积雪草酸通过调控TNF-α/Mfn2通路改善2型糖尿病β细胞胰岛素分泌功能

Abstract

目的

研究积雪草酸改善2型糖尿病β细胞功能的作用及分子机制。

方法

利用高脂饲料和链脲佐菌素构建2型糖尿病小鼠模型，评估不同浓度积雪草酸对2型糖尿病小鼠血糖调节作用，筛选积雪草酸最佳治疗浓度。体外采用棕榈酸处理小鼠胰岛构建2型糖尿病胰岛模型。针对积雪草酸处理后体内、外胰岛模型，利用酶联免疫吸附试验检测胰岛β细胞葡萄糖刺激的胰岛素分泌（GSIS）功能、胰岛内肿瘤坏死因子（TNF）α、白介素（IL）6含量，紫外分光光度法检测胰岛内腺苷三磷酸（ATP）含量，蛋白质印迹法检测胰岛β细胞成熟标志蛋白尿皮质素（Ucn）3及线粒体融合蛋白（Mfn）2表达变化。采用小干扰RNA干扰Mfn2或加用TNF-α处理胰岛后，考察积雪草酸对Ucn3表达及GSIS功能的调控作用。

结果

体内实验显示，25 mg·kg^－1·d^－1积雪草酸具有较好的降糖效果，并改善稳态模型评价β细胞指数。积雪草酸可增加Mfn2和Ucn3蛋白表达，改善体内、外糖尿病模型β细胞GSIS功能（均P<0.05）。体外实验显示，积雪草酸可改善2型糖尿病胰岛ATP生成量（P<0.05）；干扰Mfn2阻断积雪草酸对Ucn3和GSIS的上调作用。积雪草酸可抑制糖尿病胰岛TNF-α生成（P<0.05），逆转TNF-α所导致的Mfn2及Ucn3蛋白表达下调。

结论

积雪草酸能改善2型糖尿病β细胞胰岛素分泌功能，其机制可能与调控TNF-α/Mfn2通路维持β细胞成熟有关。

2型糖尿病是常见的内分泌代谢紊乱疾病，往往伴有多种致命性并发症。全球约有4.22亿人患有糖尿病，其中95%为2型糖尿病，严重危害人类健康。胰岛β细胞功能损害与胰岛素抵抗是2型糖尿病的主要发病因素，其中β细胞GSIS功能不全是2型糖尿病的重要发病特征^［1］，因此寻找合适的药物用以恢复胰岛β细胞正常GSIS功能可为2型糖尿病治疗提供新的手段。

2型糖尿病常伴有胰岛炎症微环境产生，是导致β细胞功能障碍的重要原因^［2-4］。现代药理学研究表明积雪草酸具有强大的抗炎作用^［5］。近年研究发现，积雪草酸可降低2型糖尿病大鼠血糖^［6］，是潜在的2型糖尿病治疗药物。积雪草酸可减少糖尿病大鼠胰岛纤维化^［7］，但对β细胞炎症微环境、GSIS功能的影响以及相关机制尚不明确。

炎症信号可破坏β细胞线粒体功能^［8］，而线粒体功能完整是β细胞胰岛素分泌的基础。β细胞中葡萄糖经线粒体有氧代谢产生ATP，促进胰岛素释放。Mfn2调节线粒体融合，维持线粒体功能完整，与人类疾病密切相关^［9-10］。此外，本团队前期研究发现Mfn2能促进胚胎干细胞体外分化为成熟的β细胞，表现为Ucn3蛋白表达上调且分化β细胞具有正常GSIS功能^［11］，并维持成熟小鼠胰岛β细胞正常胰岛素功能^［12］。本研究通过建立体内和体外2型糖尿病模型，研究积雪草酸对β细胞特征及功能调节作用，探索炎症信号和Mfn2在积雪草酸保护β细胞中的作用。

1. 材料与方法

1.1. 实验动物、细胞、试剂与仪器

ICR小鼠购自杭州医学院［许可证号SCXK（浙）2019-0002］，饲养于12 h光照/12 h无光照、24~26 ℃环境，可自由进食及饮水。动物实验研究方案通过浙江大学医学院附属第一医院伦理委员会审查（2019-827）。

