携带肝细胞生长因子基因慢病毒转染人脂肪来源干细胞复合纤维蛋白胶支架构建可注射型组织工程脂肪的实验研究

Abstract

Objective

To discuss the possibility of constructing injectable tissue engineered adipose tissue, and to provide a new approach for repairing soft tissue defects.

Methods

Human adipose-derived stem cells (hADSCs) were extracted from the lipid part of human liposuction aspirate by enzymatic digestion and identified by morphological observation, flow cytometry, and adipogenic induction. The hADSCs underwent transfection by lentivirus vector expressing hepatocyte growth factor and green fluorescent protein (HGF-GFP-LVs) of different multiplicity of infection (MOI, 10, 30, 50, and 100), the transfection efficiency was calculated to determine the optimum MOI. The hADSCs transfected by HGF-GFP-LVs of optimal MOI and being adipogenic inducted were combined with injectable fibrin glue scaffold, and were injected subcutaneously into the right side of the low back of 10 T-cell deficiency BALB/c female nude mice (transfected group); non-HGF-GFP-LVs transfected hADSCs (being adipogenic inducted) combined with injectable fibrin glue scaffold were injected subcutaneously into the left side of the low back (untransfected group); and injectable fibrin glue scaffold were injected subcutaneously into the middle part of the neck (blank control group); 0.4 mL at each point. Twelve weeks later the mice were killed and the implants were taken out. Gross observation, wet weight measurement, HE staining, GFP fluorescence labeling, and immunofluorescence staining were performed to assess the in vivo adipogenic ability of the seed cells and the neovascularization of the grafts.

Results

The cultured cells were identified as hADSCs. Poor transfection efficiency was observed in MOI of 10 and 30, the transfection efficiency of MOI of 50 and 100 was more than 80%, so the optimum MOI was 50. Adipose tissue-like new-born tissues were found in the injection sites of the transfected and untransfected groups after 12 weeks of injection, and no new-born tissues was found in the blank control group. The wet-weight of new-born tissue in the transfected group [(32.30±4.06) mg] was significantly heavier than that of the untransfected group [(25.27±3.94) mg] (t=3.929, P=0.001). The mature adipose cells in the transfected group [(126.93±5.36) cells/field] were significantly more than that in the untransfected group [(71.36±4.52) cells/field] (t=30.700, P=0.000). Under fluorescence microscopy, some of the single cell adipocytes showed a network of green fluorescence, indicating the presence of GFP labeled exogenous hADSCs in the tissue. The vascular density of new-born tissue of the transfected group [(16.37±2.76)/field] was significantly higher than that of the untransfected group [(9.13±1.68)/field] (t=8.678, P=0.000).

Conclusion

The hADSCs extracted from the lipid part after liposuction can be used as seed cells. After HGF-GFP-LVs transfection and adipose induction, the hADSCs combined with injectable fibrin glue scaffold can construct mature adipose tissue in vivo, which may stimulate angiogenesis, and improve retention rate of new-born tissue.

临床上软组织缺损的修复，尤其是颜面部组织缺损的重塑是整形外科常见问题。目前，临床采用的透明质酸注射不能长久维持外形，假体移植存在填充后外观不自然、手感不柔和等缺点，自体脂肪移植存在因早期血管化不充分而保留率较低的缺陷^[1]。因此，以液态支架材料构建可注射型组织工程脂肪，具有重要的临床应用价值，可稳定存活、长期保留，达到结构和功能的双重修复作用，而且不需开放式外科手术，可能为软组织缺损修复提供优良的填充材料^[2]。我们的前期研究通过将人脂肪来源干细胞（human adipose-derived stem cells，hADSCs）与不同浓度纤维蛋白胶支架进行体外三维培养，发现 hADSCs 可在纤维蛋白胶支架内稳定增殖，提示纤维蛋白胶有良好的生物相容性^[3]。同时，还有相关研究表明纤维蛋白胶可通过促进移植区的血管新生，来提高脂肪移植的保留率^[4]。

