UBIAD1通过抑制nNOS/NO途径减轻氧糖剥夺再灌注损伤

Abstract

目的

缺血性脑卒中的发病率和致残率均极高，缺血再灌注损伤(ischemia reperfusion injury，IRI)是治疗的关键。UbiA类异戊烯转移酶结构域1蛋白(UbiA prenyltransferase domain containing 1 protein，UBIAD1)是一类具有多种生物学功能的酶，参与线粒体呼吸链电子传递、脂代谢、氧化应激等，这些过程均与IRI有关。本研究探讨UBIAD1在脑IRI中的作用及其作用机制。

方法

以小鼠成神经细胞瘤(mouse neuroblastoma Neuro2a，N2a)细胞为研究对象，构建氧糖剥夺再灌注(oxygen-glucose deprivation/reoxygenation，OGD/R)损伤模型，以过表达UBIAD1的慢病毒载体转染N2a细胞，构建稳定过表达UBIAD1的细胞模型。第1部分实验将N2a细胞分为5组：未经OGD处理(non-OGD)组、经OGD处理4 h后分别再灌注0、4、12、24 h组；第2部分实验将N2a细胞分为6组：正常细胞(Con)+non-OGD组、转染空载体细胞(EV)+non-OGD组、UBIAD1过表达细胞(OE)+non-OGD组、Con+OGD处理(OGD/R)组、EV+OGD/R组、OE+OGD/R组；第3部分将N2a细胞分为8组：Con+non-OGD组、OE+non-OGD组、Con+non-OGD+NOS特异性抑制剂7-硝基吲唑(7-nitroindazole，7-NI)组、OE+non-OGD+7-NI组、Con+OGD/R组、OE+OGD/R组、Con+OGD/R+7-NI组、OE+OGD/R+7-NI组。使用激光共聚焦扫描显微镜观察高尔基体形态改变，流式细胞术检测细胞凋亡率，MTT法检测细胞活力，Griess试剂盒检测NO的释放，分别通过real-time PCR和蛋白质印迹法检测细胞UBIAD1、分泌途径衍生钙离子转运ATP酶1(secretory pathway Ca²⁺-ATPase isoform 1，SPCA1)、NOS的mRNA和蛋白质表达水平。

结果

与non-OGD组相比，经OGD处理4 h后再灌注0、4、12及24 h的各组N2a细胞中UBIAD1 mRNA和蛋白质表达水平均明显下调(P<0.05或P<0.01)，且再灌注时间越长，UBIAD1表达水平下调越显著。与Con+OGD/R组、EV+OGD/R组相比，OE+OGD/R组UBIAD1 mRNA和蛋白质表达水平均明显上调(均P<0.01)，细胞凋亡率均下降(均P<0.01)，细胞活力均增高(均P<0.01)，高尔基体碎裂较少，形态保存较完整，SPCA1 mRNA和蛋白质表达水平均明显上调(均P<0.05)。OE+non-OGD组与Con+non-OGD组相比，OE+OGD/R组与Con+OGD/R组相比，内皮型NOS(endothelial NOS，eNOS)及神经元型NOS(neuronal NOS，nNOS)的mRNA和蛋白质表达均下调(P<0.05或P<0.01)，NO含量均减少(均P<0.01)；Con+OGD/R+7-NI组与Con+OGD/R组相比，OE+OGD/R+7-NI组与OE+OGD/R组相比，NO含量均减少(均P<0.01)，N2a细胞凋亡率均下降(均P<0.01)。

结论

UBIAD1可减轻神经细胞OGD/R损伤，改善OGD/R后高尔基体功能，其机制可能与抑制nNOS/NO途径有关。

缺血性脑卒中的发病率和致残率均极高，对人类健康造成了极大的危害，早期静脉溶栓及血管内介入治疗等可挽救缺血半暗带，是目前最有效的治疗方式，但受到时间窗及缺血半暗带的限制^[1]。缺血再灌注后会诱发缺血再灌注损伤，包括炎症反应、氧化应激、细胞内钙超载、线粒体功能紊乱、细胞凋亡等多种病理生理过程，可进一步加重脑梗死后的脑损伤^[2]。因此探讨缺血再灌注损伤的机制，寻找有效的治疗方法十分重要。

