Abstract
目的
探究含硒生物材料修饰钛对大鼠骨髓间充质干细胞(rat bone marrow mesenchymal stem cells，rBMMSCs)成骨分化以及对小鼠RAW 264.7细胞M2型极化的调控作用，以通过表面修饰的方法解决临床中钛植入物因炎症、疾病微环境、骨整合不佳等原因而导致的植入失败。
方法
合成含硒聚氨酯(selenium-containing polyurethane, SePU)高分子, 并通过浸泡将其修饰于钛片表面，浸泡溶液浓度分别设置为1、3、5 g/L，以纯钛片为对照组，表面培养rBMMSCs和巨噬细胞；通过表面接触角变化表征SePU对钛片的修饰；钛片表面培养2 d后，通过细胞活/死染色观察SePU修饰钛对rBMMSCs和巨噬细胞活性的影响；通过碱性磷酸酶(alkaline phosphatase，ALP)染色及定量、茜素红(alizarin red S，ARS)染色及定量、成骨相关基因的表达观察SePU修饰钛对rBMMSCs成骨分化的影响；通过巨噬细胞极化相关基因的表达观察SePU修饰钛对巨噬细胞极化的影响。
结果
成功制备SePU修饰钛片，其表面接触角随浸泡液浓度增加而增大；钛片表面培养2 d后，纯钛组和SePU修饰钛各组中rBMMSCs和巨噬细胞基本为活细胞，仅有个别死细胞；SePU修饰钛各组较纯钛组ALP及ARS染色深，成骨相关基因表达升高，差异具有统计学意义(P＜0.05)，其中3 g/L组ALP染色最深，成骨相关基因的表达较纯钛组增加最为显著；SePU修饰钛各组较未修饰纯钛组的促炎相关基因表达降低，抑炎相关基因表达升高，差异具有统计学意义(P < 0.05)，其中3 g/L组效果较未修饰纯钛组最为显著。
结论
SePU修饰钛表面接触角增加，对细胞活性无明显影响，能够有效促进rBMMSCs成骨分化和RAW 264.7向M2型极化，表明其在生物医学领域中具有促进骨再生和调节免疫反应的潜力。
Keywords: 含硒聚氨酯, 钛, 包被物质, 生物相容性, 间充质干细胞, 骨生成, 巨噬细胞活化
Abstract
Objective
To address the issue of implant failure in clinical titanium implants due to inflammation, disease microenvironments, poor osseointegration through surface modification, and to explore the regulatory effects of selenium-containing biomaterial-modified titanium on the osteogenic differentiation of rat bone marrow mesenchymal stem cells (rBMMSCs) and the M2 polarization of RAW 264.7 cells.
Methods
Selenium-containing polyurethane (SePU) was synthesized, and titanium sheets were modified by immersion in SePU solutions at concentrations of 1, 3, and 5 g/L. Pure titanium sheets served as the control group. rBMMSCs and RAW 264.7 cells were then cultured on the modified titanium surfaces. The surface contact angles of the SePU-modified titanium sheets were characterized. After 2 days of culture, the effect of SePU-modified titanium on the viability of rBMMSCs and RAW 264.7 cells was observed using live/dead cell staining. The osteogenic differentiation of rBMMSCs was evaluated using alkaline phosphatase (ALP) staining and quantification, alizarin red S (ARS) staining and quantification, as well as the expression levels of osteogenic-related genes. The polarization state of RAW 264.7 cells was assessed by analyzing the expression levels of macrophage polarization-related genes.
