Utilisation des bactéries lactiques comme vecteurs vaccinaux

Summary

Today, sufficient consistent data are available to reinforce the interest of the use of Lactic Acic Bacteria (LAB), particularly lactococci and lactobacilli strains, to develop novel mucosal vaccination strategies. LAB are Gram positive bacteria exploited since the highest Antiquity by humans to produce fermented foods. They are thus good candidates to develop novel oral vectors and constitute attractive alternatives to vaccinal strategies based on attenuated pathogens which could induce healthy risks. Here, we summarized the most recent researches performed on the use of LAB as live vaccine delivery vectors.

1. Introduction

Les bactéries lactiques (BL) sont des bactéries à Gram positif qui produisent de l’acide lactique comme produit principal de leur métabolisme. Elles regroupent 12 genres bactériens dont les plus étudiés sont Lactobacillus, Lactococcus, Streptococcus, Enterococcus, Pediococcus et Bifidobacterium [1]. Les BL sont largement utilisées dans des procédés industriels de fermentation agro-alimentaire et certains genres comme les lactobacilles ou les bifidobactéries sont des bactéries commensales qui font partie du microbiote intestinal [2]. Les BL sont généralement reconnues comme étant sans danger par les autorités (microorganismes Generally Recognized As Safe) [3]. Lorsqu’elles sont ingérées vivantes en grandes quantités, elles peuvent survivre dans le tractus digestif de l’hôte, où elles sont susceptibles d’exercer diverses actions bénéfiques sur l’hôte après leur ingestion (ex. amélioration de la digestion des fibres, stimulation du système immunitaire et prévention ou traitement des diarrhées) [4]. Du fait de leur parfaite innocuité et de leurs effets probiotiques (pour certaines), les BL sont de plus en plus étudiées pour le développement de nouvelles stratégies de vaccination mucosale [5].

Actuellement, les vaccins mucosaux en cours de développement sont basés sur l’utilisation de microorganismes pathogènes atténués dont l’utilisation présente des risques sanitaires [5]. Comme les BL sont inoffensives ou même bénéfiques (certaines espèces), elles représentent une alternative intéressante aux stratégies basées sur des pathogènes atténués pour l’administration mucosale de vaccins ou médicaments [5]. En effet, de tels vecteurs vivants permettent l’induction d’une immunité au niveau des muqueuses qui constituent la première ligne de défense contre des agents pathogènes. De plus, ces vecteurs, plus faciles à administrer et moins coûteux à produire que les vaccins injectables, sont tout à fait adaptés à des campagnes massives de vaccination dans les pays en voie de développement.

2. Immunité muqueuse et vaccination

Les agents pathogènes qui infectent l’organisme par les muqueuses représentent les causes majeures des maladies infectieuses à travers le monde. Le moyen le plus efficace de limiter la morbidité et la mortalité induites par ces agents est la vaccination. Les muqueuses, des tractus gastro-intestinal, respiratoire et urogénital, représentent une surface de contact d’environ 400 m² avec le milieu extérieur. Ces surfaces muqueuses comportent un système immunitaire très développé : MALT (mucosa associated lymphoid tissue), constitué d’environ 80% des cellules immunitaires de l’organisme et considéré ainsi comme le plus important système lymphoïde chez l’homme [6, 7]. Ces propriétés particulières ont suscité l’intérêt d’exploiter une approche vaccinale muqueuse pour lutter contre les agents infectieux dès leur pénétration dans l’organisme.

Les vaccins muqueux offrent l’avantage d’induire une réponse immunitaire à la fois muqueuse et systémique. Au contraire, les vaccins injectables traditionnels génèrent une bonne immunité systémique mais n’induisent pas ou très peu d’immunité muqueuse [8]. Les vaccins muqueux sont a priori dépourvus d’effets secondaires parce qu’ils évitent le contact direct entre les composants complexes des vaccins (ex. adjuvants, potentiellement dangereux), et la circulation systémique. D’un point de vue pratique, ils sont faciles à administrer (spray nasal ou par voie orale par exemple), d’un moindre coût et donc plus accessibles aux pays en voie de développement [8]. Cependant, en dépit de ces avantages, l’efficacité de l’immunisation au niveau des muqueuses est limitée par la dégradation des antigènes, l’adsorption sur les muqueuses de l’hôte et l’utilisation de systèmes d’expression inadaptés. Dans les dernières années, de nouvelles stratégies d’immunisation par voie mucosale ont été développées sur la base de pathogènes atténués (bactéries et virus) exprimant des molécules d’intérêt médical [9]. Cependant, le principal risque lié à l’utilisation de ces systèmes est un retour à l’état pathogène de ces microorganismes interdisant leur application à des patients immunodéprimés, des personnes âgées et des enfants [10]. L’utilisation de BL en tant que vecteurs d’antigènes constitue une stratégie plus sûre et moins onéreuse. En plus, ces bactéries ont déjà été utilisées avec succès pour exprimer et délivrer plusieurs protéines d’intérêt médical [5, 11, 12].

