十肽对变异链球菌作用的差异蛋白质组学研究

Abstract

Objective

To compare the protein profiles between decapeptide-treated and untreated planktonic cells of Streptococcus mutans (S. mutans) by differential proteomic analysis to determine and identify the key proteins.

Methods

In our previous study, we investigated decapeptide (KKVVFKVKFK–NH₂), which was a novel adenosine monophosphate. Compared with other oral pathogens tested, decapeptide had a preferential antibacterial activity against S. mutans. It also inhibited S. mutans biofilm formation and reduced the one-day developed biofilm. In the present study, we first synthesized decapeptide, and then compared the protein profiles between decapeptide-treated and untreated planktonic cells of S. mutans by two-dimensional gel electrophoresis and matrix-assisted laser desorption ionization time-of-flight mass spectrometry. We also verified different expressions of key protein enolase in the protein level.

Results

The results showed that decapeptide altered the protein expression of planktonic S. mutans. These proteins were functionally involved in carbohydrate degradation by glycolysis, protein folding, conjunction, transport, translation, adenosine triphosphate binding, protein binding, sequence-specific DNA binding, transcription factor activity, and two-component response regulator activity. Western blot results showed that enolase protein expression decreased obviously in decapeptide-treated cells of S. mutans.

Conclusion

The protein expression of S. mutans significantly changed after synthetic antimicrobial decapeptide treatment, suggesting that decapeptide may present a preferential effect on oral caries by changing the expression of certain key proteins, such as enolase protein.

变异链球菌是目前公认的致龋菌。十肽是从多肽库中筛选出来的一种人工合成的新型抗菌肽，具有较强的抗微生物活性，在作用过程中不产生耐药性。本课题组在前期研究[1]中发现，该抗菌肽对口腔常见感染性疾病主要致病菌有不同的抑菌性能，尤其对变异链球菌有较强的抑菌作用，并能抑制变异链球菌生物膜的形成，以及破坏已形成的24 h生物膜。

差异蛋白质组学是蛋白组学研究的一个重要分支，主要通过比较分析不同状态下蛋白质的表达图谱，探讨蛋白质的作用模式、功能机制和调节控制等[2]–[3]。本研究将利用以双向电泳质谱分析棗生物信息学技术为核心的差异蛋白质组学技术监测人工合成的新型抗菌肽十肽对变异链球菌蛋白的作用，寻找并鉴定出其中具有标志性作用的差异蛋白质点，为从蛋白途径探索十肽抑菌防龋的作用机制奠定基础。

1. 材料和方法

1.1. 材料

1.1.1. 实验菌株

实验菌株为变异链球菌ATCC 25175，由四川大学口腔疾病研究国家重点实验室提供。

1.1.2. 仪器

超声破碎仪（Sonics&Materials公司，美国），Bruker-Daltonics AutoFlex TOF-TOF LIFT质谱仪（Bruker公司，德国），蛋白垂直电泳仪和一向等电聚焦电泳仪IPGphor（Bio-Rad公司，美国），二向垂直电泳系统ProteinⅡ和Image Scanner扫描仪（Amersham Biosciences公司，澳大利亚），光学显微镜（Nikon公司，日本），iBLOT蛋白转印仪（Invitrogen公司，美国）。

1.1.3. 试剂

固相pH梯度（immobilized pH gradient，IPG）胶条（Amersham Biosciences公司，瑞典），BCA蛋白浓度测定试剂盒（Thermo Scientific公司，美国），质谱级胰蛋白酶（Promega公司，美国），各类抗体均为美国Abcam公司产品，两性表面活性剂丙磺酸内盐{3-[(3-Cholamidopropyl)dimethylammonio] propanesulfonate，CHAPS}、二硫苏糖醇（dl-dithiothreitol，DTT）、碘乙酰胺均为美国Bio-Rad公司产品，其余主要试剂均为美国Sigma公司产品。

