淫羊藿苷促进胶原水凝胶三维立体培养成骨细胞的成熟分化

Abstract

Objective

To investigate the effects of icariin on the differentiation and maturation of rat calvarial osteoblasts(ROB) in collagen hydrogel three-dimensional culture.

Methods

ROB were obtained by enzyme digestion from the segregated neonatal SD rats skull and were embedded in 2 mg/mL rat tail collagen for three-dimensional culture. The growth state of ROB was observed by FDA/PI staining, HE staining and scanning electron microscopy. ROB were treated with icariin at the concentration of 1×10 ^-4, 1×10 ^-5, 1×10 ^-6 and 1×10 ^-7 mol/L respectively. The activity of alkaline phosphatase(ALP) was detected after 3, 6, 9 d of icariin treatment. Three-dimensional cultured ROB were treated with optimal concentration icariin for 12, 24, 36, 48 h and total RNA was extracted and the mRNA expressions of bone morphogenetic protein-2(BMP-2), Runt-related transcription factor 2(RUNX-2) and Osterix were detected by real time RT-PCR. The protein expression of BMP-2, RUNX-2 and Osterix were examined by Western-blotting.

Results

ROB were cultured in collagen hydrogel successfully. FDA/PI staining, HE staining, and scanning electron microscopy showed that ROB adhered with collagen tightly and distributed homogeneously. Icariin at final concentration of 1×10 ^-5, 1×10 ^-6 and 1×10 ^-7 mol/L all enhanced the activity of ALP of collagen hydrogel three-dimensional cultured ROB, and 1×10 ^-6 mol/L was the optimal concentration. Besides, icariin(1×10 ^-6 mol/L) increased mRNA and protein expression of BMP-2、RUNX-2 and Osterix compared to control group.

Conclusion

Icariin can enhance the expression of osteogenic markers of ROB in collagen hydrogel three-dimensional culture significantly.

淫羊藿苷(icariin)是一种从中草药淫羊藿中提取的黄酮苷类化合物 ^{[ 1]} ，具有促进骨形成、抑制骨吸收的活性。陈克明团队曾报道，淫羊藿苷能够促进二维培养的大鼠骨髓间充质干细胞和成骨细胞成熟矿化，抑制破骨细胞分化成熟及其骨吸收活性 ^{[ 2]} 。然而，二维培养的细胞体系与三维立体培养或动物体内的成骨相关细胞所处的环境差异较大，淫羊藿苷促进成骨细胞成熟矿化的能力在三维立体培养体系中是否仍然有效还有待研究。

三维立体培养技术是将细胞培植在一定的细胞外基质中，细胞以细胞外基质蛋白为生长的支架分化形成一定的三维组织特异性结构。胶原水凝胶作为一种富含水分的软质材料，与体内软组织材料相似并具有良好的生物相容性，细胞接种方便，是三维立体培养的主要材料之一 ^{[ 3]} 。因此，本文通过原代培养新生大鼠颅骨成骨细胞(rat calvarial osteoblast，ROB)，利用不同浓度淫羊藿苷作用于三维立体培养的成骨细胞后，通过检测其成骨性相关因子包括碱性磷酸酶、骨形态发生蛋白2(bone morphogenetic protein-2，BMP-2)、骨形成相关转录因子如Runt相关转录因子2(Runt-related transcription factor 2，RUNX-2) 和Osterix的表达量，对淫羊藿苷促进三维立体培养成骨细胞成熟分化的能力进行研究。

SPF级新生SD大鼠10只，体质量6~10 g，购自甘肃中医学院SPF级动物实验中心[许可证号SCXK(甘) 2004-0006-152]，所有动物实验均遵照国家实验动物饲养和使用指南。α-MEM培养基购自美国Gibco公司；胎牛血清购自美国HyClone公司；二甲基亚砜(DMSO)和Ⅰ型鼠尾胶原购自美国BD公司；淫羊藿苷购自中国药品生物制品检定所；胰酶、伊红、苏木素、碘化丙啶(PI)和双乙酸荧光素(FDA)购自北京Salarbio公司；碱性磷酸酶测定试剂盒购自中国南京建成生物工程研究所；RNAiso Reagent、逆转录试剂盒、Taq DNA聚合酶、Easy Dilution稀释液购自日本Takara公司；引物由Takara公司设计合成；BMP-2、RUNX-2和Osterix抗体均购自英国Abcam公司；β-actin抗体购自美国Bioworld公司；辣根过氧化物酶(HRP)标记的山羊抗兔IgG(H+L)购自中国北京中杉金桥公司。主要仪器有荧光显微镜(日本OLYMPUS公司)，二氧化碳培养箱和JSM-5600LV低真空扫描电子显微镜X射线能量色散谱仪(美国Thermo Revco公司)，台式高速冷冻离心机(德国Heraeus公司)，紫外分光光度计、酶标仪、电泳仪和电转移仪(美国Bio-Rad公司)，实时荧光定量PCR仪(美国ABI公司)。

