1］。Sj通过其生命周期的不同阶段，包括尾蚴、童虫和虫卵，引发复杂的免疫病理反应，形成虫卵肉芽肿。肉芽肿与虫卵的发育进程同步，先导致局部慢性炎症，后转变为肝纤维化等病理损伤^［2］。肝纤维化是Sj病的严重并发症，早期尚可逆转，因此必须在转变为肝硬化之前采取措施防治^［3］。然而，由于Sj病诱发的肝纤维化的发病机制复杂，单一靶点的药物疗效不佳^［4］。近年来，中医药以其成分复杂、多靶点的特点在治疗肝纤维化方面显示出良好的效果^［5］。尽管如此，目前尚无疗效明确的治疗Sj病肝纤维化的中医药可供临床应用。

复方积雪草（CCA）是“国医名师”王永钧教授多年经验处方，临床实践表明其在抗纤维化、延缓炎症等方面疗效显著^［6］。但CCA在防治Sj诱导的肝纤维化方面的具体有效成分和作用机制目前尚不明确^［7］。现有研究多集中在其对肝纤维化整体的治疗作用上，而对其具体作用机制的研究相对较少，且缺乏网络药理学方法的研究。

因此，本研究旨在利用网络药理学方法，从多成分、多靶点的角度初步探索CCA抗Sj病肝纤维化的药效物质基础、潜在靶点及信号通路。通过分子对接模拟CCA抗Sj病肝纤维化的关键成分及关键靶点进行对接，并结合体内实验，HE、Masson和免疫组化染色法检测肝组织病理变化，利用ELISA和蛋白质印迹法检测相关炎性因子和关键蛋白进一步验证。本研究创新性地运用网络药理学方法结合实验验证，从分子水平及体内整体水平探究CCA对Sj病肝纤维化的作用机制，为解决现有治疗问题提供新思路和新方法，为后续的深入研究及临床应用提供更为科学的理论依据和实验基础。

1. 材料和方法

1.1. 网络药理学

1.1.1. 数据库与分析软件

采用Drugbank（https：//go.drugbank.com）、ETCM（http：//www.tcmip.cn/ETCM）、TCMSP（https：//old.tcmsp-e.com/tcmsp.php）、GeneCards（https：//www.genecards.org）、Pubchem（https：//pubchem.ncbi.nlm.nih.gov）、Swisstargetprediction（http：//swisstargetprediction.ch）、DisGeNET（https：//www.disgenet.org）、OMIM（https：//www.omim.org）、UniProt（https：//www.uniprot.org）、STRING（https：//string-db.org）等数据库以及Venny 2.1.0、微生信在线平台、Cytoscape 3.9.1。

1.1.2. 中药活性成分的筛选和靶点的获取

从TCMSP数据库中查阅CCA的5种主要成分，按照口服生物利用率（OB≥30%）和类药性（DL≥0.18）条件筛选有效活性组分；其次，在"RelatedTargets"筛选出CCA的相关靶标，而后用Excel整合并去除重复部分得到潜在靶点；最后，借助于Uniprot、STRING等数据库将有效靶点转化成基因名称。

1.1.3. 疾病靶点的获取

在GeneCards、DisGeNET、OMIM及Therapeutic Target Database数据库中查询Sj病肝纤维化的相关靶点数据，运用Excel整合4个数据库中收集的数据删除重复项得到疾病靶点。

1.1.4. 潜在作用靶点的收集

将Sj病肝纤维化靶点和CCA靶点导入Venny2.1.0在线平台取交集，交集靶点即是CCA作用于Sj病肝纤维化的潜在作用靶点。

1.1.5. 蛋白相互作用网络图（PPI）的构建

运用String数据库，将交集Target基因添加至数据库内，设定目标物种为“Homo sapiens”，设定组合分数大于0.4且剔除离散点，从而建立PPI网络。此外，从数据源下载数据并导入Cytoscape 3.9.1软件，利用此软件的Network Analyse功能计算网络拓扑参数，获取度数，确立CCA对Sj病肝纤维化的关键节点。