1.2. 实验方法及步骤

1.2.1. 变异链球菌总蛋白的提取

依据十肽的氨基酸序列，用人工固相多肽合成法体外合成十肽并行质谱鉴定（由成都诚诺新技术有限公司合成并鉴定）。合成十肽的氨基酸序列为KKVVFKVKFK-NH₂。

实验分为实验组（0.25 g·L⁻¹十肽处理组）和对照组（PBS处理组）。配制细胞裂解液：2 mol·L⁻¹硫脲，8 mol·L⁻¹尿素，4% CHAPS（pH值8.0），1%DTT，终浓度1 mmol·L⁻¹苯甲基磺酰氟（pheylmethyl-sulfonyl fluoride，PMSF），终浓度2 mmol·L⁻¹乙二胺四乙酸（ethylene diamine tetraacetic acid，EDTA），1 mmol·L⁻¹两性电解质，加MilliQ水，定容至10 mL。挑取变异链球菌单菌落接种于300 mL TPY液体培养基，培养24 h后离心收集细菌沉淀，反复冻融3次，加入1 mL细胞裂解液，超声破碎仪冰浴下破碎细胞壁（功率11 kHz；作用4 s，暂停4 s，共84个循环），振荡（5×30 s，间隔1 min；冰浴），直到样品液较为澄清，取10 µL混悬液革兰染色涂片镜检，100倍油镜观察并采集图像。加入9倍体积预冷无水乙醇沉降样品液中的蛋白质，离心后收集沉淀。按照Brandford方法，使用BCA蛋白浓度测定试剂盒测定蛋白质的质量浓度，分装后-70 °C保存备用。

1.2.2. 双向电泳（two dimensional electrophoresis，2-DE）

取200 µg细菌蛋白样品溶于水化上样液（2 mol·L⁻¹硫脲，7 mol·L⁻¹尿素，4%CHAPS，50 mmol·L⁻¹ DTT，5%甘油，10%异丙醇，1%溴酚蓝），取出IPG预制胶条（18 cm，pH为4~7），加样，水化（50 V，20 °C，12~16 h），进行第一向等电聚焦（isoelectrofocusing，IEF）电泳，参数设置：20 °C，最大电流0.05 mA，250 V，1 h；500 V，2 h；500~3 000 V，1 h；3 000 V，3 h；3 000~8 000 V，3 h；8 000 V，10 h。IEF电泳结束后，进行IPG平衡，将平衡后的胶条转移至12%的聚丙烯酰胺凝胶上端，进行第二向十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE），起始时用低电流，浓缩胶为13 mA，分离胶为20~30 mA，待溴酚蓝指示剂达到底部边缘时停止电泳。以3张变异链球菌标准株菌体总蛋白2-DE图谱作比较，蛋白质斑点匹配率平均为90％。

1.2.3. 银染

银染的主要步骤：10%冰醋酸和40%乙醇固定2×15 min，75 mL 30%乙醇、0.5 g硫代硫酸钠、17 g乙酸钠和28.2 g三水乙酸钠致敏30 min，MilliQ水漂洗3×5 min，0.625 g AgNO₃和100 µL 37%甲醛银染20 min，6.25 g Na₂CO₃和50 µL 37%甲醛显色4 min，3.65 g EDTA终止10 min，漂洗。

1.2.4. 图像采集和分析

使用ImageMaster 2D Platinum 5.0专用软件对凝胶扫描图像进行分析，主要步骤为：蛋白质点检测，背景消减，归一化处理，蛋白质点匹配。参数设置选择说明（以3块胶做平均胶为例）：0为3块胶上都出现的点，1为在任意2块胶上同时出现的点，2为任意1块胶上出现的点。

1.2.5. 质谱分析及生物信息学鉴定

经软件分析后平均上调或下调量大于等于3倍的蛋白质点用于质谱分析。切取下的胶点进行胶内消化酶解，酶解产物溶于0.1%三氟乙酸，取1 µL样品点样，再取1 µL溶于70%乙腈和0.1%三氟乙酸中的饱和α-氰基-4-羟基肉桂酸基质覆盖于样品上，使用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱分析法（matrix-assisted laser desorption ionization time-of-flight mass spectrometry，MALDI-TOF-MS）进行测定，获取肽质量指纹图谱（peptide mass fingerprinting，PMF），并将PMF图片转移到FlexAnalysis软件，进行数据库搜索。利用Matrix Science的Mascot软件搜索NCBInr数据库，进行生物信息学分析，搜索条件为：肽片段质量最大误差控制在±10⁻⁴，酶解片段不完全选择为1个，物种来源为细菌类[4]–[5]。

1.2.6. Western blot技术检测差异蛋白烯醇酶在变异链球菌中的表达

如前法提取变异链球菌总蛋白，制备凝胶，进行SDS-PAGE电泳。使用iBLOT的标准转膜装置，将凝胶转至聚偏二氟乙烯（polyvinylidene fluoride，PVDF）膜上，同时将凝胶用考马斯亮蓝染色观察转移效果，5%牛奶封闭膜1~2 h，充分洗涤后，孵育一抗（按1∶100稀释成品兔多克隆抗体），4 °C摇床过夜，β-actin作内参。孵育二抗（按1∶1 000稀释抗兔的辣根过氧化物酶标记的二抗），4 °C孵育1 h。将化学发光试剂盒中的A液与B液以体积比1∶1混匀（总体积为3 mL），加入杂交袋，室温避光孵育5 min，吸干显色液。最后曝光及洗片，放置在凝胶成像仪上记录并分析结果。

