Abstract
目的
探讨 H2O2 诱导的 miR-21 下调对 MC3T3-E1 细胞成骨分化的作用及机制。
方法
取 MC3T3-E1 细胞系，培养传至第 7 代进行实验。取 MC3T3-E1 细胞，以不同浓度 H2O2（0、40、80、160、320 μmol/L）培养，经实时荧光定量 PCR 检测 miR-21 表达、MTS 法检测细胞活性，选择 H2O2 最合适实验浓度。取 MC3T3-E1 细胞分为空白对照组（A 组）、H2O2 组（B 组）、成骨诱导组（C 组）、H2O2+成骨诱导组（D 组），对应培养后实时荧光定量 PCR 检测 miR-21 表达以及成骨标志基因 Runx2、骨桥蛋白（osteopontin，OPN）及Ⅰ型胶原蛋白（collagen type Ⅰ alpha 1，Col1a1）表达，Western blot 检测磷酸酶与张力蛋白同源物（phosphatase and tensin homolog，PTEN）蛋白表达，茜素红染色观察细胞外钙基质沉积情况，分析 H2O2 对 MC3T3-E1 细胞成骨分化的影响。然后再取 MC3T3-E1 细胞，分为 H2O2 组（A1 组）、H2O2+成骨诱导组（B1 组）、H2O2+miR-21 抑制剂+成骨诱导组（C1 组）、H2O2+miR-21 抑制剂阴性对照+成骨诱导组（D1 组）；以及 H2O2 组（A2 组）、H2O2+成骨诱导组（B2 组）、H2O2+siRNA-PTEN 阴性对照+成骨诱导组（C2 组）、H2O2+siRNA-PTEN+成骨诱导组（D2 组）；对应培养后检测成骨标志基因（Runx2、OPN、Col1a1）表达以及细胞外钙基质沉积情况，分析下调 miR-21 或沉默 PTEN 对细胞成骨分化的影响。
结果
结合实时荧光定量 PCR 检测以及 MTS 法结果，选择 160 μmol/L H2O2 进行实验。第 1、2 周 B 组 miR-21 相对表达量低于 A 组（P<0.05），D 组低于 C 组（P<0.05）；第 2 周 C 组 PTEN 蛋白相对表达量均低于 A、D 组（P<0.05）；第 1、2 周 D 组 Runx2、OPN 及 Col1a1 mRNA 相对表达量均低于 C 组（P<0.05），茜素红染色显示 D 组钙基质沉积少于 C 组。C1 组 PTEN 蛋白相对表达量高于 D1 组（P<0.05）；第 1、2 周 B1、D1 组 Runx2、OPN mRNA 相对表达量均高于 C1 组（P<0.05），第 2 周 B1、D1 组 Col1a1 mRNA 均高于 C1 组（P<0.05）；茜素红染色显示 C1 组钙基质沉积少于 B1、D1 组。第 1 周 D2 组 OPN、Col1a1 mRNA 相对表达量高于 B2、C2 组（P<0.05），第 3 周茜素红染色显示 D2 组钙基质沉积明显多于 B2、C2 组。
结论
H2O2 抑制 MC3T3-E1 成骨分化可能与 miR-21 下调有关。
Keywords: H2O2, 氧化应激, miR-21, 成骨分化, MC3T3-E1 细胞
Abstract
Objective
To explore the effect and mechanism of miR-21 down-regulated which was induced by H2O2 on osteogenic differentiation of MC3T3-E1 cells.
Methods
MC3T3-E1 cells were cultured and passaged, and the 7th generation cells were harvested to use in experiment. The MC3T3-E1 cells were treated with different concentrations (0, 40, 80, 160, and 320 μmol/L) of H2O2. The expression of miR-21 was detected by real-time quantitative PCR (RT-PCR) and the cell viability was determined by MTS. Then the appropriate concentration of H2O2 was obtained. To analyze the effect of H2O2 on osteogenic differentiation of MC3T3-E1 cells, the MC3T3-E1 cells were divided into blank control group (group A), H2O2 group (group B), osteogenic induction group (group C), and H2O2+osteogenic induction group (group D). The expression of miR-21 and the osteogenesis related genes expressions of Runx2, osteopontin (OPN), and collagen type Ⅰ alpha 1 (Col1a1) were detected by RT-PCR. The expression of phosphatase and tensin homolog (PTEN) was detected by Western blot. The extracellular calcium deposition was detected by alizarin red staining. To analyze the effect on osteogenic differentiation of MC3T3-E1 cells after the transfection of miR-21 inhibitor and siRNA-PTEN, the MC3T3-E1 cells were divided into H2O2 group (group A1), H2O2+osteogenic induction group (group B1), H2O2+osteogenic induction+miR-21 inhibitor group (group C1), and H2O2+osteogenic induction+miR-21 inhibitor negative control group (group D1); and H2O2 group (group A2), H2O2+osteogenic induction group (group B2), H2O2+osteogenic induction+siRNA-PTEN negative control group (group C2), and H2O2+osteogenic induction+siRNA-PTEN group (group D2). The osteogenesis related genes were detected by RT-PCR and the extracellular calcium deposition was detected by alizarin red staining.