1.1.6. 药物-成分-靶点-通路-疾病网络的构建

借助Cytoscape3.9.1软件，成功将CCA治疗Sj病肝纤维化的相关数据进行导入和分析，并以“药物-成分-靶点-通路-疾病”的逻辑关系建立相应的网络模型。

1.1.7. 富集分析

通过DAVID数据库，将交集靶点导入其中进行GO和KEGG富集分析，探究CCA在生物学过程（BP）、分子功能（MF）、细胞定位（CC）等方面对Sj病肝纤维化的具体作用，并使用微生信绘制GO富集条形图和KEGG富集分析气泡图。

1.2. 分子对接

在TCMSP 数据库中下载配体分子CCA关键成分mol2格式文件；在PDB数据库结合分辨率和活性小分子口袋完整程度，设置条件为”人”，借助PyMOL 3.0软件，筛选并下载核心靶点蛋白结构，对其进行预处理。运用AutoDock Vina1.1.2进行分子对接，将CCA与Sj病肝纤维化核心靶点进行对接。若结合能低于0 kcal/mol，代表两者可自发结合；若结合能低于-5 kcal/mol，示意有较强结合活性；若结合能低于-7 kcal/mol，则表示存在强烈结合活性。最后，将分析结果导入PyMOL 3.0软件进行美化及详细解读。

1.3. CCA对Sj诱导的肝纤维化模型小鼠的保护作用实验

1.3.1. 实验动物

36只普通级 6~8 周龄的雄性BALB/c小鼠，体质量18~22 g［长沙市天勤生物技术有限公司，许可证编号：SCXK（湘）2019-0014］，小鼠饲养区域通风良好，并在标准实验室条件下饲养，温度保持在25±1 ℃，相对湿度为（55±5）%，明暗交替各12 h，实验期间动物自由饮水及进食。本动物实验已通过本校实验动物福利伦理委员会审批（伦理批号：2023DWLL036）。阳性钉螺由湖北省荆州市疾病预防控制中心血吸虫病预防所提供，在实验室24~28 ℃下，采用常规方法逸出尾蚴。所有实验根据国家健康实验动物使用指南进行。

1.3.2. 药品与实验试剂

CCA煎剂（院内制剂），科研小鼠白介素6（IL-6）试剂盒、科研小鼠肿瘤坏死因子α（TNF-α）试剂盒（上海通蔚），RIPA裂解液、广谱蛋白酶抑制剂混合物（博士德），BCA蛋白定量测定试剂盒（鼎国昌盛），TLR4 Rabbit pAb、MyD88 Rabbit pAb、β-actin Rabbit mAb（爱博泰克），12~230 000 Separation8 x 13Capillary Cartridfes、25-Carpillary Cartridge、Secondary HRP Conjugate （proteinsimple），COL1A1、多聚体抗兔IgG-HRP试剂盒、内源性过氧化物酶阻断剂、 EDTA抗原修复液（10×）、抗体稀释液、PBS漂洗液、DAB显色试剂盒（黄）、Mayor’苏木素、中性树胶（BOSTER）。

1.3.3. 主要仪器

全自动蛋白质印迹定量分析系统（protein simple），恒温箱（日本三洋），微波炉（格兰仕），抗体孵育湿盒，显微镜（奥林巴斯），扫描仪（深圳生强科技）。

1.3.4. 实验方法

把小鼠随机分为3组，分别为control组、Sj组、Sj+CCA组，12只/组。将小鼠仰卧固定于鼠板上，去除下腹部小块区域被毛，将暴露在外的裸露皮肤用生理盐水冲洗2次。用接种环蘸取疫水于载玻片上，镜下观察并计数尾蚴，将蘸有疫水的载玻片（20±2 只尾蚴）贴附于小鼠腹部，约10 min，皮肤上出现充血点表明尾蚴感染成功。依据前期研究结果，选择2.5 mL/kg剂量进行给药。control组小鼠未感染Sj尾蚴。Sj组小鼠感染尾蚴8周后，灌胃生理盐水0.5 mL/d，连续8周。Sj+CCA组小鼠感染尾蚴后第8周开始灌胃2.5 mL/（kg·d） CCA水煎剂，连续8周。在第16周结束时，小鼠禁食16 h，称重。从小鼠眼球中收集血样，解剖取出肝脏用于进一步实验。

