Abstract
目的
探索瞬时受体电位香草素受体 4 型通道蛋白(transient receptor potential vanilloid receptor 4,TRPV4)在骨关节炎(osteoarthritis,OA)软骨与正常软骨中的表达差异,为进一步研究其在 OA 防治中的作用提供理论依据。
方法
取膝关节 OA 患者软骨组织(OA 组)与股骨颈骨折患者正常软骨组织(对照组)。其中,OA 组男 6 例,女 9 例;年龄 55~78 岁,平均 69 岁;Kellgren-Lawrence(K-L)评分为(3.0±0.8)分。对照组男 5 例,女 10 例;年龄 57~91 岁,平均 71 岁。两组患者性别及年龄比较差异无统计学意义(P>0.05)。采用 Western blot、实时荧光定量 PCR、Masson 染色以及免疫组织化学染色,观察并比较两组软骨组织中 TRPV4 蛋白及 mRNA 表达差异,以及软骨组织退变程度;分析 OA 组患者 K-L 评分与 TRPV4 阳性细胞率的相关性。
结果
OA 组 TRPV4 蛋白及 mRNA 相对表达量分别为 0.454±0.199、2.951±1.200,高于对照组的 0.165±0.074、1.437±0.682,其中蛋白相对表达量组间差异有统计学意义(t=2.718,P=0.026)。组织染色显示,OA 组软骨细胞排列紊乱,细胞外基质失去正常结构,局部软骨缺损可达深层,退变组织中可见较多 TRPV4 阳性细胞,阳性细胞率为 37.353%±13.496%;对照组软骨细胞层次分明,阳性细胞率仅为 9.642%±3.284%;两组阳性细胞率比较差异有统计学意义(t=7.491,P=0.000)。OA 组 TRPV4 阳性细胞率与 OA 的 K-L 评分成正相关(r=0.775,P=0.001)。
结论
TRPV4 在 OA 软骨组织中表达升高,且其表达升高与 OA 进展有相关性。
Keywords: 骨关节炎, 瞬时受体电位香草素受体 4 型通道蛋白, 软骨, 细胞外基质
Abstract
Objective
To investigate the differential expression of transient receptor potential vanilloid receptor 4 (TRPV4) protein in the osteoarthritis (OA) and normal cartilages, and explore the role of TRPV4 in the prevention and treatment of OA.
Methods
The cartilage tissues from the patients of knee OA (OA group) and femoral neck fracture (control group) were taken. In OA group, there were 6 males and 9 females; the age ranged from 55 to 78 years (mean, 69 years); the Kellgren-Lawrence (K-L) score was 3.0±0.8. In control group, there were 5 males and 10 females; the age ranged from 57 to 91 years (mean, 71 years). There was no significant difference in gender and age between the two groups (P>0.05). Western blot, real-time fluorescence quantitative PCR, Masson staining, and immunohistochemical staining were used to detect the difference in protein and mRNA expressions of TRPV4 between the OA and normal cartilages. Then the relationship between the K-L score of OA and the rate of TRPV4-positive cells was analyzed.
Results
The relative expression of TRPV4 protein and mRNA in OA group were 0.454±0.199 and 2.951±1.200, which were higher than those in control group (0.165±0.074, 1.437±0.682). The difference in relative expression of TRPV4 protein was significant (t=2.718, P=0.026). Histology observation showed that the chondrocytes arranged disorderly in OA group, the structure of extracellular matrix was abnormal, and the cartilage defect reached the deep layer. There were more TRPV4-positive cells in the degenerated tissue, and the rate of TRPV4-positive cells was 37.353%±13.496%. The chondrocytes were arranged well in control group, and the rate of TRPV4-positive cells was only 9.642%±3.284%. There was a significant difference between the two groups (t=7.491, P=0.000). The rate of TRPV4-positive cells in OA group was positively correlated with the OA K-L score (r=0.775, P=0.001).
Conclusion
The TRPV4 expression increased in OA cartilages that may contribute to the development of OA.
