外周血来源间充质干细胞/内皮祖细胞复合细胞膜片的构建及其生物学特性初步研究

Abstract

Objective

To separate peripheral blood mesenchymal stem cells (PBMSC) and peripheral blood endothelial progenitor cells (PBEPC) from peripheral blood, and investigate the biological characteristics of composite cell sheets of PBMSC and PBEPC.

Methods

The peripheral blood of healthy adult New Zealand white rabbits was extracted and PBMSC and PBEPC were separated by density gradient centrifugation. Morphological observation and identification of PBMSC and PBEPC were performed. The 3rd generation of PBMSC and PBEPC were used to construct a composite cell sheet at a ratio of 1∶1, and the 3rd generation of PBMSC was used to construct a single cell sheet as control. The distributions of cells in two kinds of cell sheets were observed by HE staining. In addition, the expression of alkaline phosphatase (ALP), osteocalcin (OCN), and vascular endothelial growth factor (VEGF) in the supernatants of cell sheets were observed by ELISA at 1, 5, and 10 days after osteogenic induction.

Results

The morphology of PBMSC was spindle-shaped or polygonal, and PBMSC had good abilities of osteogenic and adipogenic differentiation. The morphology of PBEPC was paved stone-like, and the tube-forming test of PBEPC was positive. Two kinds of cell sheets were white translucent. The results of HE staining showed that the composite cell sheet had more cell layers and higher cell density than the single cell sheet. The expressions of ALP, OCN, and VEGF in the supernatant of the two groups of cell sheets increased with the time of induction. The expression of OCN in the group of composite cell sheet was significantly higher than that in the group of single cell sheet on the 5th and 10th day, ALP on the 10th day was significantly higher than that in the group of single cell sheet, VEGF expression on the 1st, 5th, and 10th day was significantly higher than that in the group of single cell sheet, all showing significant differences (P<0.05), and there was no significant difference between the two groups at other time points (P>0.05).

Conclusion

PBMSC have stable differentiation ability, and they have good application prospects because of their minimally invasive access. Composite cell membranes constructed by co-culture of two kinds of cells and induction of membrane formation provides a new idea and exploration for tissue defect repair.

临床工作中，对于由遗传、肿瘤、创伤、感染、退变等多种原因导致的组织缺损的治疗，一直是临床医生需要面对的一个挑战^[1-2]。而在组织修复过程中，细胞与细胞之间、细胞与细胞外基质之间的相关信号传导通路，对组织修复起着十分重要的作用^[3]。与传统的胰蛋白酶消化细胞间连接获取细胞的方式不同，细胞膜片技术因其可以良好地保护细胞间连接以及细胞外基质，在组织缺损修复领域展现出了巨大发展潜力^[4-5]。研究者还可以通过叠加、折叠细胞膜片，采用包裹、注射、填塞的方式植入不同组织缺损部位进行修复^[6]。许多研究通过构建细胞膜片并开始逐步应用于皮肤、角膜、心脏、膀胱、牙周等组织修复中，但目前大多数研究主要利用单一种子细胞来源构建细胞膜片^[7-10]。

研究者发现外周血中也存在少量 MSCs，经过体外成骨、成脂、成软骨诱导后，同样展现出了良好的三向分化能力^[11]。与传统骨髓、脂肪等组织来源的 MSCs 相比，外周血来源间充质干细胞（peripheral blood mesenchymal stem cells，PBMSC）因其取材微创，具有良好的发展应用前景。有研究利用内皮细胞以共培养方式促进了 MSCs 的成骨能力^[12-13]。因此，本研究尝试利用 PBMSC 与外周血内皮祖细胞（peripheral blood endothelial progenitor cells，PBEPC）通过共培养、成膜诱导等手段构建复合细胞膜片，旨在为组织工程骨缺损修复提供一种新的思路与探索。

1. 材料与方法

1.1. 实验动物及主要试剂、仪器

健康雄性成年新西兰大白兔 5 只，体质量约 3 kg，由四川大学华西医院转化医学中心动物实验室提供。

集落刺激因子、抗坏血酸（华北制药集团有限责任公司）；CXC 趋化因子受体 4 拮抗剂 AMD3100（Selleck 公司，美国）；淋巴细胞分离液（Ficoll 液；天津灏洋生物制品科技有限责任公司）；肝素（山东辰中生物制药有限公司）；DMEM 培养基（Sigma 公司，美国）；Matrigel 胶（BD 公司，美国）；成骨培养基（Cyagen 公司，美国）；内皮细胞生长培养基 2（endothelial cell growth medium，EGM-2；Lonza 公司，美国）；Hank 液（GIBCO 公司，美国）；PBS（武汉博士德生物工程有限公司）。细胞培养超净台、CO₂ 细胞培养箱（SANYO 公司，日本）；倒置相差显微镜（Leica 公司，德国）；流式细胞分析仪（BD 公司，美国）；离心机（Eppendorf 公司，德国）。