将新生大鼠置于75%乙醇溶液中浸泡处死，在无菌条件下取其颅骨并去除骨膜及结缔组织，用pH值7.8的磷酸盐缓冲液(PBS)清洗3次；将骨片剪碎(大小约1 mm×1 mm×1 mm)，转移至培养瓶中，0.25%胰酶消化2次(37 ℃，每次10 min)，弃上清液，0.1%的Ⅱ型胶原酶消化10 min，弃上清液；再用0.1%的Ⅱ型胶原酶消化4次(37 ℃，每次20 min)，收集合并上清液，加入5 mL含血清的培养基终止酶消化，150目滤网过滤3次，98× g离心10 min；弃上清液，加入含10%胎牛血清的α-MEM培养基(含青霉素100 U/mL和链霉素100 μg/mL)，吹打均匀并计数。原代细胞悬液以3×10 ⁵/mL接种于9 cm培养皿中，每皿10 mL，置于37 ℃、5%二氧化碳饱和湿度的培养箱中培养，每3天换液1次，培养至细胞铺满80%皿底后，胰酶消化传代。

采用开放式单层贴壁培养，ROB培养于含10%胎牛血清的α-MEM培养液中，置于37 ℃、5%二氧化碳饱和湿度的培养箱中培养，3 d更换1次培养液，至细胞铺满80%皿底后用胰酶进行消化，离心收集细胞，重悬于细胞液中，并放置于冰浴中。参考王敏等 ^{[ 4]} 的配制方法并进行改进，以配置2 mg/mL三维水凝胶1 mL为例，将400 μL胶原蛋白(5 mg/mL)加到24 μL 0.1 mol/L氢氧化钠溶液中，立即混匀。再加入23 μL 10×PBS，混匀(混匀后pH值7左右)。加入453 μL细胞悬浮液，细胞密度达到1×10 ⁶/mL时混匀后立即加入48孔培养板中，室温下放置30 min待胶凝固后，加入1 mL的细胞培养液，置于细胞培养箱中培养，每天换液1次。

按照上述ROB三维立体培养方法，将浓度为2 mg/mL胶原与细胞混合。在一定的条件下形成胶原与细胞的复合物，待细胞培养2 d后，倒置显微镜下观察细胞生长状态。将2 mg/mL胶原水凝胶包埋的ROB复合物培养6 d，PBS冲洗3次，置于4%多聚甲醛中固定，常规石蜡包埋切片后，并进行苏木素-伊红(HE)染色。染色步骤如下：将切片于二甲苯中脱蜡，于高浓度至低浓度乙醇溶液中依次脱水，蒸馏水中清洗后，移入苏木素溶液中浸染15 min。使用蒸馏水洗去苏木素及浮色后移入1%盐酸酒精分化液中10 s，切片褪色至淡蓝红色即可。流水冲洗30 min后进行伊红染色3 min，组织呈天蓝色。分别经乙醇脱水、二甲苯透明后，用中性树胶封片，晾干后显微镜下观察。

ROB培养6 d后，PBS冲洗3次，加入浓度为2 μmol/L FDA和4 μmol PI的混合液，室温下避光孵育35 min。活细胞被FDA染为绿色，死亡细胞被PI染为红色，立即行共聚焦显微镜观察。

将2 mg/mL胶原水凝胶包埋的ROB复合物培养6 d，PBS冲洗3次，2.5%的戊二醛固定30 min，1%锇酸固定30 min，再用乙醇梯度脱水，最后乙酸异戊酯置换4 h以上，二氧化碳临界干燥器干燥，真空喷溅铂金离子后，在扫描电镜下观察细胞生长及分布情况。

将2 mg/mL胶原水凝胶包埋的ROB复合物接种于96孔板，淫羊藿苷干预组分别加入终浓度为1×10 ^-4、1×10 ^-5、1×10 ^-6和1×10 ^-7mol/L的淫羊藿苷，对照组加0.1% DMSO，培养第3、6、9 d进行碱性磷酸酶活性测定，将碱性磷酸酶活性最高者确定为淫羊藿苷的最佳浓度，后续实验皆采用此浓度。碱性磷酸酶测定具体方法为：弃去培养液，PBS洗2次，每孔加入缓冲液和基质液各0.5 mL混匀，37 ℃水浴15 min，加入1.5 mL显色液，显色后在紫外分光光度计测定波长507 nm处吸光度值，用酚标准作标准对照并将检测值换算为金氏单位。