2. 结果

2.1. 十肽处理前后的变异链球菌总蛋白2-DE结果

使用裂解液联合超声破碎法制备变异链球菌总蛋白，经革兰染色镜检发现，未经裂解处理的变异链球菌为革兰染色阳性球菌，呈长链状排列（图1左），处理后的细菌呈分散状态，在染色阳性菌体周围出现染色阴性的菌体碎片（图1右）。

图 1. 液体培养基中变异链球菌的正常形态（左）及加入裂解 液过夜后超声破碎84个循环后变异链球菌的形态（右） 格兰染色 × 100.

Fig 1 The normal form of Streptococcus mutans in liquid culture medium (left) and in lysate overnight with 84 ultrasound cycles (right) Gram stain × 100

BCA法测定十肽作用前变异链球菌总蛋白的最终质量浓度为3.8 g·L⁻¹，作用后的最终质量浓度为3.6 g·L⁻¹。将十肽作用前后的变异链球菌总蛋白提取物进行2-DE，凝胶银染，所得的2-DE凝胶图像见图2。使用2-DE技术，十肽作用前样品分离得到224个蛋白质点，作用后得到225个蛋白质点，其中相匹配的蛋白质点为209个。图2左示十肽作用前样品蛋白表达图谱，图2右示十肽作用后样品蛋白表达图谱，图中数字代表最终鉴定出的10种蛋白质，其中 8、9号蛋白经鉴定为同一种蛋白质。

图 2. 十肽作用前后变异链球菌总蛋白提取物2-DE银染图.

Fig 2 Silver stained 2-DE protein profiles of Streptococcus mutans growing before and after decapeptide treatment

左：十肽作用前；右：十肽作用后；图中数字1~11代表最终鉴定出的10种蛋白质。

2.2. 十肽作用前后变异链球菌差异蛋白质谱鉴定结果

应用ImageMaster 2D Platinum 5.0软件对凝胶进行差异点分析，结果显示：十肽作用前后变异链球菌蛋白表达谱存在差异。MALDI-TOF-MS鉴定差异蛋白发现：有17个蛋白质点在十肽作用前后样品中均有表达，且表达差异大于3倍；有9个蛋白质点只在十肽作用前表达；有6个只在十肽作用后表达。进一步分析这些差异量均值大于3倍的32个蛋白质点，最终鉴定出10种蛋白质（表1），十肽作用后有3种表达上调，另外7种则表达下调。差异蛋白的主要功能包括降解碳水化合物（经糖酵解途径），蛋白质折叠、结合、运输及蛋白质翻译等。

表 1. 十肽作用后变异链球菌差异蛋白质谱鉴定结果.

Tab 1 Identification of the differentially expressed proteins in decapeptide-treated Streptococcus mutans

编号	序列号	蛋白质名称	相对分子质量/×105	等电点	蛋白质的主要功能
1	AAZ08339	6.0×104分子伴侣	5.551 9	4.70	三磷酸腺苷结合和蛋白结合
2	NP_721355	50S核糖体蛋白L10	1.765 6	4.87	核糖体合成和翻译
3	ZP_01053393	保守假定蛋白	2.004 0	9.04	未知
4	NP_721624	烯醇酶	4.688 6	4.67	经糖酵解途径导致的碳水化合物降解
5	ZP_01821355	分子伴侣GroEL	1.969 1	9.73	三磷酸腺苷结合和蛋白结合
6	YP_001889305	双组分转录调控蛋白	2.356 3	6.09	序列特异性DNA结合，转录因子活性，双组分反应调节活性
7	ZP_01126929	反应调节接收蛋白	1.663 0	5.38	双组分反应调节活性
8、9	P0C8Z2	外膜蛋白A	2.624 2	5.14	联合和运输
10	YP_282862	假定蛋白M5005_Spy_1499	2.045 8	4.48	蛋白质折叠与应激反应
11	NP_722307	30S核糖体蛋白S5	1.711 0	10.06	rRNA结合和翻译

注：1、2、3号表达上调，4~11号表达下调。

2.3. 蛋白水平验证烯醇酶在变异链球菌中的差异表达

十肽处理前后变异链球菌烯醇酶的Western blot验证结果见图3，4.7×10⁴处为目的条带，相对β-actin的表达量，十肽处理后烯醇酶的表达量明显低于十肽处理前。

图 3. 烯醇酶在十肽处理前后变异链球菌中的差异表达.