UbiA类异戊烯转移酶结构域1蛋白(UbiA prenyltransferase domain containing 1 protein，UBIAD1)参与许多生理及病理过程，是抗氧化剂辅酶Q10(coenzyme Q10，CoQ10)和维生素K2生物合成中的关键酶，参与对脂质代谢的调控^[3]。UBIAD1在不同的细胞定位于不同的亚细胞器，从而发挥不同的功能。定位在人成骨样MG63细胞内质网上的UBIAD1可通过促进维生素的侧链交换催化维生素K1向维生素K2转换^[4]；定位于人角膜细胞及果蝇S2细胞线粒体上的UBIAD1对维生素K2的合成及线粒体呼吸链电子传递至关重要^[5-6]；定位在人上皮细胞高尔基体上的UBIAD1主要参与高尔基体合成CoQ10，即非线粒体型CoQ10，并通过NO发挥抗氧化作用^[7]。UBIAD1能影响呼吸链电子传递、调节脂代谢、抗氧化应激等，这些均与缺血再灌注损伤有关。本课题组前期的研究^[8]发现UBIAD1共定位于小鼠脑神经瘤细胞株(N2a)细胞的线粒体、内质网及高尔基体，且UBIAD1过表达对氧糖剥夺再灌注(oxygen-glucose deprivation/reoxygenation，OGD/R)损伤后的N2a细胞亚细胞器功能障碍及裂解发挥保护作用。研究^[9]还发现嗅黏膜间充质干细胞可通过调节UBIAD1表达对N2a细胞OGD/R损伤发挥保护作用。可见UBIAD1具有多种生物学功能，且与肿瘤、脂代谢紊乱、氧化应激及多种心脑血管疾病等密切相关。

高尔基体可通过改变自身结构和功能、调节分泌途径衍生钙离子转运ATP酶1(secretory pathway Ca²⁺-ATPase isoform 1，SPCA1)活性、表达自身氧化还原蛋白等参与氧化应激反应，并与线粒体、溶酶体和内质网协作，触发下游信号适应性修复细胞^[10]。笔者前期的研究^[11]还发现SPCA1活性受氧化应激的影响，SPCA1具有维持钙稳态、减轻高尔基体应激的作用，发挥神经保护的功能。如上所述，UBIAD1可参与高尔基体CoQ10合成，并通过NO发挥抗氧化作用。NO的生物合成主要受NOS的影响。按细胞和组织来源NOS共有3种亚型：神经元型NOS(neuronal NOS，nNOS)、内皮型NOS(endothelial NOS，eNOS)、诱导型NOS(inducible，iNOS)，前2种在细胞处于生理状态下即可表达，是钙离子和钙调蛋白依赖型，合称为结构型NOS，后一种为非钙依赖型，在细胞受到刺激时可大量表达。nNOS能被Ca²⁺激活，生成NO影响细胞外调节蛋白激酶(extracellular regulated protein kinases，ERK)表达，促环磷酸腺苷(cyclic adenosine monophosphate，cAMP)反应元件结合蛋白(cAMP responsive element binding protein，CREB)磷酸化，CREB可介导线粒体应激对高尔基体的调控^[12]以及高尔基体应激^[13]。基于以上研究背景，本研究以N2a细胞为实验对象，研究UBIAD1是否通过调节SPCA1表达，从而影响nNOS/NO通路，减轻高尔基体应激，发挥神经保护作用。

1. 材料与方法

1.1. 材料

N2a细胞购于美国模式培养物集存库(American Type Culture Collection，ATCC)，使用含1%青霉素/链霉素双抗的DMEM高糖培养基(含10%胎牛血清)在37 ℃、5% CO₂的饱和湿度恒温箱中培养。

MTT、聚凝胺、山羊抗兔IgG二抗、山羊抗鼠IgG二抗、荧光素标记的山羊抗兔IgG二抗、4',6-二脒基-2-苯基吲哚(4',6-diamidino-2-phenylindole，DAPI)购自美国Sigma公司；细胞总RNA提取试剂盒购自天根生化科技(北京)有限公司；TRIzol、蛋白质分子量标准Marker购自美国Invitrogen公司；RIPA裂解液、BCA试剂盒、NO检测试剂盒、Griess试剂盒购自江苏碧云天生物技术公司；SYBR Green PCR Master Mix购自美国Applied Biosystems公司；反转录第一链cDNA合成试剂盒、RNA酶抑制剂、DNA酶I购自加拿大Fermentas公司；单克隆抗体UBIAD1购自美国GeneTex公司；单克隆抗体SPCA1、GM130购自美国Proteintech公司；单克隆抗体eNOS、iNOS购自英国Abcam公司；单克隆抗体nNOS购自美国Bioss公司；单克隆抗体GAPDH购自美国SANTA公司；Annexin V-FICT/PI凋亡检测试剂盒购自美国Mbchem公司；过表达UBIAD1的慢病毒(LV5-小鼠UBIAD1)购自苏州吉玛基因；7-硝基吲唑(7-nitroindazole，7-NI)购自上海谱振生物科技有限公司。

1.2. OGD/R

本研究用OGD/R模型来模拟体内的缺血再灌注过程。以无糖的D-Hanks’s平衡盐溶液替代原有含糖培养基，并向密闭盒内充入95% N₂和5% CO₂的混合气体以造成无氧环境，将该密闭盒放入37 ℃饱和湿度的恒温培养箱中。N2a细胞在氧糖剥夺(oxygen- glucose deprivation，OGD)的密闭容器内培养4 h后恢复有氧环境，并将无糖D-Hank’s平衡盐溶液替换成新鲜的含有10%胎牛血清的DMEM高糖培养基，然后将培养瓶重新放入37 ℃饱和湿度的恒温培养箱中，再根据实验分组分别继续培养0、4、12及24 h。选取合适的实验时间点进行后续实验。