Results
The results of MTS and RT-PCR showed that the appropriate concentration of H2O2 was 160 μmol/L. The expression of miR-21 was significantly lower in group B than in group A at 1 and 2 weeks (P<0.05). The expression of miR-21 was significantly lower in group D than in group C at 1 and 2 weeks (P<0.05). The expression of PTEN protein was significantly lower in group C than in groups A and D (P<0.05). The mRNA expressions of Runx2, OPN, and Col1a1 were significantly lower in group D than in group C at 1 and 2 weeks (P<0.05). The extracellular calcium deposition in group D was obviously less than that in group C. The expression of PTEN protein was significantly higher in group C1 than in group D1 (P<0.05). The mRNA expressions of Runx2 and OPN were significantly lower in group C1 than in groups B1 and D1 at 1 and 2 weeks (P<0.05). The mRNA expression of Col1a1 was significantly lower in group C1 than in groups B1 and D1 at 2 weeks (P<0.05). The extracellular calcium deposition in group C1 was obviously less than those in groups B1 and D1. The mRNA expressions of OPN and Col1a1 were significantly higher in group D2 than in groups B2 and C2 at 1 week (P<0.05). The extracellular calcium deposition in group D2 was obviously more than those in groups B2 and C2.
Conclusion
H2O2 inhibits the osteogenic differentiation of MC3T3-E1 cells, which may be induced by down-regulating the expression of miR-21.
Keywords: H2O2, oxidative stress, miR-21, osteogenic differentiation, MC3T3-E1 cells
目前，如何提高骨修复材料的修复效率仍是骨组织工程面临的重要问题。骨修复过程包括 MSCs 的招募、增殖、成骨分化等，其过程十分复杂，并且受生长因子、激素及细胞外基质等的调控[1-2]。在骨折局部及骨修复材料植入早期，局部 MSCs 可因组织缺血再灌注后发生低氧应激、氧化应激[3-4]。Chen 等[5]发现在猪腰椎融合模型中，microRNAs 对骨形成起到重要调控作用。microRNAs 是一类非编码小 RNA 分子，通过裂解靶基因或抑制翻译调控细胞增殖、分化、凋亡等生物活动。多项研究表明，在 H2O2 模拟的氧化应激模型中，H2O2 可调控 miR-21 表达，从而抑制细胞凋亡[6-8]，磷酸酶与张力蛋白同源物（phosphatase and tensin homolog，PTEN）在许多细胞系中为 miR-21 的靶基因，同样受 H2O2 调控[6]。同时，miR-21 及 PTEN 在 MSCs 成骨分化方面有着重要调控作用[9-10]。因此，在骨修复材料植入早期，局部 MSCs 氧化应激状态下，H2O2 可能通过调控 miR-21 影响细胞成骨分化。MC3T3-E1 细胞（小鼠颅顶前成骨细胞）由 MSCs 分化而来，是骨形成的关键细胞。本研究旨在观察 H2O2 处理后的 MC3T3-E1 细胞，探索氧化应激状态下 miR-21 表达及其对 MC3T3-E1 成骨分化的作用及机制。
1. 材料与方法
1.1. 主要试剂与仪器
MC3T3-E1 细胞系由美国 ATCC 细胞库提供；α-MEM 培养基（HyClone 公司，美国）；FBS（杭州四季青生物工程有限公司）；胰蛋白酶（GIBCO 公司，美国）；Trizol 试剂（Invitrogen 公司，美国）；MTS（上海碧云天生物技术有限公司）；PBS、H2O2、RIPA 裂解液、BCA 试剂盒（Sigma 公司，美国）；氯仿、异丙醇（广州化学试剂厂）；逆转录试剂盒、实时定量 PCR 试剂盒（TaKaRa 公司，日本）；PTEN 抗体（Abcam 公司，英国）；转染试剂 miR-21 抑制剂、miR-21 抑制剂阴性对照、siRNA-PTEN、siRNA-PTEN 阴性对照、riboFECTTM CP 转染试剂（广州锐博生物科技有限公司）。实验引物均由华大基因公司合成。
细胞培养瓶、培养板（Corning 公司，美国）；TS100 倒置光学/荧光多功能显微镜（Nikon 公司，日本）；NanoDrop 2000 分光光度计、移液器、酶标仪（Thermo 公司，美国）；PCR 仪（Bio-Rad 公司，美国）。
1.2. 细胞培养及传代
取 MC3T3-E1 细胞系，加入完全培养液（含 10%FBS 的 α-MEM 培养基），置于 37℃、5% CO2 及 95% 饱和湿度的恒温培养箱中培养，每 2～3 天换液 1 次。待细胞生长至 80%～90% 融合度时，弃原培养液，PBS 清洗 2～3 次，37℃、0.05% 胰蛋白酶消化 1～3 min，加入完全培养液终止反应，用移液器反复吹打若干次，室温下，以离心半径 10 cm、1 200 r/min 离心 5 min，弃上清后加入完全培养液重悬细胞，按 1∶4 比例进行传代培养。取第 7 代细胞进行实验。
1.3. 不同浓度 H2O2 对 MC3T3-E1 细胞 miR-21 表达的影响
取 MC3T3-E1 细胞接种于 6 孔板，每孔 2×105 个，加入完全培养基培养，待细胞达 70%～80% 融合时，加入不同浓度 H2O2（0、40、80、160、320 μmol/L）。继续培养 6 h 后取细胞行实时荧光定量 PCR 检测 miR-21 表达。
按照 Trizol 说明书方法提取细胞总 RNA，NanoDrop 2000 分光光度计检测总 RNA 纯度及含量，逆转录总 RNA，cDNA 置于–20℃ 保存。根据实时定量 PCR 试剂盒说明书进行反应，反应总体系 10 μL；反应条件：95℃、10 min，95℃、15 s，60℃、35 s，40 个循环；miR-21 引物序列见表 1，以 U6 作为内参，采用 2–ΔΔCt 方法计算 miR-21 相对表达量。实验重复 3 次。
表 1.