1.3.5. 肝组织病理形态学检测

采取颈椎脱位法处死小鼠，取肝组织中叶用4%多聚甲醛固定，通过不同浓度的乙醇梯度脱水，将样本被包埋在液体石蜡中，切片，用HE和Masson试剂染色，覆盖玻片，在光学显微镜下观察肝组织的病理变化。

1.3.6. 肝脏免疫组化染色

肝组织切片经二甲苯脱蜡及梯度乙醇水化后，采用内源性过氧化物酶阻断剂室温处理10 min阻断内源性过氧化物酶活性，经抗原修复及PBS漂洗，以5% BSA室温封闭30 min；随后与Collagen-I（Collagen-III）一抗（4 ℃孵育过夜，稀释比例为1∶200）及HRP聚合物标记的抗兔IgG二抗（37 ℃温育30 min）依次反应，DAB显色后经苏木素复染、碱性溶液返蓝及中性树胶封片，最终采用ImageJ软件对阳性染色区域（棕黄色颗粒）进行半定量分析。

1.3.7. 血清指标ELISA检测

小鼠摘眼球取血后静置60 min，于4 ℃、3500 r/min离心15 min，取上层血清。根据试剂盒说明书，检测血清白介素6（IL-6）、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）水平。

1.3.8. WES全自动蛋白表达分析系统检测肝组织内TLR4、MyD88蛋白的表达

蛋白含量取各组肝组织用RIPA裂解液进行裂解，通过BCA试剂盒测定总蛋白浓度后以备上样。用40 μL去离子水配制 DTT：取20 μL DTT、20 μL 10×Sample Buffer配制5×Master Mix，吹打均匀；用20 μL去离子水配制ladder，以1000∶1的比例稀释一抗；准备Streptavidin-HRP，Secondary HRP Conjugate（二抗）；配制发光液；将上述配制好的试剂依次加入板内，用离板机离心后上机检测。采用Compass for SW 6.3 软件分析实验结果，以β-actin作为内参，进行归一化分析，以得到蛋白相对表达定量结果。

1.4. 统计学分析

采用GraphPad Prism9软件进行数据分析。计量资料以均数±标准差表示，采用单因素方差分析评估多组间差异，并结合t检验进行组间对比，P<0.05为差异有统计学意义。

2. 结果

2.1. 潜在靶点的筛选结果

通过TCMSP数据库中Analysis Platform和Uniprot数据库检索，得到积雪草、黄芪、雷公藤、大黄、桃仁、当归相关靶点共791个；去掉重复项和删除无效成分，共得到CCA 107个活性成分。通过GeneCards、OMIM、DisGeNET及Therapeutic Target Database数据库得到Sj病肝纤维化相关靶点159个。

2.2. CCA、Sj病肝纤维化的交集靶点

将CCA的791个作用靶点、Sj病肝纤维化的159个作用靶点通过Venny2.1.0在线平台取交集（图1），得到CCA与Sj病肝纤维化的交集靶点共37个，即可能为CCA治疗Sj病肝纤维化的关键靶点。

图1.

成分靶点与疾病靶点交集韦恩图

Fig. 1 Venn diagram of the intersection targets between the drug components and disease.

2.3. 药物-成分-靶点-通路-疾病网络的构建

利用107个CCA的活性成分、37个CCA及Sj病肝纤维化的交集靶点，以及在DAVID数据库得到的KEGG富集分析排名靠前的20条（P<0.05）信号通路等数据制作Network文件和Type文件，再将其导入Cytoscape3.9.1软件，获得“复方积雪草-有效成分-交集靶点-通路-日本血吸虫病肝纤维化”的网络（图 2）。

图2.

药物-成分-靶点-通路-疾病网络图

Fig. 2 Drug-component-target-pathway-disease network diagram.

2.4. PPI网络

将CCA抗Sj病肝纤维化交集靶点录入String数据库，设定生物学类别为人属“Homo sapiens”。建立该交集靶点互作关系网络（图3）。CCA干预Sj病肝纤维化连接度较高的核心节点包括 TNF、MMP9、JUN、TP53等。

图3.

潜在作用靶点蛋白互作分析图

Fig. 3 Analysis of potential target protein interaction.