Results
SePU-modified titanium sheets were successfully prepared and their surface contact angles increased with the immersion concentration. Following 2 days of culture, the majority of rBMMSCs and RAW 264.7 cells on both the pure titanium and SePU-modified titanium surfaces were viable, with only a negligible presence of dead cells. Notably, compared with the pure titanium group, the SePU-modified titanium groups exhibited more profound ALP and ARS staining, coupled with a statistically significant increase in the expression levels of osteogenic-related genes (P < 0.05). Among these groups, the 3 g/L group showed the deepest ALP staining and the most significant increase in osteogenic-related gene expression. Furthermore, the SePU-modified titanium groups displayed decreased expression of proinflammatory genes and increased expression of anti-inflammatory genes compared with the unmodified pure titanium group, with statistically significant differences (P < 0.05). The 3 g/L group exhibited the most significant effect among the modified titanium groups.
Conclusion
SePU-modified titanium not only exhibits increased surface contact angles but also has no significant effect on cell viability. It effectively promotes the osteogenic differentiation of rBMMSCs and the M2 polarization of RAW 264.7 cells, indicating its potential for enhancing bone regeneration and modulating immune responses in biomedical applications.
Keywords: Selenium-containing polyurethane, Titanium, Coated materials, biocompatible, Mesenchymal stem cells, Osteogenesis, Macrophage activation
钛及钛合金凭借其卓越的生物相容性和骨整合能力，在口腔及骨科领域作为修复缺失牙和治疗骨折、骨缺损等疾病的重要植入材料已得到广泛应用[1]。然而，钛植入物在临床实践中仍面临诸多挑战，包括生物活性不足、植入后炎症反应显著，以及在高风险患者(如全身疾病患者)中植入物失败率较高等问题[2]。因此，如何提升钛植入物的生物活性、促进骨整合、降低炎症反应，并降低在全身疾病背景下的失败率，是亟待解决的难点问题。表面涂层与表面结构优化是提高钛植入物生物相容性和治疗效果的关键策略，但现有的钛表面修饰方法普遍存在修饰过程复杂、修饰层与基底结合力欠佳，以及难以同时兼顾抗炎与促成骨双重效果等局限性[3]。传统的物理方法，如喷砂和热喷涂等，虽能在一定程度上提高表面粗糙度和生物活性，但易引入污染物、对清洗工艺要求高，且可能因高温处理导致涂层性能下降[4]。化学方法如碱热处理和电化学阳极氧化等，虽取得了一定的研究进展[5-6]，但同样面临操作流程复杂和涂层与基底结合力欠佳的挑战。