3. Brève description des différents vecteurs à administration muqueuse

Un vecteur idéal à administration muqueuse doit pouvoir : i) préserver les antigènes des dégradations, ii) cibler le système immunitaire local (ex. cellules épithéliales ou cellules dendritiques susceptibles de capturer l’antigène) et iii) stimuler de façon appropriée l’immunité innée et spécifique afin d’induire une immunité spécifique adaptée. Les récentes avancées en biotechnologie et une meilleure compréhension du système immunitaire ont rendu possible aujourd’hui la conception des nouveaux vecteurs à administration muqueuse [13]. De tels vecteurs comprennent : i) des systèmes inertes dans lesquels divers complexes lipidiques, nanoparticules, microsphères ou polymères solubles enrobent les antigènes ou l’ADN nu [14], [15], [16], ii) des vecteurs viraux (adénovirus, virus de la rougeole ou poxvirus) [17], [18], [19], [20], [21], [22] ou des vecteurs bactériens tels que des bactéries pathogènes atténuées (dérivés de Salmonella typhi, Bordetella pertussis, etc.) ou des bactéries lactiques et/ou commensales [5, 11, 12, 23, 24] ( tableau I ). Toutefois, les vecteurs viraux et bactériens sont plus immunogéniques que les vecteurs inertes et représentent donc de meilleurs candidats pour induire une réponse immunitaire muqueuse et systémique. Parmi ces deux types de vecteurs à administration muqueuse (virus et bactéries), les génomes bactériens présentent l’avantage de pouvoir contenir plusieurs gènes hétérologues à la différence des vecteurs viraux dont le nombre des gènes hétérologues est limité par la taille de son génome beaucoup plus petit que les vecteurs bactériens. Ainsi, une bactérie recombinante peut produire différents antigènes permettant le développement des vaccins multivalents.

Tableau I.

Vecteurs bactériens utilisés en tant que vaccin vivant.

Vecteur bactérien	Référence
Pathogènes atténués
Mycobacterium bovis BCG	[25]
Listeria monocytogenes	[26]
Salmonella spp.	[27]
Vibrio cholera	[28]
Shigella spp.	[29]
Bordetella spp.	[30]
Bactéries non pathogènes
Streptococcus gordonii	[31]
Lactococcus lactis	[5]
Lactobacillus spp.	[32]
Staphylococcus spp.	[33]

4. Adjuvants muqueux

Un des problèmes majeurs rencontrés en vaccinologie est souvent la faible immunogénicité des antigènes utilisés. L’utilisation d’adjuvants telles que la toxine cholérique et l’entérotoxine d’Escherichia coli constitue une bonne solution ; ils sont aujourd’hui considérés comme les adjuvants muqueux les plus puissants connus à ce jour. Malheureusement, ces adjuvants très efficaces peuvent causer des diarrhées sévères chez l’homme et induire des réponses de type Th2 indésirables [34, 35]. Par ailleurs, le pouvoir adjuvant de cytokines est en cours d’évaluation et pourrait constituer une prochaine génération d’adjuvants [36, 37]. Parmi ces cytokines, l’interleukine-12 (IL-12) est une molécule stimulatrice du système immunitaire dont l’emploi s’est révélé très prometteur en co-administration avec un antigène [38]. De plus, l’IL-12 a été utilisée avec succès dans des immunothérapies contre certains cancers et son utilisation empêche le développement d’un état de tolérance contre l’antigène utilisé. Ce dernier point est très intéressant dans le cadre du développement de vaccins vivants car la persistance de l’antigène au niveau des muqueuses peut induire un état de tolérance non souhaité.

5. Bactéries lactiques comme vecteurs à administration muqueuse

La nécessité toujours actuelle de développer des vaccins plus sûrs, faciles à administrer et peu onéreux, a conduit à une recherche intense sur l’utilisation potentielle d’organismes vivants recombinants comme vecteurs d’antigènes protecteurs, administrables en particulier par voie locale. L’attention s’est donc tournée vers l’utilisation de BL à Gram-positif et commensales comme vecteurs d’antigènes [5]. Leur totale innocuité, alliée aux capacités de certaines d’entre elles à coloniser les cavités corporelles externes, désigne les BL, en particulier les lactobacilles, comme candidats de choix pour délivrer des antigènes vaccinaux au niveau des muqueuses. Ces bactéries présentent en outre l’avantage d’être aisément administrables par voie orale ou locale. L’évaluation du potentiel des BL en tant que vecteurs vivants de vaccination a été initiée il y a quelques années dans différents laboratoires dans le monde entier [5, 11, 12]. En plus de leur statut GRAS, de nombreux antigènes et cytokines ont été produits à ce jour chez différentes BL et l’administration mucosale de ces BL génétiquement modifiées chez la souris stimulent une réponse immunitaire à la fois muqueuse et systémique ( tableau II ).

Tableau II.

Antigènes et cytokines (adjuvants) exprimés chez les bactéries lactiques (BL).