积雪草酸、棕榈酸、链脲佐菌素、胶原酶V、Histopaque-1077、Histopaque-1119、TNF-α、DAPI为Sigma-Aldrich公司产品；二甲双胍为中美上海施贵宝公司产品（国药准字H20023370）；Hank’s液、PBS、ATP含量检测试剂盒、葡萄糖含量测定试剂盒为北京索莱宝科技有限公司产品；葡萄糖粉、羧甲基纤维素钠为上海阿拉丁生化科技股份有限公司产品；KRBH缓冲液为上海源叶生物科技有限公司产品；小鼠胰岛素ELISA试剂盒为美国Merck Millipore公司产品；小鼠TNF-α ELISA检测试剂盒、小鼠IL-6 ELISA检测试剂盒为上海酶联生物科技有限公司产品；抗Mfn2抗体为英国Abcam公司产品；抗Ucn3抗体为美国Santa Cruz公司产品；抗GAPDH抗体、抗β-actin抗体为美国Jackson Immuno Research公司产品；HRP二抗为杭州联科生物技术有限公司产品；RIPA裂解液、SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳凝胶超快速配制试剂盒、BCA蛋白浓度测定试剂盒为上海碧云天生物技术有限公司产品；ECL试剂盒为美国Affinity Biosciences公司产品；RPMI 1640培养液、胎牛血清为美国Gibco公司产品；Lipofectamine RNAiMax转染试剂为美国Invitrogen公司产品；荧光二抗Alexa Fluor 488为武汉三鹰生物技术有限公司产品；siRNA序列为上海吉玛制药技术有限公司产品。血糖测试仪与检测试纸为三诺生物传感股份有限公司产品；电泳转膜系统、凝胶成像系统为美国Bio-Rad公司产品；酶标仪为美国BioTek公司产品；荧光显微镜为德国Leica公司产品。

1.2. 实验动物建模、分组和干预

5周龄雄性ICR小鼠正常饲料适应性喂养1周后，给予脂肪含量为45%的高脂饲料喂养3周，小鼠禁食过夜后以40 mg/kg腹腔注射一剂链脲佐菌素，继续给予高脂饮食1周。小鼠空腹血糖值在11.1 mmol/L及以上时视为造模成功。造模后小鼠按随机数字表法平均分为模型对照组、积雪草酸小剂量组、积雪草酸中剂量组、积雪草酸大剂量组、二甲双胍组，未造模小鼠为正常对照组，每组8只。积雪草酸溶于羧甲基纤维素钠制备为混悬液灌胃给药。积雪草酸小、中、大剂量组分别给予10、25、50 mg·kg^－1·d^－1积雪草酸混悬液灌胃，二甲双胍组给予200 mg·kg^－1·d^－1二甲双胍灌胃，模型对照组和正常对照组给予等量溶剂灌胃。

1.3. 血液标本采集与检测

正常对照组、模型对照组、积雪草酸各剂量组、二甲双胍组给药第7、14、21、28天时空腹采血。血糖仪检测小鼠空腹血糖，小鼠胰岛素ELISA试剂盒检测基础胰岛素水平。第28天各组小鼠检测空腹血糖后腹腔注射2 g/kg葡萄糖，分别于30、60、90、120 min采血检测葡萄糖水平，评估葡萄糖耐量。计算HOMA-β值以评估β细胞功能：HOMA-β=20×空腹胰岛素（μU/mL）/［空腹血糖（mmol/L）－3.5］×100%。

1.4. 胰岛分离

正常对照组、模型对照组、积雪草酸组麻醉后用乙醇全身消毒，于下腹部中线向上剪开至剑突，暴露腹腔中胆总管和胰管。迅速将小鼠置于解剖镜下，经胆总管内插入头皮针后固定，灌注预冷的胶原酶V溶液使胰腺膨胀，摘取胰腺移入预置胶原酶V溶液的消化管中，37 ℃水浴消化至组织呈散沙状。在消化后的胰腺悬液中加入Hank’s液终止消化，离心洗涤两次后，分别加入Histopaque-1119、Histopaque-1077、Hank’s液，梯度分离胰岛，收取上清液洗涤三遍，获得胰岛用于后续分析。

1.5. 胰岛细胞分离、分组和干预

取正常小鼠分离所得胰岛，采用含20%胎牛血清、100 U/mL青-链霉素的1640培养液，置于37 ℃、5%二氧化碳培养箱内培养。

为评估积雪草酸对体外糖尿病胰岛的保护作用，将体外胰岛随机分为正常对照组、模型对照组、积雪草酸组。模型对照组采用0.5 mmol/L棕榈酸处理24 h，积雪草酸组采用0.5 mmol/L 棕榈酸与0.1 mmol/L积雪草酸共孵育24 h，正常对照组采用溶剂处理。