2 mg/mL胶原水凝胶包埋的ROB复合物接种于12孔板，培养48 h后进行药物处理。药物处理12、24、36、48 h后，Trizol提取细胞总RNA，紫外分光光度计检测浓度，并用1%甲醛变性琼脂糖电泳检测RNA完整性。调整总RNA的浓度至50 mg/L，取4 μL将其逆转录为cDNA(40 μL体系)，逆转录体系PCR扩增体系及反应条件均参照说明书设定。PCR引物序列如下：BMP-2上游引物：5′-ACCGTGCTCAGCTTCCATCA-3′，下游引物：5′-TTCCTGCATTTGTTCCCGAAA-3′；RUNX-2上游引物：5′-GCACCCAGCCCATAATAGA-3′，下游引物：5′-TTGGAGCAAGGAGAACCC-3′；Osterix上游引物：5′-GCCTACTTACCCGTCTGACTTT-3′，下游引物：5′-GCCCACTATTGCCAACTGC-3′；GAPDH上游引物：5′-TATCGGACGCCTGGTTAC-3′，下游引物：5′-CTGTGCCGTTGAACTTGC-3′。PCR扩增：以标本中所提取的高浓度RNA逆转录所得到的cDNA作为标准品，经等比稀释之后，分别利用BMP-2、RUNX-2、Osterix引物进行PCR反应，制备标准曲线，经内参GAPDH校正，分别求得目的基因的相对表达量。实时定量PCR数据分析采用ΔΔCt法，数据结果采用2 ^-ΔΔCt表示(ΔΔCt=药物组ΔCt-对照组ΔCt，ΔCt=目的基因Ct-GAPDH基因Ct)。

将上述相同处理的细胞用4 ℃预冷的PBS漂洗2次后，加入500 μL的细胞裂解液于冰上静置30 min使细胞充分裂解。4 ℃ 14 000× g离心15 min，取上清液，用BCA法进行总蛋白浓度的测定。95 ℃变性4 min，各组取含20 μg蛋白质样品，经12%十二烷基硫酸钠—聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分离后，将蛋白质转移至PVDF膜上，5%脱脂奶粉室温下摇床振荡封闭2 h，然后分别加入β-actin、BMP-2、RUNX-2、Osterix多克隆抗体(均为1:1 000稀释)，4 ℃过夜。次日加入HRP标记山羊抗兔IgG(H+L)(1:100 000稀释) 37 ℃孵育2 h。每进行下一步实验前均用4 ℃预冷的PBST漂洗PVDF膜4次，每次8 min。用增强化学发光法检测目的蛋白，X线摄片的曝光时间视实验效果而定，灰度值使用Image-Pro plus 6.0软件扫描测定。

采用SPSS 17.0软件处理数据，实验结果均以均数±标准差( x ± s)表示。进行方差齐性检验，方差齐者采用LSD- t检验，方差不齐者采用Tamhane's检验。 P < 0.05为差异有统计学意义。

将2 mg/mL胶原水凝胶包埋的ROB复合物培养2 d后，光学显微镜观察发现细胞呈多层分布，并在胶原水凝胶完全伸展，保持原有的长梭状形态( 图 1A)。将培养6 d的胶原水凝胶包埋的ROB复合物进行FDA/PI染色发现，凝胶中超过90%的细胞被染成绿色，而仅有少部分被染成红色，说明细胞的生长状态良好( 图 1B)。扫描电镜观察可知，胶原水凝胶包埋的ROB复合物通过突触依附于胶原材料，细胞与材料融合良好( 图 1C)。HE染色结果显示，ROB在胶原水凝胶材料中分布均匀、细胞密度较高，适宜进行药物处理( 图 1D)。提示ROB在三维立体培养体系中生长状态良好。

三维立体培养第3、6、9天进行ROB碱性磷酸酶活性测定，结果发现，除1×10 ^-4 mol/L组外，其余各组ROB的碱性磷酸酶活性均高于对照组，差异有统计学意义(均 P < 0.05)，其中以1×10 ^-6 mol/L组ROB的碱性磷酸酶活性最高，故后续实验皆采用此浓度( 图 2)。提示淫羊藿苷可以提高三维立体培养ROB的碱性磷酸酶活性。