1.3. MTT法

采用MTT法检测细胞活力。各组细胞处理完毕后每孔加入10 μL MTT(5 g/L)，将细胞培养板重新放入37 ℃饱和湿度的恒温培养箱中孵育4 h，使MTT还原为甲臜，吸出上清液，加入DMSO并用水平摇床摇匀，使甲臜溶解。用酶标仪在570 nm波长处检测每孔的吸光度值，实验重复3次。

1.4. Real-time PCR

使用TRIzol提取N2a细胞的总RNA，检测RNA的纯度和完整性。使用SYBR Green PCR Master Mix试剂盒配置PCR反应体系。在ABI 7900 real-time PCR仪上进行扩增反应，反应条件：95 ℃预变性5 min；94 ℃变性20 s；72 ℃退火20 s；72 ℃延伸5 min，共40个循环。引物(表1)由上海生工生物工程技术有限公司合成。收集扩增各循环荧光信号，循环结束后进行融解曲线分析；检测并记录相应的Ct值，以GAPDH为内参进行荧光校正和定量分析。

表1.

Real-time PCR引物序列

Table 1 Primer sequences of real-time PCR

基因	引物序列(5'-3')	片段大小/bp
UBIAD1	正向：GGCCATTCTCCATTCCAACA 反向：GCCAGCCTCTCGGTCAGA	183
SPCA1	正向：TCAGATGTGGCAAAGCAAAG 反向：TAACCAGCCAACCAACATGA	191
eNOS	正向：TCAGCCATCACAGTGTTCCC 反向：ATAGCCCGCATAGCGTATCAG	87
nNOS	正向：CCCAACGTCATTTCTGTCCGT 反向：TCTACCAGGGGCCGATCATT	182
iNOS	正向：CACCTTGGAGTTCACCCAGT 反向：ACCACTCGTACTTGGGATGC	170

UBIAD1：UbiA类异戊烯转移酶结构域1蛋白；SPCA1：分泌途径衍生钙离子转运ATP酶1；eNOS：内皮型NOS；nNOS：神经元型NOS；iNOS：诱导型NOS。

1.5. 蛋白质印迹法

使用RIPA裂解液裂解细胞，提取N2a细胞的总蛋白质后用BCA法对蛋白质进行定量。取等量蛋白质行SDS-PAGE分离，转移到PVDF膜上，经封闭处理后分别加入单克隆抗体UBIAD1(1꞉1 000)、SPCA1(1꞉500)、eNOS(1꞉400)、nNOS(1꞉400)、iNOS(1꞉200)、GAPDH(1꞉800)，在4 ℃下孵育过夜，洗膜后加入山羊抗兔IgG二抗(1꞉4 000)或山羊抗鼠IgG二抗(1꞉8 000)，在室温下孵育2 h，洗膜后采用ECL试剂盒显影。运用Gel pro4.0凝胶光密度分析软件分析结果，计算各条带积分光密度值(integrated optical density，IOD)。

1.6. 流式细胞术

使用Annexin V-FICT/PI凋亡检测试剂盒检测N2a细胞的凋亡情况。用0.25%的胰酶消化细胞，并吹打成细胞悬液；在室温下，以300 r/min离心5~10 min；用预冷(4 ℃)的1×PBS洗涤细胞，再以300 r/min离心5~10 min，以上操作重复2次。用100 μL细胞洗液重悬细胞后加入预冷的400 μL 1×结合缓冲液；然后加入5 μL Annexin V-异硫氰酸荧光素(fluorescein isothiocyanate，FITC)和5 μL碘化丙啶(propidium iodide，PI)，轻轻混匀；在室温、避光条件下孵育5~15 min。流式细胞仪检测：通过FITC通道(FL1)检测Annexin V-FITC的绿色荧光；通过PI通道(FL3)检测PI的红色荧光。每个实验重复3次取平均值。用荧光素标记的Annexin V和PI对细胞进行双染色，可区分存活细胞、早期凋亡细胞、晚期凋亡细胞和坏死细胞。散点图可分为4个象限，左下象限表示存活细胞，右下象限代表早期凋亡细胞，右上象限代表晚期凋亡及坏死细胞。

1.7. 慢病毒转染

将N2a细胞接种于24孔板，置于饱和湿度、37 ℃、5%CO₂的恒温培养箱中培养过夜，待细胞达到约50%融合时进行转染。取出24孔板，弃去原有培养基，每孔加入5 μg/mL聚凝胺和完全培养基的混合液0.5 mL，加入不同浓度梯度的过表达UBIAD1的慢病毒(LV5-小鼠UBIAD1)感染N2a细胞。将细胞放回培养箱孵育，8~12 h后观察细胞，感染48~96 h后，用免疫荧光显微镜检测绿色荧光蛋白(green fluorescent protein，GFP)报告基因的病毒表达情况，并确定最佳转染时间和病毒浓度。本实验共分6组：正常细胞(Con)+未经OGD处理(non-OGD)组、转染空载体细胞(EV)+non-OGD组、UBIAD1过表达细胞(OE)+non-OGD组、Con+经OGD/R处理(OGD/R)组、EV+OGD/R组、OE+OGD/R组。