Primer sequences for target genes
各基因引物序列
| 基因
Gene |
引物序列（5′→3′）
Primer sequence (5′→3′) |
| Runx2 | 上游 TCGTCAGCATCCTATCAGTT
Upstream |
| 下游 GCGTCAACACCATCATTCT
Downstream |
|
| OPN | 上游 GAGGAAACCAGCCAAGGTAA
Upstream |
| 下游 GCAAATCACTGCCAATCTCA
Downstream |
|
| Col1a1 | 上游 CCTGGCAAAGACGGACTCA
Upstream |
| 下游 GGGCTGCGGATGTTCTCAAT
Downstream |
|
| GAPDH | 上游 GGAAGGTGAAGGTCGGAGTCAAC
Upstream |
| 下游 CTCGCTCCTGGAAGATGGTGATG
Downstream |
|
| miR-21 | CAGGTAGCTTATCAGACTGATGTTGA |
| U6 | 上游 CTCGCTTCGGCAGCACA
Upstream |
| 下游 AACGCTTCACGAATTTGCGT
Downstream |
1.4. 不同浓度 H2O2 对 MC3T3-E1 细胞活力的影响
取 MC3T3-E1 细胞接种于 96 孔板，每孔 1×104 个，加入完全培养基培养 24 h 后，加入不同浓度 H2O2（0、40、80、160、320 μmol/L），每个浓度 3 复孔。继续培养，2～3 d 换液 1 次。培养 1 周时采用 MTS 法检测细胞活性，设无细胞孔为调零孔，于酶标检测仪 490 nm 波长处测定吸光度（A）值。细胞活力=（H2O2 各浓度组 A 值—调零孔A 值）/（0 μmol/L 组 A 值—调零孔A 值）×100%。
根据 miR-21 表达及细胞活力检测结果，选择抑制细胞增殖的 H2O2 最佳浓度进行后续实验。
1.5. H2O2 对 MC3T3-E1 细胞成骨分化的影响
1.5.1. 实验分组
根据培养条件不同，将 MC3T3-E1 细胞分为 4 组。空白对照组（A 组）：MC3T3-E1 细胞以完全培养基正常培养。H2O2 组（B 组）：首先采用含 H2O2 的完全培养基培养 1 周后，更换为不含 H2O2 的完全培养基继续培养。成骨诱导组（C 组）：采用成骨诱导培养基（含 50 μg/mL 维生素 C、10 mmol/L β-甘油磷酸钠及 100 nmol/L 地塞米松的完全培养基）培养。H2O2+成骨诱导组（D 组）：首先采用含 H2O2 的成骨诱导培养基培养，期间 2～3 d 换液 1 次，培养 1 周后更换为不含 H2O2 的成骨诱导培养基培养。
1.5.2. 观测指标
① 实时荧光定量 PCR 检测：培养后第 1、2、3 周取 4 组细胞检测 miR-21 表达，第 1、2 周检测成骨标志基因 Runx2、骨桥蛋白（osteopontin，OPN）及Ⅰ型胶原蛋白（collagen type I alpha 1，Col1a1）表达。参照 1.3 方法检测 miR-21 表达，成骨标志基因检测内参改为 GAPDH，反应条件为 95℃、10 min，95℃、15 s，60℃、30 s，72℃、20 s，40 个循环，其余操作步骤相同，引物序列见表 1。实验重复 3 次。
② Western blot 检测：培养后第 2 周取 A、C、D 组细胞检测 PTEN 蛋白表达。使用 RIPA 裂解液收集细胞总蛋白，BCA 法检测蛋白浓度，上样、SDS-PAGE 凝胶电泳、以 200 mA 恒流 1 h 转印至聚偏氟乙烯膜、5% 脱脂奶粉中封闭 1 h，加入 PTEN 抗体（1∶1 000）或 GAPDH 抗体（1∶1 000），4℃ 过夜。TBST 洗 3 次，每次 10 min，加入二抗（1∶3 000）室温孵育 1 h，TBST 洗 4 次，每次 10 min；加入 ECL 发光剂、显影、定影。釆用 Image J 软件测量条带吸光度（A）值，以其与 GAPDH 的比值作为目标蛋白相对表达量。实验重复 3 次。
③ 茜素红染色：培养后第 3 周取 4 组细胞行茜素红染色。吸去培养基，PBS 清洗 2 次，4% 多聚甲醛 1 mL 常温下固定 15 min，吸去多聚甲醛，双蒸水冲洗 3 次，常温下加入 1 mL 40 mol/L 茜素红，染色 15～20 min，双蒸水冲洗 3～5 次洗去茜素红。大体观察细胞外钙基质沉积情况。