Antigènes	Source	Vecteur	Potentiel	Référence
Bactériens
PA	Bacillus anthracis	Lb. casei	vaccin contre l’anthrax	[55]
		L. lactis	vaccin contre l’anthrax	[unpublished data]
LpA	Borrelia burgdorferi	Lb. plantarum	vaccin contre la maladie de Lyme	[56]
L7/L12	Brucella abortus	L. lactis	vaccin contre la brucellose	[57]
GroEL	Brucella abortus	L. lactis	vaccin contre la brucellose	[58]
TTFC	Clostridium tetani	L. lactis	vaccin contre le tétanos	[59]
		Lb. casei	vaccin contre le tétanos	[60]
		Lb. plantarum	vaccin contre le tétanos	[61]
β-toxin	Clostridium perfringens	L. lactis	vaccin contre C. perfringens type B et C	[62]
K99	Enterotoxigenic Escherichia coli (ETEC)	Lb. acidophilus	traitement contre la colibacillose entérique	[63]
SpaA	Erysipelothrix rhusiopathiae	L. lactis	vaccin contre le rouget du porc	[64]
UreB	Helicobacter pylori	L. lactis	vaccin contre Helicobacter	[65]
		Lb. plantarum	vaccin contre Helicobacter	[66]
Cag12	Helicobacter pylori	L. lactis	vaccin contre Helicobacter	[67]
FliC	Salmonella enterica serovar Enteritidis (SE)	Lb. casei	vaccin contre SE	[68]
PAc	Streptococcus mutans	L. lactis	vaccin contre les caries	[69]
M6	Streptococcus pyogenes	L. lactis	vaccin contre les caries	[70]
PsaA	Streptococcus pneumoniae	L. lactis	vaccin contre pneumocoques	[71]
		Lb. plantarum	vaccin contre pneumocoques	[72]
Pili	Streptococcus agalactiae GBS	L. lactis	vaccin contre GBS	[73]
Viraux
NSP4	Bovine coronavirus	L. lactis	vaccin contre coronavirus	[74]
SARS	Coronavirus	Lb. casei	vaccin contre SARS-CoV	[75]
Spike glycoprotein S	Coronavirus	Lb. casei	vaccins contre les gastro-entérites	[76]
EDIII	Dengue virus serotype 2	L. lactis	vaccine contre la dengue	[77]
V3	Human immunodefficiency virus (HIV-1)	L. lactis	vaccine contre l’HIV	[78]
E7	Human papillomavirus type-16 (HPV-16)	L. lactis	vaccine contre le cancer du col de l’utérus	[79]
		Lb. casei	therapie pour le cancer du col de l’utérus	[80]
		Lb. plantarum	therapie pour le cancer du col de l’utérus	[81]
		Lb. plantarum	therapie pour le cancer du col de l’utérus	[81]
L1	HPV-16	L. lactis	vaccin contre le cancer du col de l’utérus	[82]
		L. lactis	vaccin contre le cancer du col de l’utérus	[83]
		Lb. casei	vaccin contre le cancer du col de l’utérus	[84]
VP2 and VP3	Infectious bursal disease virus (IBDV)	L. lactis	vaccin contre coronavirus	[85]
Cap	Porcine circovirus type 2 (PCV2)	L. lactis	vaccin contre PCV2	[86]
VP2	Porcine parvovirus	Lb. casei	vaccin contre le parvovirus	[87]
VP7	Rotavirus	L. lactis	vaccin contre les rotavirus	[88]
Autres
MSP-1	Plasmodium yoelii	L. lactis	vaccin contre la malaria	[89]
MSA2	Plasmodium falciparum	L. lactis	vaccin contre la malaria	[90]
BLG	Bovine beta-lactoglobulin	L. lactis	traitement contre l’allergie	[91]
		Lb. casei	traitement contre l’allergie	[92]
Der p 5 allergen	Dermatophagoides pteronyssinus	Lb. acidophilus	traitement contre l’allergie	[93]
CWP2	Giardia lamblia	L. lactis	vaccin contre la giardiose	[94]
Cytokines
IL-2	Mus musculus	L. lactis	adjuvant pour vaccin contre le tétanos	[95]
IL-6	Mus musculus	L. lactis	adjuvant pour vaccin contre le tétanos	[95]
IL-10	Mus musculus	L. lactis	thérapie pour les colites	[96]
	Homo sapiens	L. lactis	thérapie pour la maladie de Crohn	[97]
IL-12	Mus musculus	L. lactis	adjuvant thérapie pour le cancer du col de l’utérus	[98]
		Lb. plantarum	adjuvant thérapie pour le cancer du col de l’utérus	[unpublished data]
IFN-ω	Mus musculus	L. lactis	traitement antiviral	[99]
IFN-γ	Mus musculus	L. lactis	traitement antiviral/anti-tumoral	[100]
	Sus scrofa	L. lactis	traitement antiviral/anti-tumoral	[101]
IFN-β	Homo sapiens	L. lactis	traitement antiviral/anti-inflammatoire	[102]
MIG/IP-10	Mus musculus	L. lactis	nouveau adjuvant muqueux	[103]
Leptin	Homo sapiens	L. lactis	nouveau adjuvant muqueux	[104]

Afin d’identifier l’espèce de bactérie permettant d’induire une protection à long terme, deux types de BL ont été étudiés selon qu’ils persistent (e.g. certaines espèces de lactobacilles) ou non (e.g. Lactococcus lactis) dans le tube digestif. Le mode de production de l’antigène par la bactérie recombinante conduisant au meilleur effet a été examiné également. La production d’un antigène par une BL peut être envisagée (en théorie) dans trois différentes localisations cellulaires : dans la cellule, à sa surface, ou sécrétée [11]. L’expression dans ces trois localisations a pour but une optimisation des interactions protéine-hôte et chaque localisation présente des avantages et des inconvénients selon l’application. Une forme cytoplasmique permet de protéger la protéine des environnements extérieurs drastiques (tel que les jus gastriques dans l’estomac) mais une lyse cellulaire est nécessaire pour délivrer la protéine. La forme sécrétée permet une meilleure diffusion de la protéine à l’extérieur de la bactérie et donc une meilleure accessibilité à l’hôte. Elle est en revanche plus exposée à la protéolyse. La forme ancrée de la protéine pourrait constituer un compromis entre les deux formes précédentes. La présence de la protéine à la surface de la bactérie permettrait une meilleure accessibilité de l’hôte pour la protéine tout en limitant les problèmes de protéolyse de la protéine protégée par la paroi de la bactérie. Dans ce contexte, plusieurs travaux ont été réalisés pour comparer la production de différents antigènes chez les BL en utilisant ces trois localisations et l’évaluation de leurs effets immunomodulateurs [39], [40], [41]. Ces études ont montré que les réponses immunitaires les plus élevées sont obtenues avec des antigènes exposés à la surface des BL. Ainsi, la plupart des études récentes ont choisi une exposition à la surface de l’antigène d’intérêt, plutôt qu’une localisation intra- ou extracellulaire.