鉴于骨骼微环境中骨细胞、免疫细胞和造血细胞的相互作用，以及这些细胞在骨免疫系统功能中的协同作用，开发具有骨免疫调节功能的生物材料成为了一个有吸引力的方向[7]。本课题组前期研究利用单细胞测序和空间转录组技术深入分析了生物材料对骨及免疫微环境的调控机制，揭示了巨噬细胞亚群与间充质干细胞亚群间的相互作用，为具有免疫调节功能的生物材料在促进成骨的应用中提供了高分辨率的分子生物学基础[8]。
在探索钛植入物表面修饰的新途径中，人体必需元素“硒”因其独特的生物学特性而受到关注。作为一种具有优异氧化还原特性的微量元素，硒能调控机体氧化应激水平[9]，为钛表面修饰提供了新的理论基础和潜在应用途径。硒代半胱氨酸作为硒在生物体内的主要存在形式，通过参与硒蛋白的合成和功能发挥，在抗氧化和防止氧化应激方面发挥关键作用[10-11]。此外，硒在免疫调节中的双重作用，即在低剂量下的抗炎效应和高剂量下的促炎效果[12]，也为含硒材料在骨免疫系统中的潜在应用提供了理论依据。相较于无机硒，有机硒具有生物利用度高、生物毒性低和作用范围广等优点[13]。含硒聚氨酯(selenium-containing polyurethane，SePU)作为一种有机硒生物材料，展现出了优异的生物相容性、结构稳定性和合成简便性[14]。因此，本研究旨在通过制备适当浓度的SePU修饰钛植入物，探究其促成骨和抗炎作用，为含硒材料在钛表面修饰中的应用提供新的视角和可能性，以期克服现有技术的局限性，为钛植入物的临床应用开辟新的道路。
1. 材料与方法
1.1. 实验试剂与材料
实验所用材料、试剂除特殊说明外均购自美国Sigma公司。α-最低必需培养基(alpha-minimum essential medium，α-MEM)、达尔伯克改良伊格尔培养基(Dulbecco’s modified Eagle medium，DMEM)、胎牛血清(fetal bovine serum，FBS)、胰蛋白酶-乙二胺四乙酸、青霉素-链霉素(5 000 U/mL)购自美国Gibco公司；TRIzol试剂购自美国Invitrogen公司；BCIP/NBT碱性磷酸酯酶显色试剂盒(货号C3206)、碱性磷酸酶检测试剂盒(货号P0321S)购自中国碧云天生物科技公司；细胞活力(活/死细胞染色)检测试剂盒(Calcein-AM/PI法，货号KGA9501)购自中国凯基生物公司；SybrGreen荧光染料购自中国翌圣生物科技公司；RNA逆转录试剂盒购自中国艾科瑞生物公司；高纯钛片购自清河县奥硕金属材料有限公司；二甲基亚砜(dimethyl sulfoxide，DMSO)、三氯甲烷购自国药集团化学试剂有限公司；丙酮、无水乙醇、异丙醇购自北京市通广精细化工公司；SePU由清华大学许华平教授课题组提供。
1.2. 细胞来源
本研究获得北京大学生物医学伦理委员会批准(批准号：PUIRB-LA2023535)。原代大鼠骨髓间充质干细胞(rat bone marrow mesenchymal stem cells，rBMMSCs)来源于3周龄雄性SD大鼠股骨。应用颈椎脱臼法处死大鼠，取材大鼠双侧股骨组织放入10%(体积分数)FBS、2%(体积分数)青霉素-链霉素的无菌磷酸盐缓冲液(phosphate buffered saline，PBS)中，并置于冰上。配制含10%FBS和1%青-链霉素的α-MEM作为增殖培养基，在无菌条件下，剪开股骨两端，用注射器吸取适量增殖培养基反复冲洗骨髓腔，获得细胞。培养细胞获得贴壁的rBMMSCs，传代培养至第3代用于实验。小鼠RAW 264.7细胞购自中国普诺赛公司(货号CL-0190)，传代扩增后用于实验。
1.3. SePU修饰钛片的制备
将SePU溶解于DMSO中制备SePU溶液，根据浸泡钛片的SePU浓度不同分为SePU 1 g/L、SePU 3 g/L、SePU 5 g/L三个实验组，同时将未经修饰的纯钛作为对照。分别将10 mm×10 mm×0.2 mm和20 mm×20 mm×0.2 mm的高纯钛片经5 000目、10 000目碳化硅砂纸依序打磨去除钛表面致密氧化层，依次用丙酮、无水乙醇、去离子水超声清洗钛片各10 min后晾干备用。将超声清洗后的钛片浸泡至不同浓度的SePU溶液中1.5 h后，无水乙醇清洗钛片表面。经75%(体积分数)乙醇浸泡和紫外线照射30 min消毒灭菌后，获得可用于细胞培养的纯钛及SePU修饰钛片(图 1)。
图 1.
SePU修饰钛的制备
Preparation of SePU modified titanium
SePU, selenium-containing polyurethane; Ti, titanium; SePU-Ti, SePU modified Ti.