1.8. 免疫荧光染色

在6孔板内小心放置盖玻片，接种N2a细胞至6孔板进行培养。细胞片在室温下经4%甲醛固定液固定20 min后自然干燥；用PBS(0.01 mol/L)洗涤细胞片3次，每次5 min；滴加正常山羊血清封闭液，在室温下封闭20 min后甩去多余液体；滴加GM130抗体(1꞉100)50 μL，在4 ℃下孵育过夜；用PBS(0.01 mol/L)洗涤细胞片3次，每次5 min；滴加荧光素标记的山羊抗兔IgG二抗50 μL，在室温下避光放置40 min；用PBS(0.01 mol/L)洗涤细胞片3次，每次5 min；用DAPI复染细胞核5 min；用PBS(0.01 mol/L)洗涤细胞片3次，每次5 min；在激光共聚焦扫描显微镜(LeicaTCS-SP5型)下观察、采集并保存图像。

1.9. NO含量的测定

为进一步研究UBIAD1的作用机制，用nNOS特异性抑制剂7-NI预处理N2a细胞(100 μmol/L，24 h)。实验共分8组：Con+non-OGD(A1)组、OE+non-OGD(A2)组、Con+non-OGD+7-NI(A3)组、OE+non-OGD组+7-NI(A4)组、Con+OGD/R组(B1)、OE+OGD/R(B2)组、Con+OGD/R+7-NI(B3)组、OE+OGD/R+7-NI(B4)组。

采用Griess试剂盒检测NO含量。按照说明书步骤进行操作在540 nm波长处测定各样本的吸光度值，每样本检测3复孔。根据检测结果制作标准工作曲线，计算NO含量(细胞样本NO含量/细胞样品蛋白质的浓度)，单位为μmol/mg蛋白。

1.10. 统计学处理

采用SPSS 23.0进行统计学分析。数据用均数±标准差( $\overline{x}$ ±s)表示。两组间比较用t检验，多组间均数比较用单因素方差分析(one-way ANOVA)。P<0.05表示差异有统计学意义。

2. 结 果

2.1. OGD/R对N2a细胞中UBIAD1表达的影响

与未行OGD处理(non-OGD)组相比，经OGD处理4 h后再灌注0、4、12及24 h的各组N2a细胞中UBIAD1 mRNA和蛋白质表达水平均明显下调(P<0.05或P<0.01，图1)，且再灌注时间越长，UBIAD1表达水平下调越显著。选择12 h作为后续实验的再灌注时间。

图1.

OGD/R后N2a细胞UBIAD1的mRNA和蛋白质表达水平比较

Figure 1 Comparison of mRNA and protein expression levels of UBIAD1 in N2a cells after OGD/R

A: UBIAD1 protein expression levels determined with Western blotting; B: UBIAD1 mRNA expression levels determined with real-time PCR. *P<0.05, **P<0.01 vs the non-OGD group. OGD/R: Oxygen-glucose deprivation/reoxygenation; UBIAD1: UbiA prenyltransferase domain containing 1 protein.

2.2. 过表达UBIAD1减轻N2a细胞的OGD/R损伤

蛋白质印迹法( 图2A)和real-time PCR(图2B)结果显示：过表达UBIAD1的N2a细胞与正常或转染空载体的N2a细胞相比(OE+OGD/R组 vs Con+OGD/R组或EV+OGD/R组，OE+non-OGD组 vs Con+non-OGD组或EV+non-OGD组)，UBIAD1 mRNA和蛋白质表达水平均明显上调(均P<0.01)。

图2.

过表达UBIAD1减轻N2a细胞OGD/R损伤

Figure 2 Overexpressed UBIAD1 ameliorated OGD/R injury in N2a cells

A: UBIAD1 protein expression levels determined with Western blotting after transfection with overexpressing plasmid; B: UBIAD1 mRNA expression levels determined with real-time PCR after transfection with overexpressing plasmid; C: Cell apoptosis determined with flow cytometry; D: Cell viability determined with MTT assay. 1: Con+non-OGD; 2: EV+non-OGD; 3: OE+non-OGD; 4: Con+OGD/R; 5: EV+OGD/R; 6: OE+OGD/R. **P<0.01 vs the OE+non-OGD group; ††P<0.01 vs the OE+OGD/R group; ‡‡P<0.01 vs the Con+non-OGD group; §§P<0.01 vs the EV+non-OGD group. OGD/R: Oxygen-glucose deprivation/reoxygenation; UBIAD1: UbiA prenyltransferase domain containing 1 protein.