6. Lactococcus lactis en tant que vaccin vivant

Lactococcus lactis est une bactérie à Gram-positif en forme de coque ovoïde. L. lactis est largement utilisée dans la fabrication de produits laitiers, en particulier de fromages. De plus, cette bactérie acidifie les milieux dans lesquels elle se développe et peut synthétiser des bactériocines [42]. Cela permet d’éviter le développement de microorganismes indésirables dans les produits laitiers et participe à la préservation de la qualité hygiénique des produits. Les nombreux travaux menés sur cette bactérie ont permis de caractériser des gènes essentiels ou présentant un intérêt technologique (gènes impliqués dans le métabolisme, la résistance au stress, la croissance, etc.) et d’élucider leurs mécanismes d’expression [43]. Des outils et des techniques d’étude de plus en plus performants ont été mis au point : systèmes de mutagenèse et d’intégration chromosomique des gènes d’intérêt, vecteurs de clonage et d’expression constitutive ou inductible, systèmes de ciblage de protéines hétérologues dans différents compartiments de la bactérie [11, 44]. De plus, les génomes des souches L. lactis subsp. lactis IL1403 [45] et L. lactis cremoris MG1363 [46] ont été récemment séquencés. Grâce à ces travaux, L. lactis est considérée comme la BL modèle et fait partie des bactéries les mieux caractérisées avec Escherichia coli et Bacillus subtilis. Sa parfaite innocuité et le développement des connaissances sur ses capacités de production et de sécrétion de protéines hétérologues en font un bon candidat pour la sécrétion de protéines d’intérêt thérapeutique.

L. lactis a été largement étudiée et manipulée ces dernières années pour la production de protéines hétérologues tels que plusieurs antigènes d’origine virale ou bactérienne, ainsi que des molécules biologiquement actives (cytokines, hormones, etc.) [11, 12]. Notre équipe a développé de nombreux outils d’optimisation de la production de protéines hétérologues chez cette bactérie que nous décrivons dans les paragraphes suivants.

6.1. Production de protéines hétérologues chez L. lactis

Aujourd’hui, une large gamme de signaux d’expression constitutive ou inductible a été décrite chez L. lactis [5, 11, 12]. Grâce à ces études, nous avons constitué toute une gamme de promoteurs naturels constitutifs ou inductibles. Dans le cadre de nos études, nous avons choisi d’utiliser deux types de promoteurs principalement : i) le promoteur constitutif fort P59 [47] et, ii) le promoteur inductible à la nisine (P_nisA) [48].

6.2. Le système NICE (nisin induced controlled expression)

La nisine est une bactériocine de L. lactis largement utilisée comme substance antimicrobienne en industrie agro-alimentaire. Onze gènes chromosomiques adjacents (nisABTCIPRKFEG) codent pour la biosynthèse et l’immunité contre la nisine [49]. Le gène nisA correspond au gène de structure de la nisine et les gènes nisRK constituent le système à deux composantes responsable de l’induction des autres gènes du cluster. L’étude de la régulation de la biosynthèse de la nisine a permis de mettre en évidence le processus par lequel la nisine extracellulaire se fixe sur la protéine NisK qui s’autophosphoryle et devient capable d’activer le régulateur NisR par phosphorylation. NisR active ensuite la transcription des opérons nisABTCIP et nisFEG. La caractérisation de la régulation de ce système a permis de mettre au point un système d’expression inductible chez L. lactis utilisant le promoteur du gène nisA et les gènes nisRK [50]. Le gène d’intérêt est cloné en aval du promoteur P_nisA et le plasmide est introduit dans une souche possédant les gènes nisRK (ie. L. lactis NZ9000). L’addition de quantités sub-inhibitrices de nisine dans le milieu de culture déclenche l’expression du gène d’intérêt proportionnellement à la quantité de nisine présente. Ce système est aujourd’hui largement utilisé pour exprimer des protéines hétérologues chez les BL en général [50].

6.3. Les vecteurs d’expression

Dans notre laboratoire, nous avons développé un système de production-exportation de protéines hétérologues chez L. lactis à l’aide d’une protéine sécrétée modèle très stable et bien caractérisée, la nucléase de Staphylococcus aureus (Nuc) [51]. Nuc est considérée comme un bon rapporteur car son activité est très facilement détectable in vivo par un test de coloration sur des colonies bactériennes, en culture liquide ou extraites du tractus digestif. Ce système est composé d’une famille de vecteurs qui permettent le ciblage contrôlé de l’expression d’une protéine à l’intérieur de la cellule, ancrée à la paroi ou sécrétée dans le milieu extérieur, pCYT, pSEC et pCWA, respectivement.