1.2. PBMSC 分离、培养与鉴定

按照本课题组前期研究中介绍的方法获取 PBMSC 并进行相关鉴定^{[11, 14]}。取新西兰大白兔 1 只，连续 5 d 皮下注射集落刺激因子（100 μg/kg），第 6 天皮下注射 AMD3100（5 mg/kg）后，经颈动脉抽取 50 mL 血液；用含肝素（25 U/mL）的 DMEM 培养基等体积稀释后，缓慢加入到相同体积的淋巴细胞分离液（Ficoll 液），室温下以 500×g 离心 30 min 后，收集中间白膜层，再次室温下以 200×g 离心 10 min 后，去上清液，培养基重悬，获取 PBMSC。见图 1。倒置相差显微镜下观察细胞特性，取第 3 代细胞用于后续实验。

图 1.

Density gradient centrifugation in the process of obtaining PBMSC

获取 PBMSC 过程中的密度梯度离心

a. 外周血加入淋巴细胞分离液（密度梯度离心前）；b. 外周血密度梯度离心后的单核细胞层（白膜层，黑框区域）

a. Peripheral blood added with lymphocyte separation solution (before density gradient centrifugation); b. Mononuclear cell layer after peripheral blood density gradient centrifugation (white membrane layer, black box region)

将第 3 代 PBMSC 按 3×10⁴个/孔密度分别接种于 6 孔板内，成骨诱导 21 d 后行茜素红染色，观察有无钙结节生成。将第 3 代 PBMSC 按细胞密度 1×10⁵个/孔分别接种于 6 孔板内，成脂诱导 14 d 后行油红 O 染色，观察有无脂滴生成。

1.3. PBEPC 分离、培养与鉴定

按照本课题组前期研究中介绍的方法获取 PBEPC 并进行相关鉴定^[11]。取新西兰大白兔 1 只，以 3% 戊巴比妥耳缘静脉注射麻醉（1 mg/kg）后，经颈动脉抽取约 50 mL 血液。用含肝素（25 U/mL）的 PBS 等体积稀释后，缓慢加入到相同体积的淋巴细胞分离液（Ficoll 液），室温下以 500×g 离心 30 min 后收集中间白膜层，再次以 200×g 离心 10 min 后，洗涤、重悬获取 PBEPC。倒置相差显微镜下观察细胞特性，取第 3 代细胞用于后续实验。

取 Matrigel 基质胶经等体积无血清 EGM-2 培养基稀释后，均匀加入 24 孔板底部；调整细胞密度为 2×10⁵ 个/mL 后吸取细胞悬液 500 μL，加入 Matrigel 基质胶表面 8 h 后，倒置相差显微镜下观察 PBEPC 的成管情况。

1.4. 细胞膜片相关观测

1.4.1. 细胞膜片的构建

将 PBMSC 和 PBEPC 分别按细胞密度 1.5×10⁵ 个/孔均匀混合接种于 6 孔板内底部，待细胞完全贴壁后，加入培养液（含 10%FBS 的 DMEM 培养基和 EGM-2 培养基按 1∶1 混合）培养 2 d 后，更换为成膜诱导液（含 10%FBS、50 mg/L 抗坏血酸、10 mmol/L β 甘油磷酸钠、10 nmol/L 地塞米松的 DMEM 培养基）诱导 2 周后，可见孔板底部有白色半透明膜状物形成。使用眼科镊小心沿着孔板边缘将形成的白色膜状物分离，获得复合细胞膜片进行后续研究。采用倒置相差显微镜观察细胞膜片内细胞形态。另取 PBMSC 按 3×10⁵ 个/孔密度均匀接种于 6 孔板底部，待细胞完全贴壁后，加入含 10%FBS 的 DMEM 培养基，2 d 后更换为成膜诱导液进行培养，2 周后可获得单一 PBMSC 细胞膜片，用于后续研究。

1.4.2. 组织学观察

将获得的复合细胞膜片与单一细胞膜片行多聚甲醛固定，乙醇梯度脱水，石蜡包埋，切片，常规 HE 染色观察两种细胞膜片组织学情况。

1.4.3. ELISA 法检测成骨、成血管相关蛋白表达

取复合细胞膜片和单一细胞膜片，行成骨诱导培养，分别于成骨诱导 1、5、10 d 收集上清液，利用 ELISA 法检测两组细胞膜片上清液内 ALP、骨钙素（osteocalcin，OCN）和 VEGF 的表达情况。

1.5. 统计学方法

采用 SPSS19.0 统计软件进行分析。数据以均数±标准差表示，组间比较采用独立样本 t 检验；检验水准 α=0.05。

2. 结果

2.1. PBMSC 和 PBEPC 形态学观察与鉴定

倒置相差显微镜观察示，第 3 代 PBMSC 展现出良好的贴壁性，细胞形态较为单一，呈纺锤形或多角形，漩涡状生长。PBMSC 经成骨诱导 21 d 后茜素红染色可见形态大小不一的深红色钙结节出现；经成脂诱导 14 d 后油红 O 染色可见细胞质内出现大量红色脂滴。见图 2。

图 2.