肝细胞生长因子（hepatocyte growth factor，HGF）是目前已知的生物活性最广泛的非特异性生长因子之一，具有强大的促进血管生成作用。我们前期研究以腺病毒为载体将 HGF 基因转染至hADSCs，结果提示其在受染细胞内不发生整合，因此无致癌和致突变风险，而且 HGF 基因可在较长时期内过表达 HGF ，进而发挥生物学作用，加快移植脂肪的血管化进程，从而促进移植脂肪的存 活^[5]。HGF 的强大促血管形成等功能联合 hADSCs 的多重干细胞治疗作用，对组织移植早期血管新生有重要意义。因此，我们将携带 HGF 基因的 hADSCs 复合纤维蛋白胶支架注入动物体内，采用组织学检测等手段来判断移植物的存活、保留及血管化情况，旨在为软组织缺损修复提供一种新型的、可靠的组织工程修复方式。

1. 材料与方法

1.1. 实验动物及主要试剂、仪器

SPF 级 6 周龄单纯 T 细胞缺陷 BALB/c 雌性裸鼠 10 只，体质量<20 g，由南昌大学实验动物中心提供。

游离脂肪组织取自南昌大学第二附属医院整形美容科多名 20～45 岁健康女性腹部吸脂术后废弃的脂肪组织。受术者术前均知情同意，本研究获南昌大学医学院伦理委员会批准。

DMEM 培养基、FBS、0.25% 胰蛋白酶-0.02%EDTA（GIBCO 公司，美国）；Ⅰ型胶原酶、纤维蛋白原、凝血酶、地塞米松、胰岛素、3-异丁基-1-甲基黄嘌呤（3-isobutyl-1-methylxanthine，IBMX）、吲哚美辛、油红 O 染色剂（Sigma 公司，美国）；鼠抗人 CD34、CD45、CD49d、CD90、CD105、CD106 多克隆抗体（eBioscience 公司，美国）；慢病毒载体 HGF-绿色荧光蛋白（green fluorescent protein，GFP）-LVs（上海汉恒生物科技有限公司）。倒置相差显微镜、荧光倒置显微镜（Olympus 公司，日本）；流式细胞仪（BD 公司，美国）；CO₂ 培养箱、多功能酶标仪（Thermo 公司，美国）。

1.2. hADSCs 的提取、扩增及鉴定

1.2.1 hADSCs 的提取、扩增　取捐献的脂肪组织 10 mL 置于离心管中，与等体积 1.0 mg/mL Ⅰ型胶原酶溶液混匀后，置于 37℃ 恒温水浴中消化 30 min，期间震荡混匀 2～3 次。以离心半径 20 cm、1 200 r/min 离心 5 min，去上层油脂及水分，保留沉淀，用完全培养基（含 10%FBS 的 L-DMEM 培养基）重悬。200 μm 筛网过滤后，同上法离心，完全培养基重悬沉淀。用细胞计数板计数细胞悬液，取（1～2）×10⁴个细胞接种至 25 cm²培养瓶中，置于 37℃、5%CO₂ 孵箱中培养。48 h 后首次换液，之后 2～3 d 换液 1 次，待细胞融合达 80% 后传代。取第 3 代细胞行 HE 染色，倒置相差显微镜下观察细胞形态变化。

1.2.2 hADSCs 的鉴定　① 流式细胞术检测 hADSCs 表面抗原：取第 3 代 hADSCs，用 以 1∶1 比例混合的 0.25% 胰蛋白酶和 0.02% EDTA 消化后，以离心半径 20 cm、800 r/min 离心 5 min；弃上清，加少量 PBS 吹打均匀，制备密度为 1×10⁹个/L 的单细胞悬液。用 EP 管收集细胞悬液（100 μL/管），每管分别加入 5 μL 两种不同荧光素标记的流式抗体，用同型藻红蛋白标记的免疫球蛋白（PE-IgG）和异硫氰酸荧光标记的免疫球蛋白（FITC-IgG）作为对照，避光孵育 30 min；PBS 洗涤 2 次，去除多余抗体，同上法离心后弃上清，每管加入 500 μL PBS 重悬，上机行双荧光标记检测。