流式细胞术结果(图2C)显示：行OGD/R处理的N2a细胞与未接受OGD处理的N2a细胞相比(OE+OGD/R组 vs OE+non-OGD组、Con+OGD/R组 vs Con+non-OGD组、EV+OGD/R组 vs EV+non-OGD组)，细胞凋亡率均显著上升(均P<0.01)；与Con+OGD/R组或EV+OGD/R组相比，OE+OGD/R组细胞凋亡率均显著降低(均P<0.01)，而Con+OGD/R组与EV+OGD/R组之间细胞凋亡率差异无统计学意义 (P>0.05)。

MTT结果(图2D)显示：Con+OGD/R组与Con+non-OGD组相比，EV+OGD/R组与EV+non-OGD组相比，细胞活力均明显下降(均P<0.01)；但OE+OGD/R组与OE+non-OGD组相比，细胞活力差异无统计学意义(P>0.05)；与Con+OGD/R组或EV+OGD/R组相比，OE+OGD/R组细胞活力均明显增加(均P<0.01)，而Con+OGD/R组与EV+OGD/R组之间细胞活力差异无统计学意义(P>0.05)。

2.3. 过表达UBIAD1减轻OGD/R后N2a细胞的高尔基体应激

激光共聚焦扫描显微镜下可见(图3A)：未行OGD处理的各组(Con+non-OGD组、EV+non-OGD、OE+non-OGD组)N2a细胞的高尔基体结构紧密，呈环形或新月形环绕在细胞核周围，高尔基体形态未发生改变，结构完整；经OGD/R处理后，Con+OGD/R组和EV+OGD/R组N2a细胞的高尔基体结构松散甚至碎裂，不能维持正常的环形或新月形结构，呈扇形散开，分布于细胞核周围，而OE+OGD/R组N2a细胞虽然部分高尔基体结构出现松散，但基本能维持正常形态。

图3.

过表达UBIAD1减轻OGD/R后N2a细胞高尔基体应激

Figure 3 Over-expressed UBIAD1 ameliorated Golgi stress in N2a cells after OGD/R

A: Morphology of Golgi apparatus detected by GM130 staining under confocal laser scanning microscopy, scale bar=10 μm; B: SPCA1 protein expression levels determined by Western blotting; C: SPCA1 mRNA expression levels determined by real-time PCR. 1: Con +non-OGD; 2: EV+non-OGD; 3: OE+non-OGD; 4: Con+OGD/R; 5: EV+OGD/R; 6: OE+OGD/R. *P<0.05, **P<0.01 vs the OE+non-OGD group; †P<0.05 vs the OE+OGD/R group; ‡P<0.05, ‡‡P<0.01 vs the Con+non-OGD group; §P<0.05, §§P<0.01 vs the EV+non-OGD group.OGD/R: Oxygen-glucose deprivation/reoxygenation; UBIAD1: UbiA prenyltransferase domain containing 1 protein.

蛋白质印迹法(图3B)和real-time PCR(图3C)结果显示：过表达UBIAD1的N2a细胞与正常或转染空载体的N2a细胞相比(OE+OGD/R组 vs Con+OGD/R组或EV+OGD/R组，OE+non-OGD组 vs Con+non-OGD组或EV+non-OGD组)，高尔基体上SPCA1 mRNA及蛋白质表达水平均明显上调(均P<0.05)；正常或转染空载体的N2a细胞相比(Con+non-OGD组 vs EV+non-OGD组、Con+OGD/R组 vs EV+OGD/R组)，SPCA1 mRNA及蛋白质表达水平差异均无统计学意义(均P>0.05)；行OGD/R处理的N2a细胞与未接受OGD处理的N2a细胞相比(OE+OGD/R组 vs OE+non-OGD组、Con+OGD/R组 vs Con+non-OGD组、EV+OGD/R组 vs EV+non-OGD组)，SPCA1 mRNA及蛋白质表达水平均明显下调(P<0.05或P<0.01)。

2.4. UBIAD1通过nNOS/NO途径减轻OGD/R后N2a细胞的损伤

蛋白质印迹法和real-time PCR结果(图4)显示：行OGD/R处理的N2a细胞与未接受OGD处理的N2a细胞相比(B1组 vs A1组、B2组 vs A2组、B3组 vs A3组、B4组 vs A4组)，eNOS的mRNA和蛋白质表达均明显上调(均P<0.05或P<0.01)；过表达UBIAD1的N2a细胞与正常N2a细胞相比(A2组 vs A1组、A4组 vs A3组、B2组 vs B1组、B4组 vs B3组)，eNOS的mRNA和蛋白质表达均明显下调(均P<0.05或P<0.01)。对正常或过表达UBIAD1的N2a细胞而言，接受OGD/R处理较未接受OGD处理的各组(B1组 vs A1组、B2组 vs A2组)，nNOS的mRNA和蛋白质表达均明显上调(均P<0.05或P<0.01)；A2组与A1组、A4组与A3组、B2组与B1组相比，nNOS的mRNA和蛋白质表达均明显下调(均P<0.05或P<0.01)，但B3组与B4组间nNOS表达差异均无统计学意义(均P>0.05)；各亚组间iNOS表达水平差异无统计学意义(均P>0.05)。加抑制剂与未加抑制剂的各组相比(A3组 vs A1组、A4组 vs A2组、B3组 vs B1组、B4组 vs B2组)，nNOS的mRNA和蛋白质表达水平均明显下调(均P<0.05或P<0.01)，eNOS、iNOS的mRNA和蛋白质表达在上述组间的差异均无统计学意义(均 P>0.05)。

图4.