• •pCYT : Pour obtenir l’expression d’une protéine dans le cytoplasme, le gène d’intérêt est fusionné uniquement au promoteur P_nisA.
• •pSEC : La voie de sécrétion utilisée dans nos travaux est la voie Sec-dépendante. Elle reconnaît des protéines synthétisées avec un peptide signal (PS) N-terminal et assure leur exportation et leur translocation. La nature du PS utilisé pour sécréter une protéine peut beaucoup influencer l’efficacité de sécrétion de la protéine. Un des PS les plus efficaces pour sécréter protéines hétérologues chez L. lactis est celui de la protéine Usp45 qui est la protéine majoritaire sécrétée par L. lactis [52]. Ainsi, le PS de cette protéine a été utilisé pour exporter de nombreuses protéines hétérologues chez L. lactis [53].
• •pCWA : Pour obtenir une protéine ancrée à la paroi de la bactérie, le gène d’intérêt est fusionné au PS_Usp45 et au domaine d’ancrage de la protéine M6 de Streptococcus pyogenes (CWA_M6). Ce domaine contient les signaux nécessaires pour un ancrage à la paroi [54].

Ces vecteurs, fonctionnels dans un large spectre de BL, sont utilisés en routine au sein de notre laboratoire pour la production d’une 40^aine de protéines hétérologues chez L. lactis ( tableau II ). Plus récemment, nous avons développé différents systèmes d’expression basés sur des promoteurs inductibles aux sels biliaires qui constituent une bonne alternative au promoteur inductible à la nisine.

6.4. Amélioration de la production-sécrétion de protéines hétérologues chez L. lactis

Nous avons aussi travaillé sur d’autres vecteurs d’expression et les facteurs de l’hôte affectant la production-sécrétion chez L. lactis. Nous avons ainsi développé un vecteur (pSEC:LEISS) contenant un propeptide synthétique (LEISSTCDA), identifié comme « booster » de la production et de la sécrétion [105]. Pour les facteurs de l’hôte affectant la production-sécrétion, nous avons identifié le gène ybdD. L’inactivation de ce gène entraîne une surproduction des seules protéines sécrétées selon un mécanisme non encore élucidé [Morello et al., soumis]. Nous avons aussi complémenté la machinerie de sécrétion de L. lactis avec SecDF de B. subtilis et avons observé une amélioration des niveaux de production et de sécrétion dans la souche résultante [106]. Enfin, nous avons obtenu récemment une souche de L. lactis qui ne produit ni l’unique protéase extracellulaire HtrA [107], ni la principale protéase intracellulaire ClpP [108]. Cette souche permet une production contrôlée et stable de différentes protéines hétérologues qui étaient hautement dégradées dans la souche sauvage [109].

7. Réponse immune contre des antigènes produits par Lactococcus lactis

Aujourd’hui, des nombreuses études justifient l’utilisation des souches recombinantes de L. lactis pour induire une réponse immunitaire à la fois muqueuse et systémique [11, 12]. La première tentative pour évaluer le potentiel de L. lactis en tant que vaccin à administration muqueuse a été réalisée avec une souche recombinante de lactocoque produisant une forme ancrée de l’antigène protecteur (PAc) de Streptococcus mutans [69]. Les souris immunisées par voie orale avec cette souche recombinante développaient des anticorps IgG sériques et IgA mucosales spécifiques du PAc. Ces résultats montrent pour la première fois que L. lactis peut être utilisée comme un vecteur pour délivrer un antigène au système immunitaire. Toutefois, Wells et al. [59] rapportent pour la première fois l’utilisation d’une souche recombinante de L. lactis vivante produisant le fragment C de la toxine tétanique (TTFC) comme antigène modèle, pour protéger des souris contre un challenge létal avec la toxine tétanique après administration sous-cutanée de la souche recombinante. Plus tard, le même groupe évalue l’effet de l’administration par voie orale ou nasale de souches recombinantes de lactocoques produisant la TTFC chez la souris [110, 111]. L’immunisation orale chez la souris avec ces lactocoques recombinants entraîne une réponse humorale (ie. anticorps IgG sériques et IgA mucosales spécifiques du TTFC) moins importante que l’administration intranasale, mais l’efficacité protectrice mesurée (c’est-à-dire le défi avec la toxine tétanique) était la même.

Plusieurs études ont été menées après ces travaux pour analyser l’expression de nombreuses protéines hétérologues d’origine virale, bactérienne ou eucaryote chez L. lactis [11 et tableau II]. L’immunogénicité des souches recombinantes résultantes a été évaluée dans certains cas dans des modèles animaux avec des résultats très prometteurs. En particulier, notre équipe a réussi (comme cité ci-dessus) à produire une 40^aine de protéines hétérologues chez L. lactis ( tableau II ). Notre objectif étant d’induire une réponse immune au niveau des muqueuses de l’hôte, nos efforts se sont concentrés sur la présentation de protéines d’intérêt médical telles que des cytokines, des antigènes, des allergènes et des antioxydants par des BL. Dans cette partie du chapitre, nous décrivons les trois projets les plus marquants de notre équipe qui concernent la production de protéines d’intérêt santé par L. lactis et comportant tous une phase de construction de souches suivie d’une phase d’expérimentations chez l’animal: i) construction de souches vaccinales de L. lactis afin de protéger et de lutter contre le papillomavirus humain de type 16 (HPV-16), ii) prévention et traitement des allergies à la β-lactoglobuline (BLG) avec de lactocoques recombinants produisant la BLG et l’interleukine-12 (IL-12) ; et iii) utilisation des lactocoques recombinants producteurs de leptine humaine en vue du traitement de l’obésité.