为评估Mfn2在积雪草酸保护糖尿病胰岛细胞中的作用，将体外胰岛随机分为Mfn2干扰组和积雪草酸+Mfn2干扰组。Mfn2干扰序列如下：5$\mathrm{´}$-UCCUCAAGGUUUAUAAGAATT-3$\mathrm{´}$、5$\mathrm{´}$-UUCUUAUAAACCUUGAGGACA-3$\mathrm{´}$ ^［12］。各取50 μL不含血清的无双抗培养液加入50 pmol siRNA和3 μL Lipofectamine RNAiMax混匀。将上述溶液加入板中，用不含血清的无双抗1640培养液培养，12 h后换为不含siRNA的全培养液继续培养。Mfn2干扰24 h后，Mfn2干扰组加入0.5 mmol/L棕榈酸处理24 h，积雪草酸+Mfn2干扰组加入0.5 mmol/L棕榈酸与0.1 mmol/L积雪草酸共孵育24 h。

为评估TNF-α在积雪草酸调控Mfn2、保护胰岛中作用，将体外胰岛随机分为正常对照组、TNF-α组和积雪草酸+TNF-α组。TNF-α组采用10 ng/mL TNF-α处理24 h，积雪草酸+TNF-α组采用0.1 mmol/L积雪草酸与10 ng/mL TNF-α共孵育24 h，正常对照组给予溶剂。

1.6. ELISA法检测胰岛GSIS功能

取体内、外模型不同分组中直径约150 μm的胰岛，30个为一组，用含葡萄糖2.5 mmol/L的KRBH缓冲液37 ℃预孵育60 min后，撤去KRBH缓冲液，用不同浓度葡萄糖溶液（16.7、5.5 mmol/L）处理1 h，收集上清液，用小鼠胰岛素ELISA试剂盒检测胰岛素分泌量。

1.7. 免疫荧光法检测胰岛Ucn3表达

取体内实验正常对照组、模型对照组、积雪草酸组（25 mg·kg^－1·d^－1）小鼠胰腺进行冰冻切片，采用含10%胎牛血清的PBS室温封闭1 h，加Ucn3一抗（1∶200）4 ℃孵育过夜。PBS清洗三次，加入荧光二抗Alexa Fluor 488（1∶400）避光孵育2 h，PBS清洗三遍。加入DAPI孵育1 min后用PBS清洗，荧光显微镜下观察，记录结果。

1.8. 蛋白印迹法检测胰岛Ucn3、Mfn2表达

取体内及体外模型不同分组胰岛经RIPA裂解液裂解后提取蛋白，采用BCA法测定蛋白浓度。取20 μg蛋白上样，经8%~10% SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳分离蛋白、转膜、封闭，分别以Ucn3抗体（1∶500）、Mfn2抗体（1∶500）、GAPDH抗体（1∶10 000）、β-actin抗体（1∶10 000）4 ℃孵育过夜，TPBS清洗三次，以HRP二抗（1∶5000）室温孵育2 h，TPBS清洗三次，采用化学发光法显色，成像分析仪显影。采用ImageJ软件进行灰度值分析。

1.9. 紫外分光光度法检测胰岛ATP含量

获取体外实验正常对照组、模型对照组、积雪草酸组直径约为150 μm的胰岛，100个为一组，2.5 mmol/L葡萄糖溶液孵育1 h，加入ATP试剂盒裂解液裂解细胞，根据试剂盒操作流程进行检测，最终由标准曲线计算ATP的产量。

1.10. ELISA法检测胰岛炎症因子TNF-α、IL-6水平

获取体内、体外实验正常对照组、模型对照组、积雪草酸组直径约为150 μm的胰岛，50个为一组，胰岛标本根据ELISA试剂要求处理，分别检测细胞TNF-α、IL-6的分泌量。RIPA裂解液裂解胰岛细胞，BCA法检测每组胰岛细胞蛋白含量。