② hADSCs 成脂诱导鉴定：取 1×10⁵个第 3 代 hADSCs，接种于置有盖玻片的 6 孔培养板上，待细胞贴壁融合至 80%，换液去上清，加入成脂诱导培养基（含 10%FBS、1 μmol/L 地塞米松、10 μmol/L 胰岛素、0.5 mmol/L IBMX、200 μmol/L 吲哚美辛的 H-DMEM 培养基），每周换液 2～3 次。定期观察细胞形态变化，阴性对照用完全培养基培养。培养 14 d 后取细胞爬片，PBS 洗涤后 4% 多聚甲醛固定 5 min，PBS 洗涤后加入油红 O 染色 15 min，PBS 再次洗涤后置于倒置相差显微镜下，观察有无呈红染的脂滴。

1.3. 慢病毒搭载 HGF 转染 hADSCs

取 1×10⁵个第 3 代 hADSCs，接种于 6 孔培养板，加入完全培养基培养直至细胞融合达 40%～50%，分别加入感染复数（multiplicity of infection，MOI）为 10、30、50、100 的 HGF-GFP-LVs，同时加入 Ploybrene 稀释液，8 h 后更换完全培养基。转染 72 h 后，荧光显微镜下观察病毒转染情况，不同 MOI 组随机取 10 个高倍镜视野，计数绿色荧光标记的细胞和总细胞，以二者比值作为 HGF-GFP-LVs 转染效率。选择转染效率较高的对应 MOI 作为实验最适 MOI。转染后每 48 小时，采用 ELISA 法检测经最适 MOI HGF-GFP-LVs 转染后的 hADSCs 与未转染的 hADSCs，其培养基上清液中HGF 蛋白表达量。 hADSCs 转染后再次传代，荧光显微镜观察荧光是否衰减。

1.4. hADSCs 复合纤维蛋白胶支架移植

1.4.1 实验分组及方法　取经最适 MOI HGF-GFP-LVs 转染的第 3 代 hADSCs 以及未转染的第 3 代 hADSCs，同1.2.2中方法行成脂诱导 14 d 后，用 0.25% 胰蛋白酶-0.02%EDTA 消化，以离心半径 20 cm、800 r/min 离心 5 min；去上清，取离心管底部 hADSCs 用 500 U/mL 凝血酶溶液重悬，吹打后形成密度为 1×10⁷个/mL 的细胞悬液。然后将纤维蛋白原在 PBS 溶液中溶解，稀释为最适浓度 25 mg/mL^[3]。

取裸鼠 10 只，以1.5% 戊巴比妥腹腔注射麻醉（40 mg/kg），通过双联注射器分别抽取 0.2 mL 含转染 HGF-GFP-LVs 并成脂诱导 hADSCs 的凝血酶溶液和 0.2 mL 纤维蛋白原溶液，通过内径为 0.5 mm 的 7 号针头注入裸鼠背部右侧皮下（转染组）；通过双联注射器分别抽取0.2 mL 含单纯成脂诱导的 hADSCs 凝血酶溶液以及0.2 mL 纤维蛋白原溶液，同法注入裸鼠背部左侧皮下（未转染组）；通过双联注射器分别抽取 0.2 mL 空白凝血酶溶液以及 0.2 mL 纤维蛋白原溶液器，同法注入裸鼠颈后正中皮下（空白对照组）。

1.4.2 观测指标　① 一般情况：注射后观察实验动物存活、活动、皮肤有无排斥反应等情况。② 大体观察：移植后 12 周，腹腔注射过量戊巴比妥处死全部裸鼠，取出移植材料测定湿重。③ HE 染色观察：取转染组和未转染组新生组织，经 4% 多聚甲醛固定 24 h 后，脱水，石蜡包埋，切片，片厚 0.2 cm。两组各随机取 10 张切片，于200 倍镜下每张切片取 15 个视野，计数新生脂肪细胞，取均值。④ 荧光显微镜观察：取转染组切片，荧光显微镜下观察 GFP 荧光标记物在组织中的定位。⑤ 免疫荧光染色观察：转染组和未转染组各随机取10 张切片，于200 倍镜下每张切片取 15 个视野，计数血管断面，并计算血管密度。