7.1. Construction de souches vaccinales de BL afin de protéger et de lutter contre l’HPV-16

Le papillomavirus humain de type 16 (HPV-16) est un des virus à potentiel oncogène que l’on retrouve (avec le type 18) dans plus de 90% des cancers du col de l’utérus (300 000 décès par an dans le monde) [112]. Les stratégies actuelles pour prévenir ou traiter l’infection par ce virus sont prometteuses mais coûteuses. Des vaccins prophylactiques basés sur des VLPs (virus-like particles) ont récemment induit des baisses significatives des infections à l’HPV-16 et 18 et des cancers associés à ces infections en essais cliniques humains [113]. Cependant, ces vaccins agissent seulement au niveau de l’infection et n’ont aucun effet thérapeutique. Par ailleurs, leur coût encore très élevé limite leur utilisation dans les pays en voie de développement où l’on dénombre environ 80% de décès liés au cancer associés à l’HPV. Dans ce projet, nous avons utilisé L. lactis pour délivrer deux protéines: i) l’antigène E7 du HPV-16, protéine retrouvée systématiquement dans des carcinomes provoqués par des infections par des HPV et un des antigènes candidats pour le développement d’une thérapie anti-HPV et ii) l’interleukine-12 (IL-12), une molécule stimulatrice de la réponse immunitaire cellulaire lors d’infections [38].

Dans un premier temps, nous avons construit une souche génétiquement modifiée de L. lactis sécrétant de façon stable l’antigène E7, alors qu’E7 est décrite comme une protéine très labile [79]. Puis, grâce aux outils développés précédemment, nous avons ciblé l’expression d’E7 dans trois localisations différentes (ie. cytoplasme, paroi et milieu extracellulaire) et nous avons pu mettre en évidence une réponse immune spécifique d’E7 chez la souris, suite à l’administration nasale avec les trois souches recombinantes exprimant E7. Nous avons également observé une immunogénicité accrue de la forme ancrée d’E7 [41]. Nous avons ensuite construit une souche recombinante de L. lactis sécrétant l’IL-12. Cette cytokine déjà utilisée avec succès en immunothérapie et cancérologie n’avait jusqu’alors jamais été produite chez une bactérie à Gram positif. En effet, une des difficultés concernant la production d’IL-12 est qu’elle requiert l’assemblage de deux sous-unités (p35 et p40) par un pont disulfure. Pour cela, nous avons développé des souches de L. lactis permettant la production de : i) de p35 et p40, donnant une forme hétérodimérique native de l’IL-12 et ii) d’une protéine de fusion des deux sous-unités de l’IL-12 (scIL-12). L’activité biologique de l’IL-12 produite par L. lactis a été ensuite confirmée in vitro sur des cellules de rate de souris puis in vivo par administration intranasale à des souris [98]. Nous avons également mesuré le potentiel adjuvant de ces souches recombinantes de lactocoques en les associant à la souche de L. lactis produisant la forme ancrée de l’antigène E7 [98].

Enfin, afin d’évaluer les capacités préventives et curatives de la combinaison de ces deux lactocoques, nous avons mis en place un modèle murin dans lequel nous induisions des tumeurs par implantation sous-cutanée de cellules tumorales exprimant l’antigène E7 de l’HPV-16 (TC-1), et dont nous mesurions l’évolution suite à l’administration intranasale de souches [114]. Nous avons évalué les effets préventifs et curatifs de la co-administration intranasale chez la souris de souches de lactocoques produisant E7 et IL-12 sur le développement de la tumeur TC-1. Nos résultats démontrent que l’administration préventive de lactocoques avant l’injection des cellules tumorales induit l’absence de développement de tumeurs chez 50% des animaux immunisés. Nous avons ainsi constaté un effet adjuvant significatif de l’IL-12 co-délivrée avec l’antigène E7 dans la mesure où en l’absence de la souche produisant l’IL-12, nous observons l’absence de tumeurs dans seulement 25% des souris immunisées. De plus, les souris immunisées avec LL-E7 et LL-IL12 sont capables de résister à un second défi (2 mois après la première immunisation) suggérant que l’immunité induite est durable [114]. L’utilisation thérapeutique de ces souches chez des souris où les tumeurs sont déjà implantées, provoque la régression totale des tumeurs chez 35% des animaux traités. Ces effets anti-tumoraux sont la conséquence d’une réponse cytotoxique dépendante des lymphocytes T CD4+ et CD8+. Ces résultats chez la souris constituent la première mise en évidence d’un effet préventif et curatif contre le cancer du col de l’utérus par vaccination muqueuse avec des souches recombinantes de lactocoques. Le vaccin, disponible actuellement en France, a un coût très élevé (près de 150 € la dose à raison de trois doses par personne vaccinée), ce qui limite son utilisation dans les pays en voie de développement. Il faut cependant souligner que ces stratégies basées sur des bactéries transgéniques demeurent aujourd’hui des modèles d’étude non encore autorisés chez l’Homme. Ces derniers temps, on peut cependant noter une évolution sensible concrétisée entre autres par les premiers essais cliniques de Phase I menés chez l’Homme avec des souches de lactocoques sécrétrices d’IL-10 [115].

