MSCs 治疗慢性创面的临床研究进展

Abstract

目的

综述 MSCs 在慢性创面治疗中的临床研究进展。

方法

广泛查阅近年来 MSCs 治疗慢性创面的相关文献，对 MSCs 治疗慢性创面的可能机制及其在临床慢性创面治疗中的应用情况、面临问题进行总结。

结果

MSCs 可参与到慢性创面愈合各个环节来促进创面愈合，在临床试验中展现出广阔应用前景。目前临床研究常用的 MSCs 包括骨髓来源 MSCs、脂肪来源 MSCs 及脐带来源 MSCs。

结论

MSCs 治疗慢性创面是一种具有前景的策略，但广泛应用于临床前还存在许多问题需进一步研究。

创面愈合是一个复杂过程，通常包括炎症渗出、细胞增殖和组织重塑 3 个阶段^[1-2]。如愈合过程中出现反复创伤、持续压力、感染、缺血或局部/全身疾病等影响因素时，创面将难以愈合。持续数月甚至数年不愈合的创面被定义为慢性创面^[3]，主要包括糖尿病溃疡、血管性溃疡、压力性损伤和感染性创面等。目前，临床治疗慢性创面效果仍不理想，超过 50% 的慢性创面治疗无效^[4-5]，严重影响患者生活质量，给患者和医疗系统带来巨大负担。MSCs 是成体来源的多潜能基质细胞，具有自我更新、多向分化潜能、低免疫原性和免疫调节能力等优点，已广泛应用于再生医学领域，尤其在皮肤软组织缺损和慢性创面修复中，具有广阔应用前景。目前，在慢性创面修复中应用最多的 MSCs 为骨髓来源 MSCs（bone marrow-derived MSCs，BMSCs）、脂肪来源 MSCs（adipose-derived MSCs，ADSCs）、脐带来源 MSCs（umbilical cord-derived MSCs，UCMSCs）。本文在广泛回顾相关文献基础上，对 MSCs 治疗慢性创面的可能机制及临床应用研究进展进行总结，探讨其用于临床治疗慢性创面面临的问题。

1. MSCs 治疗慢性创面的可能机制

慢性创面以持续炎症状态、血管生成受损以及创面细胞老化为主要特征^[6]，MSCs 可通过调节炎症反应、促进血管生成和细胞增殖三方面来改善慢性创面的愈合^[7]。

① 调节炎症反应：慢性炎症是导致慢性创面无法愈合的关键因素，而 MSCs 具有免疫调节能力，可以减少创面促炎因子（如 TNF-α 和 IFN-γ）的分泌，同时增加抗炎因子（如 IL-10 和 IL-4）的产生^[8]。此外，慢性创面感染风险高，MSCs 可以通过调节树突状细胞、T 细胞和 B 细胞等免疫细胞的招募、增殖和功能特性^[9-10]，增强创面免疫细胞的杀菌能力，还可以分泌抗菌肽（如 LL37），直接杀灭细菌^[11-13]，预防创面感染、促进慢性创面愈合。

② 促进血管生成：由于创面蛋白酶增多，创面新生血管以及肉芽组织生成不足。MSCs 不仅能直接分化为内皮细胞^[14-15]，还可以通过分泌 VEGF、基质细胞衍生因子 1 和血管生成素 1 等生物因子来刺激内皮细胞的存活、募集和增殖，从而促进新生血管形成^[16-17]。此外，MSCs 还可通过分泌基质金属蛋白酶抑制因子来保护血管基膜，使其免受基质金属蛋白酶的降解^[18]，并促进真皮成纤维细胞合成纤维连接蛋白、胶原蛋白和弹性蛋白^[19]，从而促进肉芽组织形成。

③ 促进细胞增殖：MSCs 能分泌大量细胞因子，如 VEGF、EGF 和 bFGF 等，从而调节内皮细胞、角质形成细胞和成纤维细胞的存活、增殖、迁移和基因表达^[20-21]，以促进创面细胞增殖、迁移和再上皮化。

综上，MSCs 可以通过直接或间接方式参与到创面愈合的各个环节，促进创面愈合^[2]。

2. MSCs 治疗慢性创面的临床研究现状

随着人们对 MSCs 在创面愈合中作用的认识不断加深，越来越多的基础实验和临床试验得以开展。虽然这些研究在 MSCs 来源、种类和给药途径方面存在很大差异，但是均得到相同结论，即 MSCs 在治疗慢性创面愈合方面有着很大潜能。