1.6. 下调 miR-21 对 MC3T3-E1 细胞成骨分化的影响
实验分为 4 组，分别为 H2O2 组（A1 组）、H2O2+成骨诱导组（B1 组）、H2O2+miR-21 抑制剂+成骨诱导组（C1 组）、H2O2+miR-21 抑制剂阴性对照+成骨诱导组（D1 组）。A1、B1 组细胞处理方法参照 1.5.1 中 B、D 组；C1、D1 组：取 MC3T3-E1 细胞接种于 6 孔板，每孔 1×105 个，待细胞达 30%～50% 融合后，按照 riboFECTTM CP 转染试剂说明书，将 100 nmol/L miR-21 抑制剂、miR-21 抑制剂阴性对照分别转染至 MC3T3-E1 细胞，24 h 后换液，给予 H2O2 及成骨诱导处理，具体方法参照 1.5.1 中 D 组。
培养 24 h 后实时荧光定量 PCR 检测A1、C1、D1 组的 miR-21 表达水平，评价转染效率；48 h 时采用 Western blot 检验上述 3 组 PTEN 蛋白表达；第 1、2 周采用实时荧光定量 PCR 检测 4 组细胞成骨标志基因（Runx2、OPN、Col1a1）表达，第 3 周行茜素红染色观察。方法参照 1.5.2。
1.7. 沉默 PTEN 对MC3T3-E1细胞成骨分化的影响
实验分为 4 组，分别为 H2O2 组（A2 组）、H2O2+成骨诱导组（B2 组）、H2O2+siRNA-PTEN 阴性对照+成骨诱导组（C2 组）、H2O2+siRNA-PTEN+成骨诱导组（D2 组）。A2、B2 组细胞处理方法同 1.5.1 中的 B、D 组；C2、D2 组除分别采用 50 nmol/L siRNA-PTEN 阴性对照及 siRNA-PTEN 转染细胞外，其余处理方法参照 1.6 中的 C1、D1 组。48 h 后 Western blot 检测 A2、C2、D2 组 PTEN 蛋白表达，评价沉默效果。第 1、2 周采用实时荧光定量 PCR 检测 4 组细胞成骨标志基因（Runx2、OPN、Col1a1）表达，第 3 周行茜素红染色观察。方法参照 1.5.2。
1.8. 统计学方法
采用 SPSS17.0 统计软件进行分析。数据以均数±标准差表示，两组间比较采用独立样本 t 检验；多组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用 SNK 检验。检验水准 α=0.05。
2. 结果
2.1. 不同浓度 H2O2 对 MC3T3-E1 细胞 miR-21 表达及活力的影响
H2O2 处理细胞 6 h 后，160、320 μmol/L 组 miR-21 表达较 0 μmol/L 组明显下调，比较差异有统计学意义（P<0.05）；其余组间比较，差异无统计学意义（P>0.05）。见图 1。
图 1.
The expression of miR-21 after exposing to different con centrations of H2O2 detected by RT-PCR
实时荧光定量 PCR 检测不同浓度 H2O2 处理后 MC3T3- E1 细胞 miR-21 表达
H2O2 处理细胞 1 周后，160、320 μmol/L 组细胞活力较 0 μmol/L 组明显下降，比较差异有统计学意义（P<0.05）；其余组间比较，差异无统计学意义（P>0.05）。见图 2。
图 2.
The cell viability after exposing to different concentra tions of H2O2 determined by MTS
MTS 测定不同浓度 H2O2 处理后 MC3T3-E1 细胞活力
综合以上结果，选择 160 μmol/L H2O2 进行下一步实验。
2.2. H2O2 对 MC3T3-E1 细胞成骨分化过程中 miR-21 及 PTEN 表达的影响
2.2.1. 实时荧光定量 PCR 检测
与 A 组相比，第 1、2、3 周 C、D 组 miR-21 相对表达量增高，第 1、2 周 B 组降低；与 B 组相比，第 1、2、3 周 C、D 组 miR-21 相对表达量表达增高；与 C 组相比，第 1、2 周 D 组 miR-21 相对表达量表达降低；以上组间比较差异均有统计学意义（P<0.05）。其余各组间比较，差异均无统计学意义（P>0.05）。见图 3a。
图 3.