7.2. Prévention et traitement des allergies à la BLG avec de lactocoques recombinants produisant la BLG et l’IL-12

La prévalence des allergies alimentaires a particulièrement augmenté au cours des 20 dernières années [116]. Les réactions et manifestations allergiques résultent de l’induction, chez des sujets génétiquement prédisposés, de lymphocytes T auxiliaires (ou Th pour T « helper ») de type 2 (Th2) contre certaines protéines alimentaires inoffensives normalement tolérées par l’organisme: ces protéines deviennent des allergènes. Il existe dans l’organisme une régulation fine entre les différentes sous-populations lymphocytaires Th1, Th2 et Th17. Cette régulation résulte d’actions inhibitrices de ces différentes populations les unes envers les autres, et/ou du fait de l’activation de cellules régulatrices (Treg). Les lymphocytes Th1 sont sécréteurs des cytokines pro-inflammatoires, tels que l’IL-12 et l’interféron gamma (IFN-γ), qui favorisent l’induction d’une immunité à médiation cellulaire et la production d’IgG2a chez la souris (IgG1 chez l’homme) [117]. L’IL-12 inhibe le développement des lymphocytes Th2. Les lymphocytes Th2 sont quant à eux sécréteurs de cytokines anti-inflammatoires qui conduisent à la production d’IgE spécifiques et inhibent le développement des cellules Th1 (IL-4, IL-13). L’induction modérée de cellules spécifiques de type Th1 pourrait donc permettre la modulation des cellules Th2 spécifiques d’allergènes, responsables de la sensibilisation allergique (production d’IgE spécifiques d’un allergène) et de la réaction allergique (apparition de symptômes suite à un test de provocation). Plusieurs études suggèrent que certaines bactéries probiotiques, dont certaines BL, pourraient agir favorablement et participer au maintien de cet équilibre Th1/Th2. Elles représentent donc des bonnes candidates pour réguler les maladies allergiques. Grâce à un modèle murin d’allergie alimentaire à la beta-lactoglobuline bovine (BLG) [118], un des allergènes majeurs du lait de vache, nous avons pu étudier l’effet de la co-administration par voie orale ou intranasale de lactocoques recombinants produisant la BLG et l’IL-12 sur la sensibilisation allergique. Grâce au suivi de la réponse immunitaire spécifique induite chez ces souris (dosage des anticorps spécifiques et des cytokines Th1/Th2), nous avons démontré que l’administration intranasale de lactocoques recombinants stimule de façon significative une réponse immunitaire Th1 par rapport aux souris contrôles. Ce pré-traitement permet de prévenir la sensibilisation allergique à la BLG (c’est-à-dire la production d’IgE spécifiques et de cytokines Th2) et le déclenchement de la réaction allergique chez les souris (éosinophilie locale) [119]. De plus, nous avons montré l’effet positif de l’administration thérapeutique des lactocoques produisant la BLG sur certains marqueurs de l’allergie au lait de vache [120]. Enfin, nous avons mis en évidence que l’administration nasale de la souche sécrétant l’IL-12 diminue aussi les manifestations allergiques dans un modèle d’asthme induit par l’ovalbumine [121].

7.3. Utilisation de souches recombinantes de L. lactis productrices de la leptine humaine en vue du traitement de l’obésité

L’obésité constitue un problème mondial de santé publique et les traitements susceptibles de réduire ce problème ont un très fort potentiel thérapeutique. Nous avons développé des lactocoques recombinants producteurs de la leptine humaine, hormone produite principalement par l’adipocyte, qui informe le cerveau de l’état des réserves adipeuses. Chez la souris obèse (ob/ob), la déficience en leptine conduit à une obésité massive. Nos travaux ont eu pour objet de mesurer les effets de l’administration nasale d’une souche de L. lactis sécrétant la leptine humaine chez des souris ob/ob. Dans un premier temps, nous avons construit une souche de L. lactis sécrétant efficacement la leptine humaine biologiquement active. Nous avons ensuite déterminé si l’administration intra-nasale de LL-Lep pouvait inhiber la prise alimentaire et la prise de poids des souris ob/ob. Nous avons ainsi observé que l’administration quotidienne de cette souche recombinante de L. lactis à ces souris obèses réduisait de façon significative le gain de poids et la prise alimentaire [104]. Ces résultats démontrent que la leptine (une hormone) est produite sous forme active par L. lactis et que cette souche peut être utilisée avec succès pour réguler le poids corporel et la consommation des aliments.

L’ensemble de ces résultats confirme tout le potentiel des lactocoques recombinants en tant que vecteur de protéines d’intérêt santé et laissent espérer que de telles souches de BL recombinantes seront un jour autorisées afin d’apporter de nouvelles solutions dans le futur pour la prévention et le traitement de maladies.

8. Lactobacilles en tant que vaccin vivant

Contrairement à L. lactis, certaines espèces de lactobacilles peuvent coloniser certaines régions de la muqueuse et induire une réponse immunitaire locale, avantage lors de développement d’un vaccin. Par ailleurs, l’utilisation possible de certaines souches probiotiques de lactobacilles comme vecteur à administration muqueuse constitue un avantage supplémentaire [32]. Cependant, la biodiversité de ce genre rend leur l’utilisation en tant que vaccin vivant beaucoup plus complexe que celle de L. lactis où une seule souche (MG1363) a été utilisée. En effet, ce genre est très répandu et contient plus de 60 espèces qui diffèrent au niveau de leurs propriétés biochimiques, écologiques et immunologiques. Toutefois, la capacité du genre Lactobacillus à produire des antigènes a également été démontrée.