1.4. 接触角测量
使用OCA25型静态接触角测量仪(Dataphysics，德国)测量实验组和对照组钛片表面的静态接触角。每组设置2个重复样本，并各测量钛片中心及随机2个角落的静态接触角大小。将钛片放于载物台上，调整光学镜头使样品成像清晰并能观察到针头。确定针头位置后缓缓向外注射去离子水，调整载物台高度使水滴与样品表面接触，随后立即捕捉拍摄图像。确定每次滴加的液滴体积和速度不变，测量去离子水与钛表面的接触角。利用GraphPad Prism分析各组接触角差异，评估钛片表面亲水性。实验重复3次。
1.5. rBMMSCs体外培养、传代和成骨诱导
在含5%(体积分数)CO2的37 ℃恒温培养箱中培养rBMMSCs。配制含10%FBS和1%青-链霉素的α-MEM作为增殖培养基，每2天更换一次培养基，待细胞汇合度达到90%时进行传代。细胞经过胰蛋白酶消化、培养基终止消化后，进行离心(1 000 r/min，5 min)，将细胞沉淀重悬，按1 ∶ 3的比例接种至培养皿中或材料表面。配制含10%FBS、1%青-链霉素、10 mmol/L β-甘油磷酸钠、0.2 mmol/L L-抗坏血酸和100 nmol/L地塞米松的α-MEM作为成骨诱导培养基，于接种后细胞培养至汇合度80%时更换成骨诱导培养基进行成骨诱导。
1.6. RAW 264.7体外培养和传代
在含5%CO2的37 ℃恒温培养箱中培养RAW 264.7。配置含10%FBS和1%青-链霉素的DMEM作为增殖培养基，每2天更换一次培养基，待细胞汇合度达到90%时进行传代。细胞经无菌细胞刮刮下后进行离心(1 000 r/min，5 min)，将细胞沉淀重悬，按1 ∶ 5的比例接种至培养皿中或材料表面。
1.7. 细胞活力检测
rBMMSCs和RAW 264.7在钛片上培养2 d后收样，弃去培养基后PBS清洗3次，根据产品说明书配制含钙黄绿素-AM(calcein-AM)和碘化丙啶(propidium iodide，PI)的活/死细胞染液，使染液完全浸没钛片，避光室温染色45 min；弃去染液后PBS清洗3次；通过TE2000-U倒置荧光显微镜(Nikon，日本)搭配F3.0数字照相系统软件(NIS-Elements，日本)采集荧光图像，其中绿色荧光标记活细胞，红色荧光标记死细胞。实验重复3次。
1.8. 碱性磷酸酶染色及定量
rBMMSCs在钛片上培养7 d后收样，弃去培养基后PBS清洗3次，用95%乙醇在4 ℃条件下固定30 min。PBS清洗3次，根据产品说明书配制含5-溴-4-氯-3-吲哚基磷酸盐(5-bromo-4-chloro-3-indolyl phosphate，BCIP)和氯化硝基四氮唑蓝(nitro blue tetrazolium chloride，NBT)的碱性磷酸酶(alkaline phosphatase，ALP)染液，使染液完全浸没钛片，避光室温染色15 min。PBS清洗3次，相机拍照获得样本大体图像。采用二喹啉甲酸(bicinchoninic acid，BCA)法测定总蛋白含量，根据梯度浓度配制胎牛血清白蛋白(bovine serum albumin，BSA)标准品，并配制BCA工作液(A ∶ B体积比为50 ∶ 1)，使用酶标仪在波长570 nm处检测光密度值，根据配制好的BSA标准品的光密度值绘制标准曲线，并计算样品细胞总蛋白浓度。使用碱性磷酸酶检测试剂盒进行ALP活性定量，将显色底物充分溶解混匀在检测缓冲液中，分别加入待测样品及标准品，检测波长为405 nm处的光密度值，并结合上述测得的细胞总蛋白浓度计算ALP活性。实验重复3次。
1.9. 茜素红染色及定量
rBMMSCs在钛片上培养14 d后收样，弃去培养基后PBS清洗3次，用95%乙醇在4 ℃条件下固定30 min。去离子水清洗3次，根据产品说明书配置1%(质量分数)茜素红(alizarin red S，ARS)染液，使染液完全浸没钛片，室温染色15 min。去离子水清洗3次，相机拍照获得样本大体图像。1%(质量分数)十六烷基吡啶溶解后，在波长490 nm处检测光密度值进行定量。实验重复3次。
1.10. 实时荧光定量逆转录PCR
TRIzol法提取细胞总mRNA后逆转录合成cDNA，以SybrGreen作为荧光染料进行实时荧光定量逆转录PCR(reverse transcription quantitative real-time PCR，RT-qPCR)，检测成骨相关基因和巨噬细胞极化相关基因mRNA的表达水平，所用引物序列见表 1。采用ΔΔCt法分析数据，以Gapdh作为内参基因。
表 1.