The effect of H2O2 on the expression of miR-21 and PTEN after inducing osteogenic differentiation of MC3T3-E1 cells
H2O2 对 MC3T3-E1 细胞成骨分化过程中 miR-21 及 PTEN 表达的影响
a. 实时荧光定量 PCR 检测 miR-21 表达；b. Western blot 检测 PTEN 蛋白表达 1：A 组 2：C 组 3：D 组
a. The expression of miR-21 detected by RT-PCR; b. The expression of PTEN protein detected by Western blot 1: Group A 2: Group C 3: Group D
2.2.2. Western blot 检测
第 2 周 A、C、D 组 PTEN 蛋白相对表达量分别为 0.77±0.02、0.47±0.04、0.71±0.03。与 A 组相比，C、D 组 PTEN 蛋白相对表达量降低，比较差异有统计学意义（P<0.05）；与 C 组相比，D 组表达升高，比较差异有统计学意义（P<0.05）。见图 3b。
2.3. H2O2 对 MC3T3-E1 细胞成骨分化的影响
2.3.1. 实时荧光定量 PCR 检测
第 1 周，C、D 组 Runx2、OPN mRNA 相对表达量均高于 A、B 组，C 组 Col1a1 mRNA 相对表达量高于 A、B 组，D 组 Runx2、OPN 及 Col1a1 mRNA 相对表达量均低于 C 组，比较差异均有统计学意义（P<0.05）；其余各组间比较，差异无统计学意义（P>0.05）。
第 2 周，C、D 组 Runx2、OPN 及 Col1a1 mRNA 相对表达量均高于 A、B 组，D 组均低于 C 组，比较差异均有统计学意义（P<0.05）；其余各组间比较，差异无统计学意义（P>0.05）。见表 2。
表 2.
Comparison of expressions of osteogenesis related genes between groups (n=3,
)
各组成骨标志基因表达比较（n=3，
）
| 组别
Group |
Runx2 | OPN | Col1a1 | |||||
| 第 1 周
One week |
第 2 周
Two weeks |
第 1 周
One week |
第 2 周
Two weeks |
第 1 周
One week |
第 2 周
Two weeks |
|||
|
*与 A 组比较 P<0.05，#与 B 组比较 P<0.05，△与 C 组比较 P<0.05
*Compared with group A, P<0.05;# compared with group B, P<0.05;△compared with group C, P<0.05 | ||||||||
| A | 1.00±0.13△ | 1.00±0.13△ | 1.00±0.07△ | 1.00±0.06△ | 1.00±0.14△ | 1.00±0.05△ | ||
| B | 0.85±0.16△ | 1.04±0.17△ | 1.26±0.03△ | 1.04±0.01△ | 0.91±0.10△ | 0.90±0.08△ | ||
| C | 1.92±0.19*# | 2.50±0.19*# | 16.55±0.75*# | 5.05±0.23*# | 1.40±0.20*# | 2.21±0.09*# | ||
| D | 1.34±0.12*#△ | 1.74±0.23*#△ | 6.44±0.07*#△ | 3.91±0.42*#△ | 0.98±0.12△ | 1.68±0.13*#△ | ||
| 统计值
Statistic |
F=28.817
P= 0.000 |
F=45.157
P= 0.000 |
F=1 110.279
P= 0.000 |
F=217.433
P= 0.000 |
F=7.019
P=0.012 |
F=136.805
P= 0.000 |
||
2.3.2. 茜素红染色
与 A、B 组相比，C、D 组钙基质沉积增多；D 组钙基质沉积较 C 组减少。见图 4。
图 4.
Observation of alizarin red staining
茜素红染色大体观察
a. A 组；b. B 组；c. C 组；d. D 组
a. Group A; b. Group B; c. Group C; d. Group D
2.4. 下调 miR-21 对MC3T3-E1细胞成骨分化的影响
2.4.1. 转染效率检测
培养 24 h ，实时荧光定量 PCR 检测示 A1、C1、D1 组 miR-21 相对表达量分别为 1.00±0.08、0.27±0.02、0.94±0.05。C1 组 miR-21 相对表达量低于 A1 组及 D1 组，比较差异有统计学意义（P<0.05）；A1 组及 D1 组间比较差异无统计学意义（P>0.05）。
2.4.2. Western blot 检验
培养 48 h，Western blot 显示 A1、C1、D1 组 PTEN 蛋白相对表达量分别为 0.45±0.03、0.57±0.03、0.43±0.02。C1 组 PTEN 蛋白相对表达量均高于 A1 组及 D1 组，比较差异有统计学意义（P<0.05）；A1 组及 D1 组间比较差异无统计学意义（P>0.05）。见图 5。
图 5.