9. Réponse immune contre antigènes produits par Lactobacilles spp.

Comme pour L. lactis, plusieurs travaux ont rapporté l’expression d’une variété de protéines hétérologues d’origine virale, bactérienne ou eucaryote chez les lactobacilles ( tableau II ). L’utilisation de lactobacilles génétiquement modifiés pour produire des protéines hétérologues et pour développer une nouvelle génération de vaccins muqueux a été proposée pour la première fois au début des années 90 [122, 123] mais la plupart de nos connaissances actuelles sur leur utilisation en tant que vaccin vivant a été obtenue avec l’antigène modèle TTFC [59, 111].

À la fin des années 90 et au début des années 2000, plusieurs laboratoires utilisaient des souches recombinantes de Lb. casei et Lb. plantarum en tant que vecteur pour délivrer des protéines d’intérêt médical à la surface des muqueuses et ils ont observé une forte stimulation de la réponse immunitaire [5, 32]. Ainsi, notre équipe a transféré tout son savoir-faire sur la production de protéines hétérologues acquis chez L. lactis dans des souches de lactobacilles (plus spécifiquement dans des souches de Lb. casei et Lb. plantarum) qui présentent le double intérêt de transiter plus lentement dans le tractus digestif et de posséder des propriétés adjuvantes intéressantes dans le cas de souches vaccinales.

Dans un premier temps, nous avons l’immunogénicité d’une souche recombinante de Lb. plantarum produisant l’antigène E7 du HPV-16 a été évaluée dans des modèles animaux avec des résultats très prometteurs [81]. Nous avons aussi développé des souches recombinantes de Lb. casei productrices d’enzymes antioxydantes telles que des catalases ou des superoxyde dismutases. Le but de ce projet portait sur l’évaluation des effets bénéfiques de l’administration orale de souches de lactobacilles aux propriétés anti-oxydantes dans un modèle murin d’inflammation reproduisant des syndromes de type maladies inflammatoires chroniques de l’intestin (MICI). Les MICI sont des maladies causées par une inflammation anormale du TD qui provoque des dysfonctionnements gastro-intestinaux. Ces maladies, souvent invalidantes et de longue durée, se caractérisent par un excès de dérivés actifs oxygénés qui s’accompagne d’une diminution des capacités des systèmes antioxydants ainsi que d’un déséquilibre entre les cytokines pro- et anti-inflammatoires. Nous avons d’abord exprimé chez Lb. casei BL23 une catalase manganèse-dépendante (MnKaT) de Lb. plantarum [124] et nous avons démontré par la suite que l’administration quotidienne orale des souches de Lb. casei produisant ou non la catalase MnKat, chez des souris où une colite a été induite par l’ingestion de DSS (dextran sulfate sodium) dans l’eau de boisson, permettait de limiter significativement l’inflammation au niveau du caecum et du côlon, contrairement aux souris témoins traitées avec du PBS pour lesquelles diarrhée et lésions mucosales ont été observées [125]. Plus récemment, nous avons cherché à améliorer le potentiel antioxydant de nos souches de lactobacilles en exprimant la SOD (superoxyde dismutase) à Mn de L. lactis [Watterlot et al., soumis].

Dans une autre étude, Chang et al. [126] ont construit une souche recombinante de Lb. jensenii, une bactérie commensale du vagin, pour exprimer et sécréter un domaine de la protéine de liaison à la protéine gp120 du virus de l’immunodéficience humaine (VIH), CD4, et ils ont démontré que la co-incubation de cette bactérie recombinante avec un virus VIH portant le gène rapporteur luciferase (i.e. VIH-1HxB2) entraîne une diminution significative de l’entrée de ce virus dans des cellules HeLa (exprimant le récepteur CD4-CXCR4-CCR5) in vitro.

En plus de leur application en tant que vaccin, les lactobacilles peuvent aussi être utilisés pour délivrer de molécules anti-infectieuses ou produits antimicrobiens in situ. Un exemple est l’utilisation de souches recombinantes de lactobacilles pour prévenir la carie dentaire dans un modèle animal [127].

10. Conclusions et perspectives

Dans les cinq dernières années, l’intérêt de l’utilisation de bactéries lactiques pour délivrer des molécules d’intérêt a considérablement augmenté, ce qui s’est traduit par des avancées significatives rassemblées au sein de cette revue. En dépit de ces progrès, beaucoup de questions restent en suspens notamment au niveau de la réponse immune générée chez l’hôte par les antigènes natifs de la BL utilisée comme vecteur ou encore le mode d’administration orale ou intranasale. Actuellement, ce dernier paraît le plus adapté pour induire une bonne réponse immune aux niveaux systémique et mucosal mais il reste à s’assurer de l’aspect sanitaire de ces administrations.

Les applications thérapeutiques ont évolué de telle manière que l’on peut raisonnablement envisager l’utilisation de BL recombinantes en prévision et lors du traitement de pathologies humaines dans les prochaines années. Des systèmes de confinement biologique ont été mis au point afin d’empêcher la dissémination de ces BL recombinantes [97]. Cette stratégie a permis la mise en place d’un premier essai clinique de phase I [115] qui est une étape essentielle dans des utilisations futures de ces outils très prometteurs.

Conflit d’intérêt : aucun.