过表达UBIAD1下调OGD/R后N2a细胞中nNOS的表达

Figure 4 Over-expressed UBIAD1 down-regulated the mRNA and protein expression nNOS in N2a cells after OGD/R

A-D: Histogram showing the mRNA and protein expression of eNOS (A), nNOS (B), iNOS (C), and SPCA1 (D); E: Electrophoregram showing the protein expression of eNOS, nNOS, iNOS, and SPCA1. A1: Con+non-OGD; A2: OE+non-OGD; A3: Con+non-OGD+7-NI; A4: OE+non-OGD+7-NI; B1: Con+OGD/R; B2: OE+OGD/R; B3: Con+OGD/R+7-NI; B4: OE+OGD/R+7-NI. *P<0.05, **P<0.01 vs the Group A1; †P<0.05, ††P<0.01 vs the Group A2; ‡P<0.05, ‡‡P<0.01 vs the Group A3; §P<0.05, §§P<0.01 vs the Group A4; ¶P<0.05, ¶¶P<0.01 vs the Group B1; ǁP<0.05, ǁǁP<0.01 vs the Group B3; #P<0.05, ##P<0.01 vs the Group B2.OGD/R: Oxygen-glucose deprivation/reoxygenation; UBIAD1: UbiA prenyltransferase domain containing 1 protein; eNOS: Endothelial nitric oxide synthase; nNOS: Neuronal nitric oxide synthase; iNOS: Inducible nitric oxide synthase; 7-NI: 7-nitroindazole.

蛋白质印迹法和real-time PCR结果(图4)显示：行OGD/R处理的N2a细胞与未接受OGD处理的N2a细胞相比(B1组vsA1组、B2组vsA2组、B3组vsA3组、B4组vsA4组)，SPCA1的mRNA和蛋白质表达均明显下调(均P<0.01)；过表达UBIAD1的N2a细胞与正常N2a细胞相比(A2组vsA1组、A4组vsA3组、B2组vsB1组、B4组vsB3组)，SPCA1的mRNA和蛋白质表达均明显上调(P<0.05或P<0.01)；加抑制剂与未加抑制剂的各组相比(A3组vsA1组、A4组vsA2组、B3组vsB1组、B4组vsB2组)，SPCA1的mRNA和蛋白质表达水平差异均无统计学意义(均P>0.05)。

流式细胞仪结果(图5A，5B)显示：未接受OGD处理的各组(A1组、A2组、A3组、A4组)间，细胞凋亡率差异均无统计学意义(均P>0.05)；行OGD/R处理的N2a细胞与未接受OGD处理的N2a细胞相比(B1组 vs A1组、B2组 vs A2组、B3组 vs A3组、B4组 vs A4组)，细胞凋亡率均明显升高(均P<0.01)；行OGD/R处理的N2a细胞，加抑制剂与未加抑制剂的相比(B3组 vs B1组、B4组 vs B2组)，过表达UBIAD1与正常的相比(B2组 vs B1组)，细胞凋亡率均显著下降(均P<0.01)；B4组与B3组之间细胞凋亡率的差异无统计学意义(P>0.05)。

图5.

UBIAD1通过抑制nNOS/NO表达减轻OGD/R后N2a细胞的损伤

Figure 5 UBIAD1 reduced OGD/R induced N2a cell injury through down-regulation of the nNOS/NO pathway

A and B: Cell apoptosis determined by flow cytometry assay; C: NO release of N2a cells. A1: Con+non-OGD; A2: OE+non-OGD; A3: Con+non-OGD+7-NI; A4: OE+non-OGD+7-NI; B1: Con+OGD/R; B2: OE+OGD/R; B3: Con+OGD/R+7-NI; B4: OE+OGD/R+7-NI. *P<0.05, **P<0.01 vs the Group A1; †P<0.05, ††P<0.01 vs the Group A2; ‡P<0.05, ‡‡P<0.01 vs the Group A3; §P<0.05, §§P<0.01 vs the Group A4; ¶P<0.05, ¶¶P<0.01 vs the Group B1; ǁP<0.05, ǁǁP<0.01 vs the Group B3; #<0.05, ##P<0.01 vs the Group B2. OGD/R: Oxygen-glucose deprivation/reoxygenation; UBIAD1: UbiA prenyltransferase domain containing 1 protein; nNOS: Neuronal nitric oxide synthase; 7-NI: 7-nitroindazole.