实时荧光定量逆转录PCR引物序列
Prime sequences used for reverse transcription quantitative real-time PCR
| Gene | Forward primer (5′ to 3′) | Reverse prime (5′ to 3′) |
| Gapdh, glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase; Alp, alkaline phosphatase; Runx2, runt-related transcription factor 2; Ocn, osteocalcin; Osx, osterix; Tnfa, tumor necrosis factor-alpha; Inos, inducible nitric oxide synthase; Cd206, macrophage mannose receptor 1; Arg1, arginase-1; | ||
| (rat) Gapdh | TCTTGTGCAGTGCCAGCCTC | CAAGAGAAGGCAGCCCTGGT |
| (mouse) Gapdh | CCTCGTCCCGTAGACAAAATG | TGAGGTCAATGAAGGGGTCGT |
| (rat) Alp | TCGGGACTGGTACTCGGACA | CGCCACCCATGATCACATCG |
| (rat) Runx2 | GAACCACAAGTGCGGTGCAA | TGCTTGCAGCCTTAAATGACTCG |
| (rat) Ocn | TCAACAATGGACTTGGAGCCC | TGTGAGGCTCCAGGGGATCT |
| (rat) Osx | GGCCACCCATTGCCAGTAATC | AGCCATAGTGAGCTTCTTCCTGG |
| (mouse) Tnfa | CCCTCACACTCACAAACCACC | CTTTGAGATCCATGCCGTTG |
| (mouse) Inos | CACCTTGGAAGAGGAGCAACTAC | GAGCAAAGGCGCAGAACTGA |
| (mouse) Cd206 | TACTTGGACGGATAGATGGAGG | CATAGAAAGGAATCCACGCAGT |
| (mouse) Arg1 | ATCAACACTCCCCTGACAACCA | TTCCATCACCTTGCCAATCC |
1.11. 统计学分析
应用SPSS 26.0进行统计分析。组间比较采用单因素方差分析(one-way ANOVA)，分析前对数据进行正态性检验和方差齐性检验。当满足正态分布及方差齐性时，采用Tukey法进行组间两两比较，P＜0.05为差异有统计学意义。所有实验数据均以3次重复结果的均数±标准差来表示。
2. 结果
2.1. SePU修饰钛材料的表面接触角变化
根据SePU与钛的亲水性不同，分别测定SePU 1 g/L、SePU 3 g/L、SePU 5 g/L三个实验组和纯钛组的表面接触角，检测SePU是否可以通过浸泡方式成功修饰到钛片表面。由于SePU本身亲水性不佳，修饰后的各实验组钛表面接触角均有一定增加，且随浸泡浓度的增加而更为显著(图 2)。由接触角结果可得，SePU已成功修饰到钛片表面，修饰后钛片接触角平均值在60°以下，提示修饰钛片依然具有良好的亲水性。
图 2.
不同浓度SePU溶液修饰钛的表面接触角
Surface contact angles of titanium modified with different concentrations of SePU
A, images of surface contact angles; B, quantitative statistics. Ti, titanium; SePU, selenium-containing polyurethane.