The expression of PTEN protein after the transfection of miR-21 inhibitor detected by Western blot
miR-21 抑制剂转染后 Western blot 检测 PTEN 蛋白表达
1：A1 组 2：C1 组 3：D1 组
1: Group A1 2: Group C1 3: Group D1
2.4.3. 实时荧光定量 PCR 检测
第 1 周，B1、D1 组 Runx2、OPN mRNA 相对表达量均高于 A1、C1 组，C1 组 OPN mRNA 相对表达量高于 A1 组，比较差异均有统计学意义（P<0.05）；其余各组间比较，差异无统计学意义（P>0.05）。
第 2 周，B1、C1、D1 组 Runx2、OPN mRNA 相对表达量均高于 A1 组，B1、D1 组 Col1a1 mRNA 相对表达量均高于 A1 组，B1、D1 组 Runx2、OPN 及 Col1a1 mRNA 均高于 C1 组，比较差异均有统计学意义（P<0.05）；其余各组间比较，差异无统计学意义（P>0.05）。见表 3。
表 3.
Comparison of expressions of osteogenesis related genes after the transfection of miR-21 inhibitor between groups (n=3,
)
miR-21 抑制剂转染后各组成骨标志基因表达比较（n=3，
）
| 组别
Group |
Runx2 | OPN | Col1a1 | |||||
| 第 1 周
One week |
第 2 周
Two weeks |
第 1 周
One week |
第 2 周
Two weeks |
第 1 周
One week |
第 2 周
Two weeks |
|||
|
*与 A1 组比较 P<0.05，#与 B1 组比较 P<0.05，△与 C1 组比较 P<0.05
* Compared with group A1, P<0.05;#compared with group B1, P<0.05;△ compared with group C1, P<0.05 | ||||||||
| A1 | 1.00±0.05# | 1.00±0.07#△ | 1.00±0.07#△ | 1.00±0.08#△ | 1.00±0.09 | 1.00±0.10# | ||
| B1 | 1.38±0.12*△ | 1.83±0.06*△ | 8.51±0.10*△ | 4.73±0.33*△ | 0.94±0.11 | 1.33±0.14*△ | ||
| C1 | 1.07±0.06# | 1.37±0.12*# | 6.44±0.07*# | 3.26±0.27*# | 1.03±0.09 | 0.84±0.12# | ||
| D1 | 1.35±0.07*△ | 1.92±0.11*△ | 8.66±0.24*△ | 4.50±0.39*△ | 0.96±0.06 | 1.36±0.12*△ | ||
| 统计值
Statistic |
F=16.866
P= 0.001 |
F=62.471
P= 0.004 |
F=2 010.036
P= 0.000 |
F=102.972
P= 0.011 |
F=0.682
P=0.590 |
F=13.356
P= 0.002 |
||
2.4.4. 茜素红染色
第 3 周茜素红染色示 B1、C1、D1 组钙基质沉积多于 A1 组，C1 组钙基质沉积明显少于 B1、D1 组，B1、D1 组间无明显差异。见图 6。
图 6.
Observation of alizarin red staining after the transfection of miR-21 inhibitor
miR-21 抑制剂转染后各组茜素红染色大体观察
a. A1 组；b. B1 组；c. C1 组；d. D1 组
a. Group A1; b. Group B1; c. Group C1; d. Group D1
2.5. 沉默 PTEN 对 MC3T3-E1 细胞成骨分化的影响
2.5.1. 转染效率检测
培养 48 h，Western blot 检测示 A2、C2、D2 组 PTEN 蛋白相对表达量分别为 0.50±0.04、0.48±0.06、0.15±0.03。D2 组 PTEN 蛋白相对表达量明显低于 A2、C2 组，比较差异有统计学意义（P<0.05）；A2 组及 C2 组间比较差异无统计学意义（P>0.05）。见图 7。
图 7.
The expression of PTEN protein after the transfection of siRNA-PTEN detected by Western blot
siRNA-PTEN 转染后 Western blot 检测 PTEN 蛋白表达1：A2组 2：C2 组 3：D2 组
1: Group A2 2: Group C2 3: Group D2
2.5.2. 实时荧光定量 PCR 检测
第 1 周，B2、C2、D2 组 Runx2、OPN mRNA 相对表达量均高于 A2 组，D2 组 OPN mRNA 相对表达量高于 B2、C2 组，D2 组 Col1a1 mRNA 相对表达量高于 A2、B2、C2 组，比较差异有统计学意义（P<0.05）；其余各组间比较，差异无统计学意义（P>0.05）。
第 2 周，B2、C2、D2 组 Runx2、OPN 及 Col1a1 mRNA 相对表达量均高于 A2 组，比较差异有统计学意义（P<0.05）；其余各组间比较差异无统计学意义（P>0.05）。见表 4。
表 4.