2.5. GO和KEGG富集分析

利用DAVID数据库进行GO富集分析，筛选出与37个交集靶点相关的前10条通路，并通过微生信在线平台绘制GO富集柱状图（图4A）。CCA的关键靶点可能在细胞外空间、胞浆等部位，通过调控RNA聚合酶II转录、蛋白质结合等生物过程，发挥对肝纤维化的作用。选择DAVID数据库中的KEGG功能，分析得到99条信号通路，采用前20条（P<0.05）的信号通路进行气泡图绘制（图4B）。结果提示，CCA治疗Sj病肝纤维化的主要通路为：Lipid and atherosclerosis、IL-17 signaling pathway、Fluid shear stress and atherosclerosis、Chagas disease、Pathways in cancer，并在其中发挥了关键的作用，通过KEGG发现TLR4、MyD88富集于以上通路，本实验针对该信号途径展开研究。

图4.

GO功能富集分析与KEGG通路富集分析

Fig. 4 GO functional enrichment analysis （A） and KEGG pathway enrichment analysis （B）.

2.6. 分子对接结果

基于“药物-成分-靶点-通路-疾病”互作网络拓扑分析及PPI网络的节点度值筛选结果，本研究选取槲皮素、山奈酚、豆甾醇3种活性小分子作为配体分子，分别与核心蛋白靶点TNF（PDB ID：6z6v）、MMP9（PDB ID：5TH6）、JUN（PDB ID：3OY1）和TP53（PDB ID：8U4U）进行分子对接研究（表1），所有配体-受体复合物的结合能均小于-5.0 kcal/mol。通过PyMOL 2.6软件对关键相互作用位点进行三维可视化分析（图5）。

表1.

分子对接得分表

Tab.1 Molecular docking score table (kcal/mol)

Active ingredient	TNF	MMP9	JUN	TP53
quercetin	-5.65	-6.55	-7.06	-5.19
Kaempferol	-5.62	-7.87	-5.39	-5.15
Stigmasterol	-9.52	-8.75	-7.88	-7.02

图5.

CCA关键成分与核心靶点分子对接可视化图

Fig. 5 Molecular docking simulation of binding between the key components and core targets of compound Centella asiatica formula. A： quercetin-JUN. B： Kaempferol-MMP-9. C： Stigmasterol-TNF. D： Stigmasterol-TP53.

2.7. 肝脏病理检查

HE染色观察显示，Control组小鼠肝组织形态正常、规则排列的肝细胞以及完整的肝小叶结构清晰可见。而Sj组小鼠肝组织均发现虫卵沉积，大量炎症细胞包绕虫卵周围，形成虫卵肉芽肿；CCA治疗后，肝组织内肉芽肿数量减少，肉芽肿周围组织较为正常。Masson染色显示，Control组小鼠肝组织内几乎未出现胶原纤维沉积，而Sj组小鼠肝组织内产生大量被染成蓝色的胶原纤维，Sj+CCA组小鼠胶原纤维沉积减少（图6）。

图6.

日本血吸虫病肝纤维化小鼠模型肝脏组织病理改变

Fig.6 Pathological changes in liver tissue of mouse models with Schistosoma japonicum-induced liver fibrosis (HE and Masson staining, scale bar=200 µm).

2.8. 免疫组化染色

与Control组相比，Sj组小鼠肝脏组织中Collagen-I和Collagen-III阳性染色区域面积占比增加（P<0.0001），纤维化进程激活；而治疗干预后，Collagen-I和Collagen-III表达强度较Sj组降低（P<0.001，P<0.01，图7）。

图7.

肝组织中I型和III型胶原表达水平的免疫组化分析

Fig.7 Immunohistochemical analysis of expression levels of type I and type III collagen mouse liver tissue （Scale bar=200 µm） and quantitative comparison among the 3 groups. **P<0.01, ***P<0.001 vs Sj, ****P<0.0001 vs control.

2.9. 炎症因子检测

ELISA分析显示，与Sj组相比，Sj+CCA组和control组中IL-6、TNF-α等炎症因子的表达水平降低（P<0.05，P<0.001，图8）。

图8.

ELASA检测CCA对Sj感染诱导肝纤维化小鼠血清中炎性因子表达水平

Fig.8 ELISA detection of serum levels of IL-6 （A） TNF-α （B） in mouse models with Schistosoma japonicum-induced liver fibrosis. *P<0.05, ***P<0.001.