2.2. SePU修饰钛材料对rBMMSCs及RAW 264.7无明显细胞毒性
以纯钛作为对照，对SePU修饰钛片上培养2 d的细胞用Calcein-AM/PI进行活/死细胞染色，研究SePU修饰钛材料对rBMMSCs和RAW 264.7细胞活性的影响。结果可见rBMMSCs(图 3A)和RAW 264.7(图 3B)各组绝大部分均为活细胞，仅有少量死细胞，细胞存活率无明显差异，说明SePU修饰的钛材料无明显细胞毒性，不会影响其表面培养的rBMMSCs和RAW 264.7的细胞活性。
图 3.
不同浓度SePU修饰钛材料表面培养细胞的活/死染色
Live-dead staining of cells cultured on the surface of SePU-modified titanium materials with different concentrations
A, rBMMSCs; B, RAW 264.7. rBMMSCs, rat bone marrow mesenchymal stem cells; Ti, titanium; SePU, selenium-containing polyurethane.
2.3. SePU修饰钛材料促进rBMMSCs成骨分化
对培养7 d后的rBMMSCs进行ALP和ARS染色及定量。ALP染色结果可见，与纯钛组相比，各浓度SePU修饰钛片染色均较深，其中又以SePU 3 g/L最深(图 4A)。ARS染色结果可见，各浓度SePU修饰钛片组较纯钛组均染色更深，且矿化结节生成增多，其中以SePU 3 g/L的矿化结节生成最为显著(图 4B)。ALP活性定量结果与染色结果一致，各浓度SePU修饰钛组与纯钛对照组差异显著，其中SePU 3 g/L组活性最高，差异具有统计学意义(P < 0.001，图 4C)。ARS定量结果与染色结果趋势一致，SePU 3 g/L与对照组的差异具有统计学意义(P < 0.001，图 4D)。以上结果初步证明，SePU修饰钛材料可促进rBMMSCs的成骨分化。
图 4.
不同浓度SePU修饰钛表面培养rBMMSCs的成骨分化染色及定量
Osteogenic differentiation staining and quantification of rBMMSCs cultured on SePU-modified titanium surfaces with different concentrations
A, ALP staining; B, ARS staining; C, ALP quantification; D, ARS quantification. rBMMSCs, rat bone marrow mesenchymal stem cells; ALP, alkaline phosphatase; ARS, alizarin red S; Ti, titanium; SePU, selenium-containing polyurethane.
2.4. rBMMSCs在SePU修饰钛材料培养后成骨相关基因的表达
通过RT-qPCR检测钛片上培养7 d时成骨相关标志基因的表达情况，进一步确认SePU修饰钛对rBMMSCs成骨分化的作用。结果表明Alp基因的表达(图 5A)与ALP染色结果趋势相似，SePU修饰钛较纯钛对照组相比可促进rBMMSCs的成骨分化，其中以SePU 3 g/L上升最为显著(P < 0.001)。Runx2(图 5B)、Ocn(图 5C)、Osx(图 5D)基因表达情况与Alp基因表达的趋势一致，SePU修饰钛较纯钛表达升高，以SePU 3 g/L的上升最明显，其表达差异具有统计学意义。
图 5.
不同浓度SePU修饰钛表面培养rBMMSCs的成骨相关基因表达
Expression of osteogenesis-related genes in rBMMSCs cultured on SePU-modified titanium surfaces with different concentrations
A, Alp; B, Runx2; C, Ocn; D, Osx. rBMMSCs, rat bone marrow mesenchymal stem cells; Ti, titanium; SePU, selenium-containing polyurethane.
2.5. RAW 264.7在SePU修饰钛材料培养后巨噬细胞极化相关基因的表达
同时利用RT-qPCR检测钛片上培养4 d时巨噬细胞极化相关基因的表达情况，探究SePU修饰钛对RAW 264.7巨噬细胞极化的影响。结果可见，与纯钛相比，SePU 3 g/L组M1型极化相关基因Tnfa (图 6A)和Inos(图 6B)的表达均有显著降低(P < 0.05)；相反，SePU 3 g/L组M2型极化相关基因Cd206 (图 6C)和Arg1 (图 6D)的表达均有显著升高(P < 0.001)。由此可知，SePU修饰钛材料可以抑制RAW 264.7巨噬细胞向M1型极化，促进其向M2型极化，表明SePU修饰钛材料具有抑制炎症的作用。
图 6.