Comparison of expressions of osteogenesis related genes after the transfection of siRNA-PTEN between groups (n=3,
)
siRNA-PTEN 转染后各组成骨标志基因表达比较（n=3，
）
| 组别
Group |
Runx2 | OPN | Col1a1 | |||||
| 第 1 周
One week |
第 2 周
Two weeks |
第 1 周
One week |
第 2 周
Two weeks |
第 1 周
One week |
第 2 周
Two weeks |
|||
|
*与 A2 组比较 P<0.05，#与 B2 组比较 P<0.05，△与 C2 组比较 P<0.05
* Compared with group A2, P<0.05;#compared with group B2, P<0.05;△ compared with group C2, P<0.05 | ||||||||
| A2 | 1.00±0.09#△ | 1.00±0.06#△ | 1.00±0.14#△ | 1.00±0.09#△ | 1.00±0.18 | 1.00±0.14#△ | ||
| B2 | 1.41±0.14* | 1.52±0.10* | 7.93±0.36* | 3.76±0.27* | 0.96±0.07 | 1.52±0.16* | ||
| C2 | 1.46±0.09* | 1.53±0.14* | 7.61±0.45* | 3.83±0.21* | 0.95±0.14 | 1.39±0.12* | ||
| D2 | 1.44±0.03* | 1.55±0.07* | 11.66±0.39*#△ | 3.88±0.10* | 1.50±0.15*#△ | 1.46±0.25* | ||
| 统计值
Statistic |
F=16.871
P= 0.001 |
F=21.977
P= 0.000 |
F=470.716
P= 0.000 |
F=178.295
P= 0.000 |
F=10.145
P= 0.004 |
F=5.359
P=0.026 |
||
2.5.3. 茜素红染色
第 3 周茜素红染色 B2、C2、D2 组钙基质沉积多于 A2 组，D2 组钙基质沉积多于 B2、C2 组，B2、C2 组间无明显差异。见图 8。
图 8.
Observation of alizarin red staining after the transfection of siRNA-PTEN
siRNA-PTEN 转染后茜素红染色大体观察
a. A2 组；b. B2 组；c. C2 组；d. D2 组
a. Group A2; b. Group B2; c. Group C2; d. Group D2
3. 讨论
骨修复材料植入早期，局部组织缺血缺氧，再灌注后会产生大量活性氧（reactive oxygen species，ROS），使周围 MSCs 发生低氧应激、氧化应激。ROS 主要包括超氧阴离子、H2O2 及羟自由基，其中 H2O2 有更高的氧化活性及稳定性，被广泛应用于制作氧化应激模型[11-12]。ROS 浓度的提高对机体主要有两方面的影响：一方面是通过蛋白质、脂质及 DNA 过氧化导致细胞坏死；另一方面则是通过在半胱氨酸残基，可逆性氧化激活细胞的生理信号通路[13]。ROS 可调控相关基因的表达，对细胞的增殖、分化、生存及凋亡等生命过程有着重要作用。由于 miRNAs 调控着细胞大约 30% 基因的变化，因此 ROS 对细胞生命活动的影响，可能源于 ROS 对 microRNAs 的调控。研究表明，miR-21 与肿瘤细胞的低氧、氧化应激反应密切相关[6]，此外，Cheng 等[7]及 Lin 等[8]发现 H2O2 处理心肌细胞、血管平滑肌细胞 6 h 后，miR-21 表达上调并促进细胞成活。Lv 等[6]则发现 H2O2 处理 BMSCs 6 h 后，miR-21 表达下调，通过上调 miR-21 可抑制细胞凋亡。本研究通过不同浓度 H2O2 处理 MC3T3-E1 细胞 6 h，发现经浓度超过 160 μmol/L 的H2O2 处理后细胞 miR-21 表达下调，表明 H2O2 有下调 miR-21 表达的趋势，与 Lv 等[6]结果相似，而与 Cheng 等[7]及 Lin 等[8]结果不同，分析可能与细胞来源不同有关。同时，多项研究表明，miR-21 可促进 MSCs 成骨分化[9, 14]。因此，在骨修复材料植入早期，局部产生的 ROS 可能通过调控 miR-21，进而影响 MSCs 成骨分化进程。
正常情况下，机体可通过抗氧化系统及时清除产生的 ROS，若 ROS 的产生与抗氧化系统失衡则引发机体发生氧化应激[15]，而氧化应激反应与骨质疏松、骨关节炎等疾病密切相关[16]。研究发现，在氧化应激状态下，细胞成骨分化活动被抑制[17-18]。本研究通过 H2O2 模拟 MSCs 植入早期的氧化应激反应，按照 Lee 等[18]采用 MC3T3-E1 细胞建立氧化应激模型方法，通过不同浓度 H2O2 处理 MC3T3-E1 细胞 1 周，发现 160 μmol/L H2O2 浓度时细胞活力在 80% 以上，低于此浓度对细胞活力无明显影响；而浓度 320 μmol/L的 H2O2 培养后，细胞活力受到明显影响。为保证细胞活性，本研究选择 160 μmol/L H2O2 处理 MC3T3-E1 细胞，进一步探讨其对细胞成骨分化及分化过程中对 miR-21 表达的影响。