Morphological observation and identification of PBMSC

PBMSC 形态学观察及鉴定

a. 第 3 代 PBMSC 形态学观察（倒置相差显微镜×100）；b. 成骨分化鉴定（茜素红染色×400）；c. 成脂分化鉴定（油红 O 染色×400）

a. Morphological observation of the 3rd generation PBMSC (Inverted phase contrast microscope×100); b. Osteogenic differentiation identification (Alizarin red staining×400); c. Adipogenic differentiation identification (Oil red O staining×400)

倒置相差显微镜观察示，第 3 代 PBEPC 具备良好的贴壁性，细胞形态呈典型铺路石外观，细胞呈团簇样快速生长。PBEPC 贴附于 Matrigel 基质胶表面 8 h 后，细胞逐渐伸出伪足，与周围细胞相互接触，形成类似血管的管腔状结构。见图 3。

图 3.

Morphological observation and identification of PBEPCa. Morphological observation of the 3rd generation PBEPC (Inverted phase contrast microscope×100); b. Tube experiment (Inverted phase contrast microscope×200)

PBEPC 形态学观察及鉴定

a. 第 3 代 PBEPC 形态学观察（倒置相差显微镜×100）；b. 成管实验（倒置相差显微镜×200）

2.2. 细胞膜片相关观测

2.2.1. 形态学观察

倒置相差显微镜观察示，复合细胞膜片组随成膜诱导时间延长，PBMSC 和 PBEPC 均生长迅速，细胞形态逐渐变长，呈漩涡状，两种细胞的界限逐渐消失。见图 4。2 周后复合细胞膜片组和单一细胞膜片组均可见孔板底部有白色半透明膜状物形成，二者无明显差异。见图 5。

图 4.

Observation of composite cell sheet at different time points (Inverted phase contrast microscope×100)

复合细胞膜片成膜诱导各时间点观察（倒置相差显微镜×100）

a. 2 d；b. 5 d；c. 8 d；d. 14 d

a. At 2 days;b. At 5 days; c. At 8 days; d. At 14 days

图 5.

General observation of cell sheets

细胞膜片大体观察

a. 复合细胞膜片；b. 单一细胞膜片

a. Composite cell sheet; b. Single cell sheet

2.2.2. 组织学观察

HE 染色示，两组细胞膜片均由多层细胞堆叠而成，膜片内细胞分布均匀，富含细胞外基质；与单一细胞膜片组相比，复合细胞膜片组膜片更厚，具备更多细胞层数及更高的细胞密度。见图 6。

图 6.

HE staining of cell sheets (×400)

细胞膜片 HE 染色观察（×400）

a. 复合细胞膜片；b. 单一细胞膜片

a. Composite cell sheet;b. Single cell sheet

2.2.3. ELISA 法检测

随诱导时间延长，两组细胞膜片上清液中 ALP、OCN 和 VEGF 表达量均有所增加。复合细胞膜片组诱导培养 5、10 d OCN 表达量显著高于单一细胞膜片组，10 d ALP 表达量显著高于单一细胞膜片组，1、5、10 d VEGF 表达量均显著高于单一细胞膜片组，差异均有统计学意义（P<0.05）；其余各时间点两组间各蛋白表达量比较差异均无统计学意义（P>0.05）。见图 7。

图 7.

The expressions of osteogenic and angiogenic proteins in the supernatant of cell sheets at different time points detected by ELISA