2.1. BMSCs

2003 年，Badiavas 等^[22]首次应用 BMSCs 治疗临床慢性皮肤溃疡。他们采用自体 BMSCs 治疗 3 例慢性创面患者，创面存在均超过 1 年，结果证实直接应用 BMSCs 可促进慢性创面的真皮重建和愈合，在活检标本中观察到 MSCs 植入创面以及瘢痕形成减少。除了将 BMSCs 直接注射至慢性创面周围外，也有研究采用其他方法将 BMSCs 植于创面。Ichioka 等^[23]将自体 BMSCs 浸入胶原基质胶，用于治疗经常规治疗 1 年无效的慢性小腿溃疡，创面顺利愈合，而且在治疗早期促进创面愈合的功能性毛细血管密度明显增高。Falanga 等^[24]利用纤维蛋白聚合物喷雾系统和双筒注射器将培养的自体 BMSCs 注射至慢性难愈性创面中，结果显示 BMSCs 可有效促进创面愈合，而且细胞数量与慢性创面减小程度有强相关性。2017 年，Gupta 等^[25]开展了一项有关 BMSCs 治疗下肢缺血性溃疡的有效性和安全性研究，发现接受较高剂量 BMSCs 治疗的患者创面愈合明显加快，静息痛程度、总步行距离和踝臂压力指数明显改善。随后，Wijnand 等^[26]也进行了一项双盲、安慰剂对照的随机临床试验，旨在研究同种异体 BMSCs 治疗下肢缺血性溃疡的疗效，共 66 例患者随机接受肌肉注射 BMSCs 或安慰剂，并在 6 个月后进行疗效评估。结果表明肌肉注射同种异体 BMSCs 安全，同时能有效促进下肢缺血性溃疡愈合。上述 BMSCs 应用于慢性创面的临床试验均表明，其能有效促进创面愈合。

2.2. ADSCs

Rigotti 等^[27]首次将 ADSCs 应用于慢性创面的治疗，研究对象为 20 例连续接受放射治疗后产生严重不可逆功能损害（萎缩、纤维化、溃疡、收缩）的患者，经纯化自体脂肪抽吸物治疗后，患者临床症状均获得改善，提示 ADSCs 有助于组织血管化和器官功能恢复。2012 年，Lee 等^[28]研究了 ADSCs 移植的安全性和有效性，在接受治疗的 15 例糖尿病合并严重肢体缺血患者中，10 例患者有明显的临床改善。Zollino 等^[29]开展了一项随机对照试验，选取 16 例静脉性小腿溃疡患者随机分为试验组和对照组。其中，试验组创面采用清创、离心脂肪组织、敷料和加压治疗；对照组不进行任何处理。结果显示试验组创面愈合明显快于对照组，且创面疼痛明显减轻，证实了 ADSCs 能有效促进创面愈合。最近，Moon 等^[30]进行了一项随机、对照、多中心研究，以评估基于水凝胶的同种异体 ADSCs 治疗糖尿病足溃疡的潜力，其中 ADSCs 组 30 例、对照组 29 例。结果表明 ADSCs 组创面完全闭合率较高，Kaplan-Meier 分析示中位完全闭合时间短于对照组，提示 ADSCs 对糖尿病足溃疡具有很大的治疗潜力。ADSCs 来源于脂肪，患者抽脂所受痛苦小于骨髓穿刺，而且 ADSCs 可以大规模复制，能满足治疗较大创面的需要，相比 BMSCs 用于临床治疗有一定优势。因此需要更多临床研究进一步探讨 ADSCs 治疗慢性创面的有效性。