2.10. CCA抑制TLR4/MYD88通路

Sj组与Control组相比，表现出较高的TLR4、MyD88蛋白水平（P<0.001，P<0.01）。Western blotting结果显示，Sj+CCA组TLR4和MyD88蛋白的表达水平低于Sj组（P<0.01，图9）。

图9.

CCA对日本血吸虫病肝纤维化炎症反应信号通路中TLR4、MyD88蛋白的影响

Fig.9 Effect of compound Centella asiatica formula on hepatic expressions of TLR4 and MyD88 proteins in mouse models of Schistosoma japonicum-induced liver fibrosis detected by Western blotting. **P<0.01, ***P<0.001.

3. 讨论

肝纤维化是慢性肝损伤发展过程中的动态病理生理学过程，是慢性肝病向肝硬化、肝癌等终末期肝病发展的关键环节^［8］。肝纤维化的转归取决于纤维增生与纤维降解之间的“净效应”，早期干预对抑制或逆转肝纤维化至关重要^［9］，然而，Sj感染引发的肝纤维化具有独特的病理特征：虫卵沉积于肝脏门脉区，形成以虫卵肉芽肿为核心的纤维化病灶。虫卵释放的特异性抗原（SEA）及其物理刺激进一步促进了肉芽肿的形成和纤维化进展。与一般肝纤维化不同，Sj性肝纤维化更多地依赖于虫卵沉积和特异性免疫反应，而非持续的肝细胞损伤和修复^［10］。目前，针对血吸虫性肝纤维化的治疗手段有限，亟需探索新的治疗策略以改善患者预后。

网络药理学分析显示，CCA的关键有效成分如槲皮素、山奈酚、豆甾醇等，具有抗炎、免疫调节等多种药理作用，其中槲皮素已被证实可通过调控NF-κB/IκBα、p38MAPK抗炎途径，有效降低促炎细胞因子TNF-α、IL-6、IL-1β、Cox-2及TGF-β的表达水平，进而发挥其保肝、抗纤维化的功效^［11］。有研究发现^［12］槲皮素可通过调节核转录因子c-fos与c-jun的表达及 AP-1DNA结合活性，抑制TGF-β1过度表达，减少HSC活化及ECM产生，从而发挥抗肝纤维化作用；山奈酚和豆甾醇也显示出对炎症介质的调节作用，山奈酚可降低脂多糖诱导的炎症介质TSLP、IL-1β、TNF-α、IL-8的产生^［13］；豆甾醇同样具有有效的抗炎活性，能够减少巨噬细胞释放TNF-α、NO、COX-2和促炎细胞因子（如IL-1β、IL-6），在不会改变巨噬细胞活力的基础上发挥抗炎活性^［14］。因此，CCA可能通过以上成分，通过减少HSC、巨噬细胞等细胞活化、ECM沉积，降低促炎介质的产生，从而发挥其治疗作用。

有研究报道TLR4/MyD88信号途径在血吸虫感染肝组织免疫炎症反应中起重要作用^［15］。在TLR4/MyD88信号通路中，TLRs通过与MyD88等接头蛋白相互作用，激活NF-κB和JAK1/STAT3等信号通路，导致促炎因子（如IL-6、IL-1β、TNF-α）的过度表达，从而加剧炎症反应和纤维化进程^［16-18］。研究表明，MyD88依赖性途径在TLR4信号传导中起关键作用^{［19， 20］}。在TLR4刺激下，MyD88募集IRAK-4并促进IRAK-1磷酸化，进而激活TAK1和IKK复合物，最终导致NF-κB的活化^{［21， 22］}。Chen等^［23］证实HSC中TLR4信号通路的激活是其激活和纤维化所必需的，而不仅仅是在Sj感染期间。LPS触发TLR4通路激活诱导内源性PGE2合成可能在HSC激活中发挥作用，因为合成PGE2会诱导LX-2细胞中α-SMA的表达。此外，研究发现^［24］Sj感染后MyD88在肝脏中的表达显著升高，且LPS刺激进一步增强了该效应。有研究显示^［25］，TLR4信号传导通过激活MyD88依赖性途径可减轻Sj感染诱导的肝纤维化。与本研究的结果一致，Sj感染显著上调了肝组织中TLR4和MyD88的蛋白表达水平，而CCA能够有效抑制这一现象。综上所述，CCA可能通过调控TLR4/MyD88信号通路，抑制下游促炎因子的释放，从而阻断Sj感染诱导的肝纤维化。