在细胞成骨诱导分化过程中，miR-21 随着细胞成骨分化过程表达逐渐上调，在第 2 周达到高峰，这表明 miR-21 参与细胞的成骨分化进程。在第 1、2 周 D 组 miR-21 表达较 C 组下调，表明 H2O2 可抑制 miR-21 在成骨分化中的表达，并且 B 组第 1、2 周时 miR-21 表达较 A 组下调，这与我们不同浓度 H2O2 处理 6 h 后观察结果相符。而在第 3 周时，A、B 组 miR-21 表达无显著差异，这可能是由于 H2O2 处理后，miR-21 在第 3 周恢复到了生理水平。与大部分研究结果相似[17-18]，我们发现 H2O2 抑制了 MC3T3-E1 细胞成骨标志基因表达，并且抑制其矿化，结合 H2O2 处理下 miR-21 表达的变化，提示 H2O2 抑制 MC3T3-E1 细胞成骨分化可能与 miR-21 表达下调有关。由于 miR-21 在成骨分化进程中表达逐渐上调，提示 miR-21 参与了细胞成骨分化过程。因此，我们选择在 H2O2 处理的同时下调 miR-21 表达，发现 miR-21 的下调抑制了 MC3T3-E1 细胞成骨分化。进一步说明 H2O2 抑制 MC3T3-E1 细胞成骨分化可能与 H2O2 抑制了 miR-21 表达有关。
PTEN 在细胞的生长、凋亡、黏附、迁移、分化进程中发挥重要作用，其主要通过抑制 PI3K 信号通路发挥作用[19]。在成骨分化过程中，抑制 PTEN 表达可激活 PI3K 信号通路，进而促进细胞成骨分化[10]。Burgers 等[20]发现通过敲除小鼠成骨细胞中 的 PTEN，可提高膜内成骨及软骨内成骨，促进骨折愈合；Guntur 等[21]发现敲除 PTEN 可激活 FGF 及 Hedgehog 信号，促进细胞成骨分化；以上研究表明敲除 PTEN 能促进细胞成骨分化。此外，H2O2 可激活 PTEN 抑制 PI3K/AKT 通路参与 BMSCs 的凋亡过程[6]；在视网膜色素上皮细胞中，氧化应激状态下可激活 PI3K/AKT 通路抑制细胞凋亡[22]。这些研究都表明 PTEN 及 PI3K 信号通路在氧化应激反应中都扮演了重要角色。在多个细胞系中 PTEN 为 miR-21 靶基因，miR-21 在翻译水平可靶向 PTEN 调控 PI3K 信号通路[23-24]。然而，在氧化应激状态下，miR-21 与 PTEN 是否参与了 MC3T3-E1 细胞成骨分化过程尚不清楚。本研究通过 H2O2 模拟的氧化应激反应，发现在成骨诱导第 2 周，C 组 PTEN 蛋白表达较 A 组及 D 组下调，与 miR-21 表达相反，提示 PTEN 表达与 miR-21、成骨分化进程及 H2O2 处理有关。下调 miR-21 可促进 PTEN 表达上调，因此在 MC3T3-E1 细胞中，我们分析 PTEN 可能为 miR-21 靶基因。当沉默 PTEN 表达时，Runx2 表达无明显差异，但在第 1 周 OPN 及 Col1a1 表达上调，并且在第 3 周促进细胞矿化。OPN 是细胞外基质蛋白，在成骨分化早期就表达升高，Col1a1 是细胞外基质蛋白黏附的支架，诱导钙、磷在细胞外基质中沉积，提示 H2O2 处理的同时沉默 PTEN 能促进 MC3T3-E1 细胞成骨分化。
FoxO（forkhead box O）转录因子是叉头框蛋白的一个亚类，可将外界刺激（激素变化、炎症、氧化应激等）转化为特定基因转录，参与机体病理生理活动的调控。氧化应激状态下，大量 ROS 可激活 FoxOs，从而诱导 DNA 修复相关基因及抗氧化酶基因转录，有助于损伤 DNA 的修复及细胞的应激反应[25]。研究表明，FoxOs 是氧化应激状态下成骨分化及骨稳态的重要调控者[26-27]。FoxO3a 可抑制 miR-21 转录[28]，可见氧化应激状态激活的 FoxO3a 可抑制 miR-21 表达，这与本研究 B 组及 D 组 miR-21 表达下调结果一致。但本次研究未探讨氧化应激下 FoxOs 表达及其与 miR-21、成骨分化的具体关系；同时，PI3K 信号通路是否参与氧化应激状态下成骨分化的调控，也是进一步研究的方向。
综上述，本研究结果提示 H2O2 抑制 MC3T3-E1 成骨分化可能与下调 miR-21 有关，并且 PTEN 参与其中的调控。FoxOs 及 PI3K 信号通路可能参与了氧化应激状态下的成骨分化调控，其与 miR-21 及 PTEN 之间的具体关系尚待深入研究，并且需进行动物实验进一步验证。
Funding Statement
国家自然科学基金资助项目（31430030）
National Natural Science Foundation of China (31430030)
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