Keywords: Osteoarthritis, transient receptor potential vanilloid receptor 4, cartilage, extracellular matrix
骨关节炎(osteoarthritis,OA)是一种以软骨退变为主的疾病,据统计全世界约有 1/4 人口患有此病,是造成人类残疾的第 4 大病因[1]。然而,目前人们对 OA 的病理机制尚缺乏足够认识,因此缺少有效阻断疾病发展的方法。关节软骨退变导致软骨细胞外基质降解是 OA 常见的起始因素,软骨细胞外基质降解可造成局部低渗透压微环境,引起关节肿胀,激活一系列炎性因子,进而破坏软骨组织[2]。瞬时受体电位香草素受体 4 型通道蛋白(transient receptor potential vanilloid receptor 4,TRPV4)是瞬时受体电位通道家族的一种亚型,为细胞膜上一类非电压依赖的钙离子通道蛋白。低渗透压、机械应力及热能均可激活 TRPV4,进而通过钙离子内流来启动一系列生物学反应[3]。目前认为 TRPV4 是软骨细胞膜上调节渗透压的主要离子通道,不仅参与低渗透压引起的炎性反应,其在软骨细胞中过度表达可以引起钙离子内流,进而导致软骨的破坏[4]。本研究通过比较下肢膝关节 OA 患者与无 OA 表现的患者软骨内 TRPV4 表达差异,以及不同程度 OA 患者软骨组织中 TRPV4 表达差异,为进一步研究 TRPV4 在 OA 防治中的作用提供理论依据。
1. 材料与方法
1.1. 研究样本
OA 软骨组织来自 2016 年 9 月—2018 年 12 月于南京医科大学附属南京医院行人工膝关节置换的 15 例 OA 患者(OA 组)。其中,男 6 例,女 9 例;年龄 55~78 岁,平均 69 岁。患者均符合美国风湿病协会 1995 年修订的 OA 诊断标准[5],未合并糖尿病、关节感染及全身系统性疾病。由 2 名受过培训的高年资骨科医生,根据患者站立位 X 线片,分别对 OA 行 Kellgren-Lawrence(K-L)评分,若结果不一致时由第 3 位医师进行评估。患者 K-L 评分为(3.0±0.8)分。
正常软骨组织来自同时间段行人工髋关节置换的 15 例股骨颈骨折患者(对照组)。其中,男 5 例,女 10 例;年龄 57~91 岁,平均 71 岁。经术前询问病史、患髋 CT 检查及术中观察股骨头软骨退变情况排除 OA,未合并糖尿病、关节感染及全身系统性疾病。两组患者性别、年龄比较差异无统计学意义(χ2=0.144,P=0.705;t=0.744,P=0.460)。
1.2. 主要试剂及仪器
TRPV4 兔抗人多克隆抗体(武汉博士德生物材料有限公司);辣根过氧化物酶标记羊抗兔/羊抗鼠二抗、GAPDH 鼠抗人单克隆抗体、兔抗人 TRPV4-IgG 单克隆抗体、酶标羊抗兔 IgG 聚合物(杭州华安生物科技有限公司);Prime Script RT Master Mix(Takara 公司,日本)。PCR 仪(Biometra 公司,美国)。
1.3. 观测指标
1.3.1. Western blot 检测
两组各取 5 例软骨组织标本,生理盐水漂洗干净后组织剪剪碎,液氮中充分研磨成粉末状。加入适量冰预冷的细胞蛋白裂解液混匀,冰上充分裂解 30 min 后,以 13 000×g 离心 30 min,所得上清即为抽提的蛋白,按 BCA 法测定蛋白浓度。按照产品说明书配制 10%SDS-PAGE 凝胶,以每孔蛋白总上样量 30 μg 加入 SDS-PAGE 凝胶泳道进行电泳、转膜,常温下封闭后用 TBST 洗涤聚偏二氟乙烯膜 3 次;加入 TRPV4 兔抗人多克隆抗体(1∶1 000)、GAPDH 鼠抗人单克隆抗体(1∶5 000),4℃ 孵育过夜;加入辣根过氧化物酶标记的羊抗兔、羊抗鼠二抗(1∶5 000),室温下孵育。按 ECL 说明书配制 ECL 发光液,将膜蛋白面与发光液充分接触,放入曝光仪器中,设定不同曝光时间,自动采集、拍照,根据相应图片采用 Image J 软件计算 TRPV4 蛋白相对表达量。
1.3.2. 实时荧光定量 PCR 检测
参照 Primer Bank 及 NCBI 数据库,设计并合成 TRPV4 基因上下游引物,β-actin 为内参基因。引物序列:TRPV4 上游 5'-GATGGGCGACCAAATCTGC-3',下游 5'-GAGGACTCATATAGGGTGGACTC-3';β-actin 上游 5'-ACTCTTCCAGCCTTCCTTCC-3',下游 5'-AGCACTGTGTTGGCGTACAG-3'。