2.3. UCMSCs

2014 年，有研究提出人羊膜和脐带组织含有蛋白质、细胞因子和生长因子，移植后可以调节炎症反应和促进创面愈合，并且利用冻干人羊膜和脐带组织覆盖慢性皮肤溃疡，可以促进肉芽组织的形成和快速再生^[31]。2016 年，有学者发布了一项包括 57 例患者共 64 处创面的 UCMSCs 移植研究，结果显示 51 处创面完全愈合，整体创面愈合率为 79.7%，表明 UCMSCs 治疗慢性创面有效，可提高患者生活质量 ^[32]。2018 年，有研究对 5 例糖尿病患者慢性皮肤溃疡创面覆盖接种了 UCMSCs 的脱细胞羊膜，结果显示 UCMSCs 治疗能使创面愈合时间明显缩短，创面面积明显缩小^[33]。之后，Suzdaltseva 等^[34]开展了一项随机对照研究，共纳入 108 例不同原因导致的慢性创面患者，结果发现与安慰剂组相比，单次皮下注射 UCMSCs 的治疗组创面周围肉芽组织生长明显、血循环改善、创面明显缩小，无明显不良反应。以上研究表明，局部应用 UCMSCs 可以有效促进慢性创面愈合。

2.4. 不同来源 MSCs 治疗慢性创面的研究比较

目前，MSCs 治疗慢性创面的研究中主要采用自体 MSCs，同种异体 MSCs 较少，分析与 MSCs 免疫原性尚未明确，同种异体移植存在一定免疫排斥风险有关。BMSCs 应用最广泛，其次是 ADSCs，UCMSCs 最少，分析与 BMSCs 发现最早、研究更深入有关。此外，与骨髓相比，脂肪和脐带属于（半）固体组织，在分离、纯化、储存以及应用 MSCs 前均需进行酶消化处理。但根据美国食品药品监督管理局（FDA）的监管指南规定，在储存或应用干细胞之前使用酶消化来获取 MSCs 属于“超过最低限度的操作”类别，即使在自体应用中也是如此，需要 FDA 的监督以及在临床应用之前获得 IND（临床研究型新药）批准^[35]。较为繁琐的处理流程可能是 ADSCs 和 UCMSCs 用于临床治疗慢性创面少于 BMSCs 的原因。

而 UCMSCs 应用少于 ADSCs 可能是因为 ADSCs 可以从受试者（自体）中获得，能避免免疫排斥反应的潜在风险；并且脂肪组织是体内最丰富的 MSCs 来源^[36-38]，使用前无需进行细胞扩增培养^[39]，而扩增培养可能会导致细胞衰老，影响细胞移植治疗效果。有研究认为直接使用吸脂剂更安全^[40]，因为它避免了改变细胞生物学功能的体外加工和生产法规的限制。

但是，近年来 ADSCs 和 UCMSCs 临床应用逐渐增加，而 BMSCs 逐渐减少，考虑是因为 BMSCs 的获取为侵入性操作，需要全身麻醉，并且获取数量较少，BMSCs 仅占骨髓单个核细胞总数的 0.001%～0.01% ^[41-42]。有研究提出 BMSCs 的数量、增殖和分化能力与年龄成负相关^[43]，老年患者骨髓中分离获得的 BMSCs 可能不能满足临床有效治疗所需数量。在这种情况下则需要同种异体移植，寻找匹配供者或应用其他组织来源的 MSCs。而脂肪组织获取操作的侵入性相对较低，并且组织来源丰富，细胞含量较高，不仅减少了患者不适，也无需体外扩增步骤，并发症风险也更低。脐带、胎盘、羊膜都是产妇自体产物且分娩后会遗弃，故获取较容易。因此 ADSCs 和 UCMSCs 的应用逐步获得人们青睐。

研究发现，不同组织来源的 MSCs 对细胞治疗有很大影响，因此探索不同来源 MSCs 差异有利于优化细胞治疗^[44]。一些研究已经确定了 BMSCs 和 ADSCs 在转录和蛋白质组学上的差异。Noël 等^[45]研究表明，在标准培养条件下，BMSCs 和 ADSCs 中有 18% 蛋白质和 13.2% 基因表达存在差异。与 BMSCs 相比，ADSCs 能更明显上调树突状细胞分泌 IL-10，提示 ADSCs 可能更有效地调节慢性创面炎症反应，更有利于感染性创面的愈合。Hoang 等^[46]研究发现相比 BMSCs 和 ADSCs，UCMSCs 促角质形成细胞增殖和迁移能力更强，提示其促进创面上皮化能力可能更高。还有研究表明^[47]，对比 BMSCs 和 UCMSCs，ADSCs 具有更好的促内皮祖细胞血管形成能力，分析 ADSCs 可能更有利于促进慢性创面的新生血管形成，更有效地促进缺血型创面愈合。