Fig 3 Effect of decapeptide on enolase protein expression in Streptococcus mu tans planktonic cells

a：十肽处理后；b：十肽处理前。

3. 讨论

目前，蛋白组学技术在口腔科学研究中的应用主要集中在致病微生物及口腔肿瘤方面[6]–[7]。差异蛋白组学的发展给龋病病因学研究带来了新的方法和思路，通过对致龋病原菌的蛋白质组学研究，观察不同生长条件下的蛋白表达变化，可进一步探讨这些蛋白质的作用模式、功能机制、调节控制以及它们之间的相互关系[8]。

本实验共分离出200多种蛋白，虽然数量较变异链球菌基因的1 963个开放阅读框差异较大，但在实际情况中，细菌在功能状态下只表达部分基因而非全部基因，加之一些相对分子质量过大或过小的蛋白质在现有的2-DE技术之下的检出率也非常有限，一些低丰度和疏水性较强蛋白（尤其是内在的细胞膜蛋白）的检出率往往低于1%，还有一些极酸和极碱性区的蛋白以及高相对分子质量区的蛋白检出率也很低[4],[9]–[10]。

由于十肽具有阳离子残基及亲水性的特性，十肽的抗菌机制包括：1）十肽的双亲性α-螺旋结构上的正电荷与细菌细胞膜上负电荷之间通过静电吸引而结合并聚集在质膜上，打乱了质膜上的脂质和蛋白质原有的排列秩序，导致细胞膜的结构紊乱，从而杀灭细菌；2）十肽通过与细菌生物膜表面的膜受体的疏水性作用，破坏细菌生物膜；3）通过溶解真菌细胞，破坏其细胞膜和毒力因子，以及抑制真菌的表型转换来促进真菌细胞死亡和破坏生物膜[11]–[13]。在本实验的前期研究[1]–[2]中也证实，十肽可通过抑制并杀灭生物膜内的细菌，改变生物膜的结构即改变细胞通透性，破坏细菌细胞膜而实现对变异链球菌生物膜的抑制作用。

双组分转录调控蛋白和反应调节接收蛋白是在本实验中发现的表达下调的蛋白，都具有双组分调控的功能。双组分调控系统（two component regulatory system，TCSs）是原核生物中重要的调控系统，广泛存在于各类微生物中。细菌常常通过TCSs来感受外界环境的压力刺激，以调控细胞的生长和代谢[14]–[15]。有学者[16]在表皮葡萄球菌全基因组测序的基础上，对表皮葡萄球菌TCSs进行生物信息学分析发现，大部分TCSs可能具有参与调控细菌生长，生物膜形成，毒力因子表达等的重要生物学功能。本实验发现，十肽处理组中TCSs蛋白的表达受到抑制，据此不难推测，十肽可能通过抑制TCSs的功能从而调节细菌和生物膜生长，但其具体机制尚待进一步研究。

此外，本实验中最值得引起关注的一类蛋白是在十肽处理后表达下调的烯醇酶。该酶属于裂解酶家族中的水裂解酶，是糖酵解系统中的一种重要的酶，可以使碳氢键发生断裂。龋病的发生是由于致龋菌酵解碳水化合物代谢产酸，最终导致牙面脱矿而引起。糖酵解产酸是致龋菌导致硬组织龋坏最为关键的代谢过程，在此过程中，烯醇酶被激活，催化2-磷酸甘油酸生成磷酸烯醇式丙酮酸，这一过程是碳水化合物代谢中的重要环节。快速的糖酵解过程可以导致pH值在几分钟内迅速降至4.5。在以往对氟化物防龋机制的研究[17]中发现，氟化物能竞争性地抑制烯醇酶活性，从而阻止糖分解产酸的过程，也就中止了龋坏的过程。另外，在低pH值的细胞表面，烯醇酶可与甘油三磷酸脱氢酶发生联合作用，在生物膜的形成中表达上调[18]–[19]。由本实验不难推测，十肽可能通过竞争性地抑制烯醇酶的表达来阻断变异链球菌的糖酵解途径。

本研究发现，TCSs和烯醇酶在十肽处理后表达特异性降低，据此推测，十肽可能通过抑制TCSs的功能和烯醇酶的表达以抑制龋病的发生和发展。

Funding Statement

[基金项目] 四川省科技支撑计划基金资助项目（2008FZ0173）