两组各取 5 例软骨组织样本,液氮中研磨成粉末状后,用总 RNA 提取试剂盒提取样本 RNA,核酸定量仪测定浓度。参照 Prime Script RT Master Mix 产品说明书,以 1 µg RNA 配制逆转录反应体系;PCR 仪上设定反应程序:37℃、15 min,85℃、5 s,4℃、30 min,完成后所得逆转录产物即为 cDNA。参照产品说明书配制实时定量 PCR 反应体系,按照说明书设置反应条件:95℃、30 s;95℃、5 s,60℃、34 s,共 40 个循环。以 β-actin 为内参,计算 TRPV4 mRNA 相对表达量。每组实验重复 3 次。
1.3.3. 组织学及免疫组织化学染色
两组各取 5 例软骨组织(连带部分软骨下骨),置于 4% 甲醛固定后 20%EDTA 脱钙,隔日换液直至可切片,片厚 5 μm。采用 Masson 染色观察组织退变程度。免疫组织化学染色观察 TRPV4 表达,选用兔抗人 TRPV4-IgG 单克隆抗体为一抗、酶标羊抗兔 IgG 聚合物为二抗,阿利新蓝复染,镜下观察 TRPV4 阳性染色为棕黄色,软骨基质染为蓝色。每个标本选取 5 个切片,每张切片中随机选择 10 个高倍视野,计数阳性细胞,按照以下公式计算阳性细胞率:染色阳性细胞数/细胞总数×100%。
1.4. 统计学方法
采用 SPSS13.0 统计软件进行分析。数据以均数±标准差表示,OA 组及对照组间比较采用独立样本 t 检验;采用 Spearman 秩相关分析 OA 组软骨 TRPV4 阳性细胞率与 OA 严重程度(K-L 评分)的相关性。检验水准 α=0.05。
2. 结果
2.1. Western blot 及实时定量荧光 PCR 检测
Western blot 检测 OA 组 TRPV4 蛋白相对表达量为 0.454±0.199,较对照组 0.165±0.074 明显升高,差异有统计学意义(t=2.718,P=0.026)。见图1。
图 1.
Protein expression of TRPV4 in cartilage tissue of two groups detected by Western blot analysis
Western blot 检测两组软骨组织中 TRPV4 蛋白表达a. 对照组;b. OA 组
a. Control group; b. OA group
实时荧光定量 PCR 检测 OA 组 TRPV4 mRNA 相对表达量为 2.951±1.200,较对照组 1.437±0.682 明显升高,但差异无统计学意义(t=2.415,P=0.073)。
2.2. 组织学及免疫组织化学染色观察
OA 组软骨细胞排列紊乱,细胞外基质失去正常结构,局部软骨缺损可达深层,退变组织中可见较多 TRPV4 阳性细胞,阳性细胞率为 37.353%±13.496%。其中软骨退变严重者,其软骨表面破损、毛糙,细胞外基质退变严重,全层软骨组织内可见 TRPV4 染色较深,多分布在细胞膜及细胞质内(图2);而软骨退变较轻者细胞外基质退变程度相对较轻,靠近关节面的退变组织中 TRPV4 染色较多(图3)。对照组软骨细胞层次分明,可见少量 TRPV4 阳性细胞,阳性细胞率为 9.642%±3.284%(图4)。两组阳性细胞率比较差异有统计学意义(t=7.491,P=0.000)。
图 2.
Histology observation of severe degenerated cartilage in OA group
OA 组退变严重的软骨组织染色观察
左侧为×2、右侧为×10 a. Masson 染色;b. TRPV4 免疫组织化学染色
Left for×2, right for×10 a. Masson staining; b. TRPV4 immunohistochemistry staining
图 3.
Histology observation of mild degenerated cartilage in OA group
OA 组退变较轻的软骨组织染色观察
左侧为×2、右侧为×10 a. Masson 染色;b. TRPV4 免疫组织化学染色
Left for×2, right for×10 a. Masson staining; b. TRPV4 immunohistochemistry staining
图 4.