3. MSCs 治疗慢性创面临床试验存在问题

由于 MSCs 在临床前研究中展现出强大的促进创面愈合作用，所以临床试验也逐步开展。截至 2020 年 9 月 30 日，在美国国立卫生研究院（NIH）ClinicaTrials 网站（https://www.clinicaltrials.gov/）注册登记的 BMSCs、ADSCs、UCMSCs 治疗慢性创面（糖尿病足溃疡、压疮、下肢缺血性溃疡、慢性皮肤创面）的临床试验达 79 项。其中，应用 BMSCs 治疗的临床试验最多（40 项），其次是 ADSCs（32 项）、UCMSCs（7 项）；用于治疗下肢缺血性溃疡临床试验最多（40 项），其次是糖尿病足溃疡（26 项）、慢性皮肤溃疡（10 项）、老年性压疮（3 项）。

尽管 MSCs 治疗慢性创面在动物研究和临床试验中均取得了较好结果，但仍无充分证据支持将其作为治疗慢性创面的标准方法^[48]，主要存在四方面问题。第一，临床试验中招募的患者数量有限，迫切需要更多双盲、随机对照以及更长随访时间的大规模临床试验。第二，大多数临床试验缺乏适当对照，需要以标准创面治疗作为对照来确定 MSCs 治疗的安全性和有效性。值得注意的是，传统的细胞治疗，特别是由成纤维细胞和角质形成细胞组成的生物工程皮肤替代品，已经获得美国 FDA 批准，并已商业化用于治疗慢性创面^[49]。虽然动物实验已证明成纤维细胞治疗慢性创面不如 MSCs 有效^[50-51]，但尚无临床试验进一步验证该结论。因此，将传统创面治疗方法和常规细胞治疗作为对照，有助于明确 MSCs 的治疗效果。第三，临床试验中存在细胞来源、给药剂量、创面类型等差异，使得不同研究之间缺乏可比性。因此，后续亟待建立一致的患者选择标准，为进一步比较不同治疗方法疗效奠定基础。第四，MSCs 在临床试验应用中存在多种安全问题，其中最重要的是恶性转化和致癌风险^[52]。Yu 等^[53]研究发现在裸鼠皮下注射带有肿瘤细胞的 ADSCs 会刺激肿瘤生长；Rubio 等^[54]的研究发现干细胞自发转化为恶性表型，后续由于怀疑受到污染和无法复制转化事件，作者撤回了相关文章^[55]。另一方面，与使用其他生物材料一样，MSCs 治疗存在传播或导致特定疾病的风险，例如机会性和播散性感染^[56]。

4. 展望

慢性创面，尤其是糖尿病和血管相关的慢性创面，会严重影响患者生活质量甚至生命，因而找到一种治疗慢性创面的最佳方法刻不容缓。目前 MSCs 治疗已经在皮肤修复和再生医学领域引起了极大关注，而且在治疗慢性创面的临床前和临床试验中取得了积极结果。但目前仍然缺乏不同组织来源 MSCs 移植治疗慢性创面的比较研究，因此何种来源 MSCs 对慢性创面的疗效最佳仍未明确。除此以外，将 MSCs 用于临床治疗慢性创面还存在以下问题需要解决^[57]：① 更多、更合理获取 MSCs 的方法；② 提高 MSCs 纯度的方法；③ 统一 MSCs 的质量检测方法；④ 如何给药能使 MSCs 达最佳治疗效果；⑤ 移植后 MSCs 的成活率、有效性和远期疗效的鉴定方法；⑥ 移植后 MSCs 分化、增殖失控和肿瘤发生的可能性；⑦ MSCs 治疗慢性创面的详细机制。解决这些问题将对 MSCs 最终用于临床治疗慢性创面具有重要意义。

作者贡献：曹颖璇、燕建新负责查阅文献及撰写论文；刘宏伟负责审校并修改论文。

利益冲突：所有作者声明，在课题研究和文章撰写过程中不存在利益冲突。经费支持没有影响文章观点。

Funding Statement

国家自然科学基金资助项目（81871563、81372065）