1×10 ^-6 mol/L淫羊藿苷处理三维立体培养ROB 36、48 h后，BMP-2 mRNA表达量均多于对照组(均 P < 0.01)，其中36 h表达量更多；淫羊藿苷作用于ROB 48 h后，RUNX-2 mRNA的表达量多于对照组( P < 0.01)；淫羊藿苷作用于ROB 36 h后，Osterix mRNA的表达量也多于对照组( P < 0.01)，见 图 3。提示1×10 ^-6 mol/L淫羊藿苷可以增加三维立体培养ROB的成骨性相关因子BMP-2、RUNX-2和Osterix mRNA的表达。

1×10 ^-6 mol/L淫羊藿苷作用于ROB 24、36、48 h后，BMP-2蛋白表达量均多于对照组(均 P < 0.05)；淫羊藿苷作用于ROB 48 h后RUNX-2蛋白表达量多于对照组( P < 0.05)；淫羊藿苷作用于ROB 12、24、36 h后，Osterix蛋白的表达量也多于对照组(均 P < 0.01)，见 图 4。提示1×10 ^-6 mol/L淫羊藿苷可以提高三维立体培养ROB的成骨性相关因子BMP-2、RUNX-2和Osterix蛋白的表达。

骨质疏松症是一种骨量减少、骨密度降低、骨微结构退化、骨脆性增加的全身性骨骼疾病，是全球四大非传染性致死疾病之一 ^{[ 5, 6]} 。而目前治疗骨质疏松症的药物如雌激素类和双磷酸盐类药物，具有引起癌症、中风、心血管疾病、血栓形成等毒副作用，因此越来越多的研究者开始寻找新的骨质疏松症预防和治疗的替代药物 ^{[ 7, 8]} 。中草药淫羊藿具有“补肾壮阳、强筋健骨”等功效，淫羊藿苷是淫羊藿的最主要有效多糖类成分，能够促进大鼠间充质干细胞成骨性分化、成熟，促进成骨细胞的矿化，并能够抑制骨组织的骨吸收活性 ^{[ 9, 10]} 。目前筛选淫羊藿苷等抗骨质疏松症药物多以二维培养的成骨细胞为主，二维培养的成骨细胞在生长环境、细胞状态等方面与动物体内成骨细胞有很大的区别，在二维培养成骨细胞中筛选的药物浓度及其作用机制研究在动物体内往往不适用。药物动物实验因为周期太长、成本高、干扰因素太多，不利于进行药物机制研究，而成骨细胞三维立体培养能较好地解决上述问题。本研究利用鼠尾胶原水凝胶建立ROB三维立体培养模型，并通过淫羊藿苷进行干预，探讨淫羊藿苷对立体培养的ROB促骨形成活性作用。以三维立体培养成骨细胞来研究淫羊藿苷促骨形成三维活性具有以下优点：① 与二维培养成骨细胞比较，三维立体培养成骨细胞更接近于动物体内成骨细胞的状态，使得药物活性及其机制研究更加真实可靠；② 与动物实验比较，三维立体培养模型成本低，实验周期短，实验干扰因素少；③ 研究表明，三维立体培养的成骨细胞各项成骨性指标的表达量明显高于二维培养，导致三维立体培养成骨细胞对淫羊藿苷促进骨形成等药物的敏感性增加。

本研究根据ROB中碱性磷酸酶活性筛选出1×10 ^-6mol/L淫羊藿苷作为最佳干预浓度，该浓度的淫羊藿苷可以促进一系列成骨相关指标的表达。BMP-2是成骨细胞分化过程中极为重要的转录因子，它在ROB的分化过程中起着关键作用，体内和体外实验都证明BMP-2有促进成骨细胞分化和诱导体外成骨的能力，本研究结果表明淫羊藿苷可显著增加成骨细胞BMP-2的表达。成骨细胞中RUNX-2表达减少，可使成骨细胞标志物Ⅰ型胶原、碱性磷酸酶和骨钙素等的表达减少，并阻断成骨过程 ^{[ 11]} 。本研究结果表明淫羊藿苷可促进成骨细胞RUNX-2的表达。Osterix是骨形成过程中必需的转录因子，其基因突变或缺失可导致骨发育延迟或停止 ^{[ 12]} 。RUNX-2与Osterix也有一定的联系，Osterix的表达离不开RUNX-2的存在，是其表达所必需的因子 ^{[ 13]} 。本研究结果表明淫羊藿苷可显著提高成骨细胞Osterix的表达。

综上所述，本研究建立ROB三维立体培养模型，并用淫羊藿苷进行干预，通过检测成骨性相关因子的表达量，从而证明了淫羊藿苷具有显著促进三维立体培养的成骨细胞成骨性分化的能力，表明该中药单体具有开发为抗骨质疏松或促进骨折愈合治疗药物的潜力。

Funding Statement

国家自然科学基金(81270963, 81471090)