1.11. 统计学方法

采用GraphPad Prism 9.0软件对实验数据进行统计分析。正态分布的计量数据以均数±标准差（$\overline{x}\pm s$）表示，所有体外实验至少重复三次，每次独立实验选取胰岛来源于不同小鼠。采用t检验、单因素方差分析或双因素方差分析进行差异比较，P<0.05为差异有统计学意义。

2. 结 果

2.1. 积雪草酸降低糖尿病模型鼠血糖并改善HOMA-β指数

不同浓度积雪草酸治疗4周后，糖尿病模型鼠空腹血糖逐渐降低，其中积雪草酸中剂量组空腹血糖［（8.51±1.08）mmol/L］下降最为显著，较模型对照组［（20.13±1.85）mmol/L］下降42.3%（P<0.01），与二甲双胍组［（7.09±1.32）mmol/L］差异无统计学意义（P>0.05），见图1A。不同剂量积雪草酸治疗均可使糖尿病模型鼠各时间点血糖下降（均P<0.01），见图1B；葡萄糖耐量时间-血糖曲线下面积均明显减小（均P<0.01），见表1。与空腹血糖结果相似，积雪草酸中剂量组葡萄糖耐量改善最为明显。此外，与模型对照组比较，积雪草酸中剂量组HOMA-β值明显升高（P<0.01），见表1。上述结果提示，25 mg·kg^－1·d^－1积雪草酸降血糖作用最佳，且可改善2型糖尿病胰岛β细胞功能，因此采用该剂量进行后续实验。

图1. 不同剂量积雪草酸对糖尿病模型鼠血糖的影响（n=8）.

A：不同浓度积雪草酸对糖尿病模型鼠空腹血糖的影响；B：不同浓度积雪草酸对糖尿病模型鼠葡萄糖耐量的影响.与模型对照组比较，^**P<0.01；与正常对照组比较，^#P<0.05，^##P<0.01.

表1.

各组葡萄糖耐量和HOMA-β值比较

组 别	n	时间-血糖曲线下面积	HOMA-β值
正常对照组	8	893±35	113.4±17.7
模型对照组	8	3418±109##	15.3±1.4##
积雪草酸小剂量组	8	2705±283 **##	39.1±12.4##
积雪草酸中剂量组	8	1397±198**##	21.9±4.1**##
积雪草酸大剂量组	8	1701±235**##	9.6±1.5##
二甲双胍组	8	1186±156**#	37.8±8.2**##

与模型对照组比较，^**P<0.01；与正常对照组比较，^#P<0.05，^##P<0.01. HOMA-β：稳态模型评价β细胞指数.

$\overline{x}\pm s$

2.2. 积雪草酸改善糖尿病模型胰岛β细胞GSIS功能

ELISA结果显示，正常对照组胰岛在高、低浓度葡萄糖刺激下胰岛素分泌差异有统计学意义（P<0.01）；模型对照组胰岛在葡萄糖刺激后胰岛素分泌减少（均P<0.05），且不同浓度葡萄糖刺激后差异无统计学意义（P>0.05）；积雪草酸组在25 mg·kg^－1·d^－1积雪草酸治疗28 d后或体外积雪草酸孵育后，小鼠胰岛在葡萄糖刺激后胰岛素分泌量有所增加（均P<0.05），且不同浓度葡萄糖刺激后差异有统计学意义（P<0.01）。见表2。结果提示，积雪草酸可有效增加2型糖尿病小鼠体内胰岛β细胞葡萄糖反应性，改善体内、体外糖尿病模型胰岛β细胞GSIS功能。

表2.

各组胰岛β细胞葡萄糖刺激后胰岛素分泌量比较

组 别	体内实验			体外实验
	n	16.7 mmol/L葡萄糖	5.5 mmol/L葡萄糖	n	16.7 mmol/L葡萄糖	5.5 mmol/L葡萄糖
正常对照组	6	1.54±0.11**	0.69±0.07*##	3	1.57±0.10**	0.75±0.01*##
模型对照组	6	0.38±0.16	0.25±0.05	3	0.63±0.11	0.39±0.07
积雪草酸组	6	1.21±0.12**	0.43±0.06*##	3	1.26±0.30**	0.67±0.03*##

与模型对照组比较，^*P<0.05，^**P<0.01；与16.7 mmol/L葡萄糖组比较，^##P<0.01.