不同浓度SePU修饰钛表面培养RAW 264.7的极化相关基因表达
Polarization-related gene expression of RAW 264.7 cells cultured on SePU-modified titanium surfaces with different concentrations
A, Tnfa; B, Inos; C, Cd206; D, Arg1.; Ti, titanium; SePU, selenium-containing polyurethane.
3. 讨论
钛植入物在临床中应用广泛，但其生物活性不足，植入后炎症反应显著，且在高风险患者(如全身疾病患者)中植入物失败率较高，这些问题仍是困扰临床医生的难题。通过改变表面形貌或添加涂层对钛植入物进行表面修饰，有望缓解上述临床难题。与软组织愈合速度快不同，骨组织愈合速度缓慢，钛植入物常用作占位、支撑以维持正常生理活动，例如：股骨植入物维持股骨形态，恢复行走功能；口腔种植体模拟牙根，为修复体提供支持，恢复咀嚼功能；人工钛关节替换损伤关节，维持关节功能。然而，钛植入物作为异种植入物，不可避免地会引起人体免疫系统的一系列反应，加之手术创伤可能引入的细菌等，感染和炎症的有效控制成为了钛植入物长期保持的先决条件。因此，能提高生物活性、促进骨整合、降低炎症反应的钛表面修饰可能是提高钛植入物长期成功率的潜在方法。
人体必需的微量元素硒，是硒代半胱氨酸合成的必需成分，由于其优异的氧化还原性能，含硒生物材料已在抗肿瘤[15]、抗菌[16]、抗炎[17]等领域有了广泛研究，然而含硒生物材料在骨骼相关疾病的治疗中还未被广泛应用。硒是谷胱甘肽过氧化物酶(glutathione peroxidase，GPX)的重要组成成分，GPX能够清除体内的自由基，减少氧化应激对细胞的损伤。这种保护作用有助于成骨细胞的正常增殖和分化，促进骨组织的生长和修复[18]。
本研究中，修饰后钛表面的亲水性较未修饰的纯钛表面略有下降，且高浓度SePU浸泡修饰钛片的亲水性更差，其原因可能是由于高分子结构中亲疏水性的影响。另一方面，修饰前后钛表面接触角的变化也间接佐证了SePU已成功修饰于钛表面。尽管，表面亲水的钛植入物可以促进骨结合和软组织封闭，提高种植体成功率。有研究表明，相比非亲水性表面，亲水性表面更利于成骨细胞的黏附和增殖，能促进骨组织的再生和修复，从而缩短了植入物与骨组织的结合时间。本研究为满足钛植入物表面亲水性的要求，通过在高分子链上添加亲水基团增加SePU本身的亲水性，本研究中所使用的SePU是由含硒基团和亲水基团按1 ∶ 3比例组成的含硒高分子，经实验证明其对细胞黏附没有产生不良影响。另外，本团队研究发现SePU可以通过硒与钛形成化学配位键，相较于依靠物理吸附与基底结合的涂层，具有良好的结合力[19]。
在骨组织的损伤后修复过程中，间充质干细胞作为骨形成阶段的关键细胞，会定向分化为骨原细胞，进一步经过前成骨细胞，最终发育为成熟的成骨细胞，促进钙盐沉积及矿化过程[20]。本研究发现，在SePU修饰的钛表面培养rBMMSCs和RAW 264.7并不会影响其细胞活性。Alp是早期成骨标志基因，其促进细胞的成熟及钙化，本研究中rBMMSCs的ALP活性在SePU修饰钛表面显著增强，并促进骨基质的矿化，矿化结节显著增多。与未修饰的纯钛组相比，3 g/L SePU修饰钛表面培养的rBMMSCs早期成骨标志物Runx2的表达明显增加，标志着间充质干细胞向成骨细胞分化增多；骨组织特异性标志物Ocn的表达明显增加，表明成骨细胞功能上更加成熟；成骨细胞特异性转录因子Osx的表达明显增加，也证明成骨细胞形成更多。