1.5. 统计学方法

采用 SPSS11.0 统计软件进行分析。数据以均数±标准差表示，组间比较采用独立样本 t 检验；检验水准 α=0.05。

2. 结果

2.1. hADSCs 形态观察及鉴定

倒置相差显微镜下观察见，原代细胞培养 7 d 左右即融合至 80%，传代后生长迅速。HE 染色示，第 3 代 hADSCs 呈成纤维细胞样形态，长梭形，倒置相差显微镜下可见密集的贴壁细胞呈漩涡状分布。见图 1。

图 1.

Morphological observation of the 3rd generation hADSCs by HE staining (Inverted phase contrast microscope×200)

HE 染色观察第 3 代 hADSCs 形态（倒置相差显微 镜×200）

流式细胞术检测示，第 3 代 hADSCs 高表达 CD49d、CD90、CD105，不表达或极低表达 CD34、CD45、CD106。见图 2。

图 2.

Flow cytometry identification of the 3rd generation hADSCs

第 3 代 hADSCs 流式细胞术鉴定

a. CD34-CD105；b. CD45-CD106；c. CD90-CD49d

a. CD34-CD105; b. CD45-CD106; c. CD90-CD49d

成脂诱导培养 3 d，倒置相差显微镜下可见细胞中有透亮脂滴形成，之后脂滴逐渐增多变大；培养 14 d 后细胞形态饱满，细胞内脂滴形成较多，可见融合而成的大脂滴，经油红 O 染色呈红色。见图 3。

图 3.

Oil red O staining observation of the 3rd generation hADSCs after adipogenic induction for 14 days (Inverted phase contrast microscope×200)

第 3 代 hADSCs 成脂诱导 14 d 油红 O 染色观察（倒 置相差显微镜×200）

2.2. HGF-GFP-LVs 转染 hADSCs 效率检测

HGF-GFP-LVs 转染 hADSCs 后 72 h，荧光显微镜下均可观察到绿色荧光。MOI 为 10、30、50、100 时，HGF-GFP-LVs 转染效率分别为 41.8%±3.6%、64.5%±3.9%、81.9%±3.2%、82.3%±3.4%，MOI 为 50 和 100 时转染效率较高，确定本实验 HGF-GFP-LVs 转染 hADSCs 的最适 MOI 为 50。见图 4。HGF-GFP-LVs 以最适 MOI 转染 hADSCs 后，绿色荧光持续表达，且传代后无明显衰减。见图 5。ELISA 法检测示，未转染的hADSCs 其 HGF 蛋白表达量较平稳；hADSCs 经 HGF-GFP-LVs 转染后，其 HGF 蛋白表达量在前 6 d 呈上升趋势，之后趋于稳定。见图 6。

图 4.

Fluorescence microscope observation of hADSCs transfected by HGF-GFP-LVs of different MOI for 72 hours (×200)

各 MOI 值 HGF-GFP-LVs 转染 hADSCs 后 72 h 荧光显微镜观察（×200）

a. MOI 为 10；b. MOI 为 30；c. MOI 为 50；d. MOI 为 100

a. MOI of 10; b. MOI of 30; c. MOI of 50; d. MOI of 100

图 5.

hADSCs transfected by HGF-GFP-LVs with MOI of 50 showed no attenuation after passaged (Fluore- scence microscope×200)

MOI 为 50 的 HGF-GFP-LVs 转染 hADSCs 传代后荧 光表达无衰减（荧光显微镜×200）

图 6.