$\overline{x}\pm s$，ng·islet^－1·mL^－1·h^－1

2.3. 积雪草酸维持糖尿病模型胰岛β细胞成熟度

免疫荧光结果显示，与正常对照组比较，模型对照组成熟β细胞标志蛋白Ucn3阳性表达区域减少，而积雪草酸处理后胰岛Ucn3阳性表达区域增多（图2）。蛋白质印迹法检测结果显示，与正常对照组比较，模型对照组胰岛Ucn3表达量减少（均P<0.01），而积雪草酸处理后胰岛Ucn3表达量增加（均P<0.01），见图3和表3。结果提示，积雪草酸可增加体内、体外糖尿病胰岛β细胞中Ucn3表达，维持β细胞成熟度。

图2. 体内实验各组胰岛中Ucn3表达情况（免疫荧光法）.

白色虚线圈内为胰岛. 绿色荧光Ucn3在正常对照组胰岛中高表达，在模型对照组中绿色荧光区域减少，而积雪草酸组Ucn3绿色荧光区域较模型对照组增加. 标尺=50 μm. Ucn：尿皮质素；DAPI：4$\mathrm{´}$，6-二脒基-2-苯基吲哚.

图3. 各组胰岛Ucn3蛋白表达电泳图.

A：体内实验；B：体外实验. Ucn：尿皮质素；GAPDH：甘油醛-3-磷酸脱氢酶.

表3.

各组Ucn3蛋白相对表达量比较

组 别	n	体内实验	体外实验
正常对照组	3	1.00±0.00**	1.00±0.00**
模型对照组	3	0.26±0.04	0.38±0.10
积雪草酸组	3	0.55±0.08**	0.81±0.16**

与模型对照组比较，^**P<0.01. Ucn：尿皮质素.

$\overline{x}\pm s$

2.4. 积雪草酸通过Mfn2保护胰岛β细胞GSIS功能及成熟，改善线粒体功能

蛋白质印迹法结果显示，在体内和体外实验中，与正常对照组比较，模型对照组Mfn2蛋白表达均下降（均P<0.01），而25 mg·kg^－1·d^－1积雪草酸治疗或体外积雪草酸处理可增加Mfn2表达（均P<0.01），见图4和表4。进一步实验发现，与Mfn2干扰组比较，积雪草酸+Mfn2干扰组Ucn3蛋白表达无显著变化（P>0.05），见图5和表5。与此同时，干扰Mfn2后，无论在高、低浓度葡萄糖刺激下，积雪草酸均不增加糖尿病胰岛β细胞胰岛素分泌量（均P>0.05），见表5，提示积雪草酸无法改善Mfn2干扰后胰岛GSIS功能损伤。

图4. 各组胰岛Mfn2蛋白表达电泳图.

A：体内实验；B：体外实验. Mfn：线粒体融合蛋白.

表4.

各组Mfn2蛋白相对表达量比较

组 别	n	体内实验	体外实验
正常对照组	3	1.00±0.00**	1.00±0.00**
模型对照组	3	0.48±0.17	0.57±0.07
积雪草酸组	3	0.85±0.06**	1.02±0.06**

与模型对照组比较，^**P<0.01. Mfn：线粒体融合蛋白.

$\overline{x}\pm s$

图5. Mfn2干扰后各组胰岛Ucn3蛋白表达电泳图.

Mfn：线粒体融合蛋白；Ucn：尿皮质素.

表5.

Mfn2干扰后各组胰岛Ucn3蛋白表达量及β细胞GSIS功能比较

组 别	n	Ucn3相对 表达量	胰岛素分泌量（ng·islet－1·mL－1·h－1）
			16.7 mmol/L葡萄糖	5.5 mmol/L葡萄糖
Mfn2干扰组	3	1.00±0.00	0.51±0.01	0.48±0.06
积雪草酸+Mfn2干扰组	3	1.05±0.07	0.65±0.07	0.58±0.05

Mfn：线粒体融合蛋白；Ucn：尿皮质素；GSIS：葡萄糖刺激的胰岛素分泌.