本研究通过分子对接进一步验证了CCA活性成分与TNF、MMP9、JUN、TP53的低能结合，及其可自发形成稳定态结构，从而发挥治疗Sj病肝纤维化的功效。这些靶点与炎症、细胞增殖、纤维化等过程密切相关^［26-28］。TNF激活Kupffer细胞和LPS，释放炎症介质，导致肝细胞凋亡和纤维化。同时，TNF激活HSCs，促进其转化为肌成纤维细胞，加剧纤维化^［29］。MMP9降解ECM助修复，但也激活HSCs，加重纤维化^［30］。JUN通过AP-1信号通路参与纤维化，与NF-κB协作，促进炎症因子分泌^［31］。TP53正向调节层粘连蛋白521促进的肝祖细胞增殖，促进肝脏再生修复^［32］。

Sj虫卵肉芽肿形成与细胞及体液免疫相关，细胞免疫早期起主要作用^［33］。其中IL-6和TNF-α在Sj感染引起的肝纤维化和肉芽肿形成中起重要作用。TNF-α在感染早期通过Th1 型细胞因子发挥免疫功能，随后Th2型细胞因子如IL-6逐渐升高，共同促进虫卵肉芽肿的形成和肝纤维化的进展。这些细胞因子通过调节免疫细胞的功能和趋化炎症细胞，加剧肝脏的病理变化^{［34， 35］}。在整个动物实验周期中，观察各组小鼠的整体生存状态，感染8周后，Sj组和Sj+CCA组均观察到小鼠体质量下降、毛发粗糙、活动减少等症状，部分出现了腹部膨胀和腹水。给药治疗8周后，剖杀取材，control组小鼠肝脏形态正常，颜色红润质软且光滑，而Sj组和Sj+CCA组小鼠的肝脏则可见明显的虫卵结节，Sj组的病变更为显著，肝脏组织颜色变暗，质地变硬。这表明CCA对血吸虫卵引起的肉芽肿和肝纤维化具有改善作用。由此推断，CCA可能通过作用于TNF、MMP9、JUN、TP53靶点，调控TLR4/MyD88通路，抑制IL-6、TNF-α等促炎因子释放，进而抑制减少HSC活化及胶原纤维产生，降低ECM的沉积，从而发挥抗Sj感染引起肉芽肿和肝纤维化的作用。

与现有研究相比，本研究更加深入地揭示了CCA在治疗Sj病肝纤维化中的作用机制。通过网络药理学方法，本研究发现CCA可能通过槲皮素、山奈酚、豆甾醇等作用于关键信号通路，调节炎症反应、细胞增殖等过程，从而发挥其治疗作用。这与传统药物治疗的单一靶点相比，显示出更为复杂和多样化的作用机制。本研究仍存在一些不足之处：首先，网络药理学的数据源建立在现有的研究数据之上，目前许多数据库在规模、完整性等方面存在不足，因此，利用网络药理学预测的有效成分和靶点有局限性^［36］；其次，虽然本文对CCA可能的作用机制进行了深入研究，但网络药理学预测的靶点互作网络尚未完全通过条件性基因敲除实验验证，其具体的有效成分和机制仍需进一步验证。因此，后续可利用空间转录组技术解析肝内不同区域药物响应异质性的作用机制上，为血吸虫病肝纤维化的治疗提供更为可靠的理论基础和临床应用价值。

综上所述，CCA作为经典方剂在治疗Sj病肝纤维化方面具有一定的潜力。本研究通过网络药理学方法揭示了CCA可能的作用机制，并通过体内实验加以佐证，为临床的合理应用提供理论依据及实验基础，以期为血吸虫病肝纤维化的治疗带来新的思路和方法。

基金资助

湖南省卫生健康委科研课题（202101062143）；国家级大学生创新创业训练计划项目（S202410545006）；湖南省大学生创新创业训练计划项目（S202310545023S）；湖南省普通高等学校教学改革研究项目（HNJG-2020-0932）；湖南省高校思想政治工作精品项目（21JP031）