行OGD/R处理的N2a细胞与未接受OGD处理的N2a细胞相比(B1组 vs A1组、B2组 vs A2组、B3组 vs A3组、B4组 vs A4组)，NO含量均升高(均P<0.01)；过表达UBIAD1与正常的N2a细胞相比(A2组 vs A1组、B2组 vs B1组)，NO含量均减少(均P<0.01)；加抑制剂与未加抑制剂的N2a细胞相比(A3组与A1组、A4组与A2组、B3组与B1组、B4组与B2组)，NO含量均减少(均P<0.01)；B4组的NO含量较B3组升高(P<0.01)，A3组与A4组间差异无统计学意义(P>0.05，图5C)。

3. 讨 论

缺血性脑卒中具有高发病率和高致残率的特点，IRI是目前治疗的重点和难点。虽然关于缺血再灌注的研究已有很多，但目前尚无有效的治疗缺血性脑卒中的方法。因此探讨IRI的机制，进而寻找有效的治疗方案具有十分重要的临床意义。

已有研究证实UBIAD1功能障碍可导致心血管疾病^[7]、帕金森病^[6]、施奈德结晶状角膜营养不良^[14]及泌尿系肿瘤^[15]。但目前鲜有关于UBIAD1与IRI关系的研究，鉴于UBIAD1通过参与多种物质的合成和调节发挥重要功能，笔者推测UBIAD1在脑IRI中亦可能有神经保护作用。本研究采用体外实验探究UBIAD1在N2a细胞OGD/R损伤中的作用及其机制，结果显示OGD/R可使UBIAD1表达下调，而过表达UBIAD1的N2a细胞经过OGD/R处理后凋亡减少，细胞活力增加，证实UBIAD1可能在OGD/R损伤中对N2a细胞发挥保护作用。

IRI的机制复杂，细胞凋亡及氧化应激在其中发挥重要作用。高尔基体通过自身结构及功能的改变，参与细胞凋亡、鞘脂类代谢、信号转导、抗氧化等过程。SPCA1定位在高尔基体上，其功能主要是维持高尔基体内Ca²⁺稳态，参与蛋白质从高尔基体转运到细胞质的过程^[16]。一方面，SPCA1的活性受氧化应激的调控；另一方面，SPCA1能减轻高尔基体应激，对维持高尔基体功能及形态的完整性起重要作用。体内及体外实验^[17-18]均证实SPCA1具有神经保护作用。本研究发现：经OGD/R处理后，N2a细胞的高尔基体形态出现改变，甚至碎裂，N2a细胞SPCA1的表达明显下调。这与既往研究^{[11, 19-20]}结果一致。SPCA1表达下调可能是因为OGD/R处理使高尔基体碎裂，破坏了SPCA1结构或功能的完整性。进一步研究发现：在OGD/R处理后，过表达UBIAD1的N2a细胞高尔基体碎裂明显减少，同时SPCA1的表达上调。这提示UBIAD1对高尔基体有保护作用。UBIAD1可通过维持高尔基体形态完整性及上调SPCA1表达来减轻OGD/R处理后发生的高尔基体应激，从而发挥对N2a细胞的保护作用。

氧化应激在IRI的病理生理过程中扮演重要角色，会进一步触发炎症反应、能量衰竭等。活性氧(reactive oxygen species，ROS)和活性氮(reactive nitrogen species，RNS)在氧化应激损伤中起重要作用，清除ROS/RNS可以减轻氧化应激及IRI。

NO是中枢神经系统重要的神经递质，NO的生成主要受NOS的调控。内源性NO生物利用度降低与动脉粥样硬化、脑卒中、肿瘤等多种疾病有关^[21]。低浓度的NO可能促进肿瘤细胞生长；高浓度的NO有细胞毒性，可损害线粒体呼吸链，导致细胞凋亡^[22]；NO浓度过低或过高均有危害，参与疾病的发生和发展^[23]。本研究结果显示：N2a细胞经过OGD/R处理后，NO释放量明显增加，过表达UBIAD1可减少NO的释放，并使细胞凋亡率明显下降。这提示经过OGD/R处理后过高的NO浓度对N2a细胞生长不利，而过表达UBIAD1可能通过减少NO释放对N2a细胞的OGD/R损伤发挥保护作用。