$\overline{x}\pm s$

紫外分光光度法检测结果显示，与正常对照组胰岛ATP生成量［（7.40±2.31）pmol/个胰岛］比较，模型对照组显著下降［（4.95±0.62）pmol/个胰岛，P<0.05］，而体外积雪草酸处理可改善ATP生成［（7.19±0.95）pmol/个胰岛，P<0.05］。

结果提示，积雪草酸经由Mfn2保护胰岛β细胞GSIS功能及成熟，改善线粒体功能。

2.5. 积雪草酸通过抑制胰岛炎症因子释放改善Mfn2和Ucn3表达

ELISA结果显示，与正常对照组比较，模型对照组胰岛中TNF-α和IL-6等炎症因子表达量有不同程度增加；积雪草酸组TNF-α表达量较模型对照组显著减少（均P<0.05），IL-6表达量与模型对照组差异无统计学意义（均P>0.05）。见表6。结果提示，积雪草酸可抑制2型糖尿病胰岛TNF-α生成。

表6.

各组胰岛TNF-α、IL-6含量比较

组 别	体内实验			体外实验
	n	TNF-α	IL-6	n	TNF-α	IL-6
正常对照组	6	5.10±1.04**	3.26±0.83	3	2.92±0.59**	1.65±0.37**
模型对照组	6	8.74±2.18	4.06±0.78	3	12.03±3.24	6.19±1.05
积雪草酸组	6	6.69±1.74*	3.84±0.64	3	4.72±0.84**	4.86±0.29

与模型对照组比较，^*P<0.05，^**P<0.01. TNF：肿瘤坏死因子；IL：白介素.

$\overline{x}\pm s$，pg/mg组织

进一步实验发现，与正常对照组比较，TNF-α组胰岛Mfn2和Ucn3蛋白表达减少（均P<0.05），而积雪草酸+TNF-α组Mfn2和Ucn3蛋白表达较TNF-α组增加（均P<0.05），见图6和表7。结果提示，积雪草酸可改善TNF-α对胰岛Mfn2和Ucn3的抑制作用。

图6. TNF-α与积雪草酸处理后各组胰岛Mfn2和Ucn3蛋白表达电泳图.

TNF：肿瘤坏死因子；Mfn：线粒体融合蛋白；Ucn：尿皮质素.

表7.

TNF-α与积雪草酸处理后各组Mfn2和Ucn3蛋白相对表达量比较

组 别	n	Mfn2	Ucn3
正常对照组	3	1.00±0.00**	1.00±0.00*
TNF-α组	3	0.43±0.14	0.66±0.15
积雪草酸+TNF-α组	3	0.74±0.08*	0.91±0.10*

与TNF-α组比较，^*P<0.05，^**P<0.01. TNF：肿瘤坏死因子；Mfn：线粒体融合蛋白；Ucn：尿皮质素.

$\overline{x}\pm s$

以上实验结果提示，积雪草酸可通过抑制胰岛炎症因子TNF-α释放改善Mfn2和Ucn3表达，进而改善线粒体功能和维持β细胞成熟度。

3. 讨论

积雪草为伞形科植物，性寒味苦辛，具有清热利湿，解毒消肿之功效。现代药理学研究表明，来源于积雪草中的积雪草酸具有抗炎杀菌、免疫调节、护肝等作用，可降低2型糖尿病大鼠基础血糖，并减轻糖尿病大鼠胰岛纤维化^［7］，改善肝脏胰岛素抵抗^［13］以及糖尿病肾病纤维化^［14］，是潜在的2型糖尿病治疗药物。本文资料显示，积雪草酸可改善2型糖尿病小鼠空腹血糖和葡萄糖糖耐量，增加胰岛素释放和GSIS功能。体外实验结果显示，积雪草酸有胰岛β细胞保护作用。既往有研究显示，50 mg·kg^－1·d^－1积雪草酸可降低高脂喂养db/db小鼠空腹血糖，改善胰岛素抵抗^［15］。本文资料显示，25 mg·kg^－1·d^－1积雪草酸降血糖效果最佳，50 mg·kg^－1·d^－1积雪草酸也同样具有降血糖作用，但其降血糖效果和改善β细胞功能相对较弱，推测50 mg·kg^－1·d^－1积雪草酸可能存在一定的胰岛毒性作用。

传统观点认为，β细胞凋亡是导致胰岛素分泌不足的主要原因，然而2型糖尿病患者β细胞凋亡程度与胰岛功能衰退程度不成比例^［16］，提示尚存在其他引起β细胞GSIS功能障碍机制。近年文献报道，β细胞去分化是导致2型糖尿病β细胞GSIS功能衰竭的重要原因^［17-19］，在2型糖尿病患者及动物模型中均发现成熟胰岛β细胞特异性标志蛋白表达下降，失去正常GSIS功能^［20-21］。Ucn3是β细胞成熟和健康的标志^［22-23］，本文资料显示，2型糖尿病体内、体外模型中胰岛Ucn3表达下降，提示β细胞成熟度降低，而积雪草酸可增加Ucn3表达，有效改善β细胞成熟度，由此提高β细胞GSIS功能。