ELISA 法检测成骨诱导各时间点两种细胞膜片上清液中成骨、成血管相关蛋白表达

a. OCN；b. ALP；c. VEGF

a. OCN; b. ALP; c. VEGF

3. 讨论

MSCs 广泛存在于骨髓、脂肪、胎盘、滑膜等多种组织，因其具备良好的多向分化能力，被广泛应用于多种组织修复^[15-17]。但这些骨髓、脂肪等来源的 MSCs 获取，需要采用骨髓穿刺、抽脂术等侵入性操作。Zvaifler 等^[18]最早从人的外周血液中分离得到了具备多向分化能力的 MSCs。本课题组前期尝试从外周血中分离获取 MSCs，应用于构建组织工程骨进行骨缺损修复^[11]。本实验通过外周血动员结合密度梯度离心等方法，成功从兔外周血中分离获取了 MSCs，体外实验结果表明 PBMSC 具备良好的成骨、成脂分化能力。与传统来源 MSCs 相比，PBMSC 取材更加微创，对供体创伤更小，为组织修复提供了一种新的种子细胞来源，在组织工程领域具备良好的应用前景。本实验中的内皮细胞通过外周血采血，结合密度梯度离心法获得。该 PBEPC 具备良好的贴壁性，细胞形态呈现典型的铺路石外观，细胞呈团簇样快速生长，具备良好的内皮细胞成管特性。自 Asahara 等^[19]最早从外周血分离出内皮祖细胞以来，许多研究者从外周血中分离获取内皮祖细胞并应用于组织工程研究中^[20-22]。相比于传统骨髓穿刺获取内皮祖细胞，外周血中分离内皮祖细胞更加微创，具备一定的应用前景。

细胞外基质以及细胞间连接对细胞的增殖分化起着十分重要的作用^[23]。而传统的胰蛋白酶消化获取种子细胞的方式大大破坏了细胞表面相关受体蛋白以及细胞间连接，降低了细胞间以及细胞与细胞外基质的相互作用，一定程度上影响了种子细胞的活性。细胞膜片最早自 Okano 等^[24]发现以来，因其可以尽可能保护细胞膜表面相关蛋白、细胞间连接、细胞-细胞外基质连接等结构，受到越来越多学者关注。细胞膜片是利用高密度接种细胞、成膜诱导以及相关物理化学手段构建的富含细胞外基质的、具备一定机械强度和可操作性的细胞膜片结构^[25-26]。目前构建细胞膜片的方法多种多样，主要包括温敏材料法^[24]、聚合电解质材料法^[27]、磁性脂质体法^[15]、抗坏血酸法^[28]等。研究发现抗坏血酸作为细胞分泌胶原类物质的重要因子，可以快速促进细胞外基质合成与分泌，并能抑制细胞分化^[29]。抗坏血酸法是利用抗坏血酸可以促进细胞分泌细胞外基质的特点，再利用细胞刮刀将细胞膜片从培养皿中刮取获得。因抗坏血酸法简便易行、可重复性高，近年来被广泛应用于细胞膜片的构建^[30]。本实验利用抗坏血酸法成功构建出了具备一定物理特性的细胞膜片。

组织缺损的修复往往依靠多种不同细胞的参与^[31-32]。许多研究通过将内皮细胞与 MSCs 共培养来加强 MSCs 成骨分化能力^[33-35]。Zigdon-Giladi 等^[36]将大鼠 BMSCs 与骨髓来源内皮祖细胞按照 1∶1 细胞比例进行共培养后，接种于生物支架材料上，植入小鼠体内进行骨缺损修复，3 个月后发现共培养体系组的体内成骨能力远远高于单一 MSCs 组。此外，Liang 等^[37]通过分离大鼠 BMSCs 与骨髓来源内皮祖细胞，按照 1∶1 细胞比例进行共培养以及成膜诱导，发现复合细胞膜片的成骨能力远远高于单一 MSCs 细胞膜片。本实验利用兔来源的 PBMSC 与 PBEPC 构建复合细胞膜片，结果发现与单一 PBMSC 细胞膜片相比，复合细胞膜片具备更多的细胞层数以及细胞外基质，且具备更好的成骨分化能力。

综上述，本研究结果显示，利用 PBMSC 与 PBEPC 经共培养、成膜诱导等操作构建的复合细胞膜片，比传统的单一 PBMSC 细胞膜片具备更多的细胞层数和细胞外基质，具有更好的成骨分化能力，为骨缺损修复提供了一种新方法。此外，本课题组将就复合细胞膜片促进组织修复的分子机制以及体内实验作进一步研究探索。

作者贡献：邢飞、段鑫、刘明负责实验设计、实施及文章撰写；陈家磊、龙成、陈然、孙嘉辰负责数据收集整理；孙嘉辰、吴双、陈力负责统计分析；项舟负责对文章的知识性内容作批评性审阅。

利益冲突：所有作者声明，在课题研究和文章撰写过程中不存在利益冲突。课题经费支持没有影响文章观点和对研究数据客观结果的统计分析及其报道。

机构伦理问题：研究方案经四川大学华西医院医学/动物实验伦理委员会批准。实验动物生产许可证号：SCXK（川）2013-026，实验动物使用许可证号：SYXK（川）2013-119。

Funding Statement

国家自然科学基金资助项目（31870961）；中德科学中心资助项目（GZ1219）