eNOS是一种钙依赖型的合酶，功能受Ca²⁺浓度的调节，在心血管系统中起重要的调节作用。在正常情况下，eNOS的合成产物是NO，但在缺少四氢生物蝶呤(tetrahydrobiopterin，BH4)或L-精氨酸时，eNOS不能合成NO，而是生成超氧阴离子，这个过程称之为eNOS解偶联，是氧化应激后BH4或者L-精氨酸的氧化所致^[24]；超氧阴离子氧化NO生成具有极高活性的过氧硝酸盐，过氧硝酸盐又可氧化BH4生成BH3^-，降低BH4的水平，进一步导致eNOS解偶联，形成一个恶性循环。eNOS解偶联与高脂血症、高血压、糖尿病等疾病相关。本研究发现OGD/R后N2a细胞中eNOS表达上调，与之前文献[23]的结果一致，可能是OGD/R诱导的氧化应激使细胞内钙超载，Ca²⁺浓度增加，进而上调eNOS的表达。进一步研究发现：过表达UBIAD1的N2a细胞OGD/R后eNOS表达下调，N2a细胞凋亡率明显下降。其可能原因有二：1)UBIAD1过表达可上调SPCA1的表达，SPCA1作为高尔基体内的钙锰离子泵，可调节Ca²⁺稳态，从而使OGD/R后N2a细胞内Ca²⁺浓度降低，eNOS活化减少；2)UBIAD1具有抗氧化作用，其生成的CoQ10可重偶联eNOS^[25]，过表达UBIAD1后，氧化应激后解偶联的eNOS减少，而重偶联后的eNOS与底物可能形成酶-底物复合物，因此被检测到的量少。

nNOS也是一种钙依赖型的合酶，定位在不同的亚细胞器，可发挥不同的功能，参与多种疾病的病理过程^[26]。nNOS在中枢神经系统、周围神经系统、上皮细胞、胰岛细胞、肾上腺等均有表达，与血压的中枢调控、神经元的死亡及脑血管疾病有关。在生理状态下，nNOS精确调控有神经保护作用的NO的生成、释放及失活，但在氧化应激等病理状态(如缺血性脑卒中、帕金森病、阿尔茨海默病等)下，细胞内钙超载能大量激活nNOS，生成过多的NO并导致细胞毒性^[27]，进一步导致神经元死亡。7-NI是nNOS的选择性抑制剂，选择性强，应用广泛^[28]。本研究证实7-NI可显著抑制nNOS的表达，对eNOS及iNOS的表达无影响。nNOS基因敲除及接受7-NI治疗的大鼠与正常大鼠相比，梗死面积明显减少，脑梗死后病灶周围的神经细胞再生明显增多^[29]。动物试验^[30]也发现抑制nNOS可改善脑缺血损伤，证明在脑梗死中nNOS具有神经毒性，抑制nNOS的活性可通过调节体内NO的含量减轻脑梗死后的缺血性损伤并促进神经再生。

本研究结果发现：在OGD/R处理后，N2a细胞nNOS表达明显上调且细胞凋亡率升高，7-NI可降低OGD/R处理的N2a细胞的凋亡率，但对正常N2a细胞的凋亡率无明显影响。这提示nNOS在OGD/R中对N2a细胞发挥神经毒性作用，而7-NI对N2a细胞无明显毒性作用，且在OGD/R中发挥保护作用，与之前的动物实验^[29-30]结果一致。

UBIAD1过表达后，N2a细胞nNOS的表达下调，SPCA1的表达上调，提示UBIAD1、SPCA1和nNOS之间存在一定联系。7-NI抑制nNOS表达后，N2a细胞SPCA1表达无明显变化，UBIAD1过表达后SPCA1表达上调，而nNOS表达下降，说明SPCA1表达不受nNOS的调控，SPCA1可能是nNOS的上游蛋白质。与未进行OGD处理的N2a细胞相比，OGD/R组N2a细胞的nNOS表达上调，UBIAD1过表达后nNOS表达下降，这可能是因为氧化应激后Ca²⁺超载可大量激活nNOS，而UBIAD1过表达可上调SPCA1表达水平，SPCA1可以调节钙超载并维持Ca²⁺浓度的稳定，从而减少nNOS的活化。N2a细胞的凋亡率随着nNOS表达的上调而升高，UBIAD1过表达或7-NI抑制nNOS表达后，N2a细胞凋亡率明显下降，说明OGD/R后N2a细胞的凋亡率与nNOS的表达水平呈正相关。

综上，UBIAD1可减轻OGD/R损伤后N2a细胞高尔基体应激及凋亡；UBIAD1可能通过上调SPCA1抑制nNOS/NO途径，发挥神经保护作用(图6)。

图6.

UBIAD1减轻OGD/R损伤的作用及其可能机制

Figure 6 Role of UBIAD1 in reducing OGD/R damage and the underlying mechanism UBIDA1: UbiA prenyltransferase domain containing 1 protein; SPCA1: Secretory pathway Ca²⁺-ATPase isoform 1; CoQ10: Coenzyme Q10; OGD/R: Oxygen-glucose deprivation/reoxygenation; nNOS: Neuronal NOS; eNOS: Endothelial NOS.

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《中南大学学报(医学版)》编辑部

基金资助

国家自然科学基金(8197052473)。

This work was supported by the National Natural Science Foundation (8197052473), China.

利益冲突声明

作者声称无任何利益冲突。

作者贡献

郑海平 实验操作，数据分析，论文写作；涂然然 论文修改；陈春丽 实验指导，论文修改；胡治平 项目立项，实验指导及论文撰写。所有作者阅读并同意最终的文本。

原文网址

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