与成熟胰岛β细胞不同，未成熟胰岛β细胞虽可在不同因子刺激下分泌胰岛素，但由于线粒体功能不完善或线粒体损伤，对葡萄糖响应度较低^［24］，其GSIS功能异常机制可理解为在较高浓度葡萄糖刺激下，β细胞无法经由线粒体代谢产生足量ATP继而释放正常量的胰岛素。2型糖尿病患者和动物模型β细胞中均出现破碎线粒体伴ATP生成减少^［25-27］，体外研究推测该现象可能与线粒体融合减少相关^［25］，提示线粒体融合功能异常可能与2型糖尿病发生、发展相关。线粒体融合蛋白Mfn2在胰岛素靶器官及胰岛素分泌β细胞中均与2型糖尿病发病密切相关。2型糖尿病患者骨骼肌细胞中Mfn2表达下降^［28］，与此同时肝脏特异性敲除Mfn2呈现糖代谢异常，Mfn2缺失引起肌肉与肝脏胰岛素信号削弱^［29］，提示在胰岛素靶组织中Mfn2对调控体内葡萄糖稳态至关重要。而Mfn2与胰岛β细胞成熟及功能的关联更为密切。Mfn2体外可促进胚胎干细胞分化为功能成熟的β细胞^［11］；在正常胰岛中Mfn2缺失可导致GSIS功能异常^［12］；而2型糖尿病模型中，miR-195可抑制Mfn2，破坏β细胞线粒体功能，继而诱导β细胞去分化^［30］。本文资料显示，干扰Mfn2后积雪草酸无法改善棕榈酸导致的β细胞成熟度降低，推测积雪草酸改善2型糖尿病β细胞成熟度与Mfn2蛋白表达上调相关。

另外，炎症因子与糖尿病中β细胞去分化过程密切相关^［31-33］，TNF-α、IL-6以及IL-1β均可促进人及小鼠胰岛β细胞去分化并破坏GSIS功能，其中TNF-α中和抗体尚可恢复糖尿病小鼠β细胞成熟基因表达^［31］。文献报道，TNF-α、IL-6可抑制Mfn2表达^［34-36］，2型糖尿病患者肌肉中Mfn2表达减少可能与TNF-α、IL-6升高有关^［34］，但β细胞中TNF-α和IL-6对Mfn2的调控作用尚不明确。本文资料显示，2型糖尿病体内、体外胰岛模型中TNF-α含量均增加，而积雪草酸可有效减少胰岛中TNF-α含量。与此同时，TNF-α也可减少胰岛细胞Mfn2表达，而积雪草酸可改善该抑制作用。因此，推测积雪草酸可抑制胰岛TNF-α含量继而增加Mfn2表达，从而促进β细胞成熟。

综上所述，积雪草酸改善2型糖尿病β细胞功能与调控TNF-α/Mfn2通路从而增加β细胞成熟度相关，其具体调控机制尚需进一步研究。

［缩略语］

葡萄糖刺激的胰岛素分泌（glucose stimulated insulin secretion，GSIS）；腺苷三磷酸 （adenosine triphosphate，ATP）；线粒体融合蛋白（mitofusin，Mfn）；尿皮质素（urocortin，Ucn）；肿瘤坏死因子（tumor necrosis factor，TNF）；4$\mathrm{´}$，6-二脒基-2-苯基吲哚（4$\mathrm{´}$，6-diamidino-2-phenylindole，DAPI）；磷酸盐缓冲液（phosphate buffered saline，PBS）；酶联免疫吸附试验（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）；白介素（interleukin，IL）；甘油醛-3-磷酸脱氢酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydro-genase，GAPDH）；辣根过氧化物酶（horseradish peroxidase，HRP）；放射免疫沉淀法（radioimmunoprecipitation assay，RIPA）；小干扰RNA（small interfering RNA，siRNA）；稳态模型评价β细胞指数（homeostasis model assessment β index，HOMA-β）

利益冲突声明

所有作者均声明不存在利益冲突

Conflict of Interests

The authors declare that there is no conflict of interests