Histology observation of cartilage in control group
对照组软骨组织染色观察
左侧为×2、右侧为×10 a. Masson 染色;b. TRPV4 免疫组织化学染色
Left for×2, right for×10 a. Masson staining; b. TRPV4 immunohistochemistry staining
2.3. TRPV4 阳性细胞率与 OA 严重程度相关性分析
OA 组 TRPV4 阳性细胞率与 OA 的 K-L 评分成正相关(r=0.775,P=0.001)。
3. 讨论
关节软骨由软骨外基质及散在其中的软骨细胞组成,软骨外基质是由水(60%~85%)、Ⅱ型胶原(15%~22%)、蛋白多糖(4%~7%),以及其他一些重要胶原构成的复杂网格样结构,对关节软骨起到压力支撑及应力分散作用[6]。在步态的不同时相,关节中的水分及营养物质在关节液与软骨组织中保持动态平衡,行走着地时增加的压力能将水分挤出到关节腔内,而抬起时降低的压力能重新将水分吸收入软骨中[7]。研究表明,关节液的渗透压对调节关节功能起到重要作用,而 OA 患者关节液的渗透压明显低于健康志愿者[8],软骨外基质降解后产生的低渗环境,可以激活 TRPV4 的表达,增加 IL-1β 等炎性因子的表达,进一步降解软骨外基质,形成正循环,从而促进 OA 的进展[9]。本研究采用 Western blot、实时荧光定量 PCR 检测方法,分别从蛋白及 mRNA 水平比较 OA 与正常软骨中 TRPV4 表达差异。结果显示 OA 组中 TRPV4 蛋白相对表达量明显高于对照组,差异有统计学意义(P<0.05);而 mRNA 相对表达量差异无统计学意义(P>0.05)。我们分析可能与实验样本较少、样本组内差异较大有一定关系。此外,基因表达后通过转录、翻译等一系列过程才能造成蛋白水平的改变,但该过程受到许多因素的调控,所以两组存在 mRNA 水平无明显差异、而在蛋白水平有差异的可能性。一般来说,机体主要是通过蛋白水平来调控生物功能,所以 TRPV-4 在蛋白水平的差异更能说明该蛋白的高表达与 OA 发生、发展有关。
离子通道在软骨细胞的机械应力传导、体积调节、凋亡及软骨分化方面起到重要作用[10]。Walter 等[11]发现在退变的椎间盘组织中 TRPV4 表达增多,且多分布在蛋白多糖的降解区域,提示其与椎间盘的退变相关。本研究免疫组织化学染色观察也发现 TRPV4 阳性细胞多分布于靠近关节面的区域,细胞外基质退变越严重,其阳性细胞染色率就越高。有研究表明健康的关节软骨依靠细胞外基质的合成与降解代谢而保持其稳态,而在 OA 病理状态下,细胞外基质的变化不仅反映疾病的状态,也体现了软骨细胞活性与功能[12]。OA 早期即可见胶原与蛋白多糖分布改变,软骨细胞肿胀与细胞簇形成,引起软骨弹性模量降低、机械应力传导能力下降,进而激活包括 TRPV4 在内的一系列生物活性物质而加重 OA[13]。在干细胞的三维培养分化过程中,细胞体积的改变同样可以激活 TRPV4,通过激活 RUNX-2 基因来促进其向成骨细胞分化[14]。本研究同样观察到 TRPV4 染色阳性细胞与阴性细胞相比体积稍大,且多分布于降解基质周围,直接证明了局部的低渗透压环境引起细胞肿胀,后续骨赘形成可能与之有关。
低渗透压激活 TRPV4 后,可引起细胞内钙离子浓度升高,从而引起一系列与转录、迁移及增殖有关的生理效应,导致培养的软骨细胞去分化;降低钙离子浓度则可增加胶原与蛋白多糖的合成,减少软骨细胞的肥大[15]。研究表明,特异性敲除软骨细胞的 TRPV4,可减轻成年大鼠衰老所致的 OA 严重程度,但不能阻止创伤后关节炎,这可能与创伤后关节炎的发病机制与衰老所致的 OA 机制不同有关[16]。低渗透压通过 ERK1/2 的磷酸化激活来快速活化 TRPV4,使用 PD98085(一种 ERK 通路的特异性抑制剂)阻断 ERK1/2 后,可阻断低渗透压引起的 TRPV4 高表达[17]。
OA 的 K-L 评分简单实用,在临床上为广大医师所采用,主要通过关节间隙狭窄程度、骨赘增生等评定 OA 程度[18]。本研究相关分析结果显示 OA 越严重,TRPV4 阳性细胞率也越高,说明 TRPV4 与 OA 的发展有一定相关性。OA 早期表现不典型,多为非特异性关节疼痛及肿胀,因此容易被患者忽略,从而失去早期干预机会,若能够通过检测某种蛋白质的改变来协助诊断,则可以通过早期干预来阻止 OA 进展[19]。TRPV4 在 OA 早期阶段,即细胞外基质降解阶段即被激活,可能有较好的预测价值[20]。综上述,TRPV4 有可能用于 OA 的早期诊断。但本研究不足之处在于仅观察了 TRPV4 在不同类型患者软骨组织内的差异表达,而未检测两组患者血液或关节液中的浓度是否有差异,这将是下一步研究方向。
作者贡献:姚旺祥负责实验设计与实施,论文撰写;戴晗豪负责临床样本收集,统计分析;董佩龙负责临床样本收集,数据整理;桂鉴超负责实验设计、论文修改及审阅。
利益冲突:所有作者声明,在课题研究和文章撰写过程中不存在利益冲突。课题经费支持没有影响文章观点和对研究数据客观结果的统计分析及其报道。
Funding Statement
国家自然科学基金面上项目(81672210)
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