生物材料植入宿主体内的修复过程主要包括早期炎症控制和晚期组织修复[21]。巨噬细胞作为先天免疫的重要组成部分，主要通过M1和M2两种表型参与调节免疫、促进组织愈合等生理过程。M1型巨噬细胞在初始阶段通过释放如白细胞介素-1β、肿瘤坏死因子-α等促炎细胞因子，促进炎症反应以清除受损组织。而M2型巨噬细胞则主要负责愈合和再生过程，释放白细胞介素-10、转化生长因子-β等抗炎细胞因子，促进细胞增殖、分化和组织修复[22]。巨噬细胞作为免疫系统的重要组成部分，不仅在调控炎症方面，也在骨代谢中发挥关键作用[23]。在成骨过程中，巨噬细胞与间充质细胞相互作用，通过释放生长因子促进成骨细胞形成[24]。与骨髓基质细胞共培养时，巨噬细胞能增强ALP功能和Ⅰ型胶原蛋白水平，进一步促进成骨分化[25]。本研究中，与未修饰钛相比，关键促炎因子Tnfa在SePU修饰钛表面培养的RAW 264.7中的表达显著下降，表明细胞内炎症反应减弱；M1型巨噬细胞标志物Inos的表达降低，表明M1向极化的细胞减少。此外，M2型巨噬细胞标志物Cd206、Arg1的表达显著升高，表明M2型巨噬细胞极化增多，促进抗炎反应以及组织修复。
本研究仍存在一定局限性。首先，本研究主要基于体外细胞实验评价SePU修饰钛材料的成骨及免疫调控性能，尚不能完全模拟体内复杂的骨修复微环境，其促进骨整合及调控炎症反应的长期效果仍需通过动物实验进一步验证。其次，本研究主要从细胞表型及相关基因表达水平评价SePU的生物学效应，其调控巨噬细胞极化及促进成骨分化的具体分子机制尚未深入阐明。未来将结合动物模型及分子生物学实验，进一步探究SePU促进骨整合的作用机制，为其临床转化提供更加充分的理论依据。
综上所述，本研究发现，SePU可修饰于钛表面，rBMMSCs的成骨标志物ALP及矿化结节染色ARS加深，成骨相关基因表达增加，证明SePU修饰钛可促进rBMMSCs的成骨分化；RAW264.7的M1型极化相关基因表达降低，M2型极化相关基因表达增加，证明SePU修饰钛可促进巨噬细胞向M2型极化。SePU修饰钛材料的成功制备，有望应用于骨科植入物及口腔种植体中，进而研发新型植入材料，满足临床患者需要。
Funding Statement
国家自然科学基金(82271032)、北京市自然科学基金(7232221)
Supported by the National Natural Science Foundation of China (82271032), Beijing Natural Science Foundation (7232221)
Footnotes
利益冲突 所有作者均声明不存在利益冲突。
作者贡献声明 翟墨：提出研究思路，设计研究方案，收集、分析、整理数据，撰写论文；白晓强、付杨：收集、分析、整理数据；许华平：实验设计、材料合成、数据分析；周永胜、吕珑薇：总体把关、审定论文并提供资金支持。所有作者均参与论文修改，并对最终文稿进行审读和确认。
Contributor Information
周 永胜 (Yongsheng ZHOU), Email: kqzhouysh@hsc.pku.edu.cn.
吕 珑薇 (Longwei LV), Email: lvlw@bjmu.edu.cn.
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