HGF protein expression of hADSCs detected by ELISA assay

ELISA 法检测细胞 HGF 蛋白表达量

2.3. 动物实验观察

2.3.1 一般情况　实验动物麻醉苏醒后，均能自如活动、正常饮食。注射局部未见皮肤红肿，无排斥反应发生。所有动物取材前均无死亡。

2.3.2 大体观察　移植后 12 周处死动物取出移植材料，转染组及未转染组均可见外观类似于脂肪组织的新生物，而空白对照组未见组织新生物。见图 7。转染组和未转染组新生物湿重分别为（32.30±4.06）mg 和（25.27±3.94）mg，两组比较差异有统计学意义（t=3.929，P=0.001）。

图 7.

General observation of new-born tissue in transfected and untransfected groups after 12 weeks of injection

移植后 12 周转染组及未转染组组织新生物大体观察

2.3.3 HE 染色观察　转染组新生物组织结构与正常脂肪组织相似，含少量纤维样结构；未转染组新生物脂肪样组织较少，纤维样结构较多。转染组新生脂肪细胞数为（126.93±5.36）个/视野，显著高于未转染组的（71.36±4.52）个/视野，两组比较差异有统计学意义（t=30.700，P=0.000）。见图 8。

图 8.

HE staining observation of new-born tissue in transfected and untransfected groups after 12 weeks of injection (Inverted phase contrast microscope×200)

移植后 12 周转染组及未转染组新生物 HE 染色观察（倒置相差显微镜×200）

a. 转染组；b. 未转染组

a. Transfected group; b. Untransfected group

2.3.4 荧光显微镜观察　荧光显微镜下可见转染组组织新生物部分单房脂肪细胞发出网状绿色荧光，说明组织内含有 GFP 标记的外源性 hADSCs。见图 9。

图 9.

Observation of the mature adipose cells in transfected group carried green fluorescence by fluorescence microscope after 12 weeks of injection (×200)

移植 12 周转染组荧光显微镜观察新生物脂肪细胞 携带绿色荧光情况（×200）

2.3.5 免疫荧光染色观察　荧光显微镜下观察，转染组新生血管显著多于未转染组。转染组血管密度为（16.37±2.76）个/视野，显著高于未转染组的（9.13±1.68）个/视野，两组比较差异有统计学意义（t=8.678，P=0.000）。见图 10。

图 10.

Immunofluorescence staining observation of transfected and untransfected groups after 12 weeks of injection (Fluorescence microscope×200)

移植 12 周转染组与未转染组免疫荧光染色观察（荧光显微镜×200）

a. 转染组；b. 未转染组

a. Transfected group; b. Untransfected group

3. 讨论

相关研究显示^[6]，HGF 可与多能干细胞细胞膜上的特异性受体 c-Met 结合，通过 HGF/c-Met 通路产生生物学效应，引起一系列信号转导的酶促级联放大效应，由此激活下游生长因子受体结合蛋白 2 和接头蛋白 1，以及该信号通路与其他信号通路间交叉对话而发挥其生物活性作用。HGF 不仅具有强大的促血管新生作用，还具有调节胶原合成和炎性反应、诱导细胞有丝分裂、抑制细胞凋亡等生物学效应，已广泛应用于病理型瘢痕、心肌缺血等的治疗研究^[7]。还有研究表明^[8]，HGF 可提供一个关键的趋化信号诱导干细胞迁移至 HGF 浓度较高的区域，在组织工程中可趋化宿主循环血中的干细胞迁移至移植区。此外，有研究发现 HGF 可诱导干细胞分化为血管内皮细胞，直接参与新生血管的生成^[9]。本实验采用慢病毒搭载 HGF 基因转染 hADSCs，经 ELISA 检测培养基上清液中的 HGF 蛋白表达量在转染后前 6 d 呈递增趋势，之后趋于稳定，且均高于未转染 hADSCs。转染 HGF 的种子细胞可提高移植区 HGF 的浓度，有利于移植早期快速建立血运，提高移植物的保留率^[10-12]。

纤维蛋白胶是从血浆中提取的纤维蛋白原和凝血酶混合后聚合而成的纤维蛋白凝胶^[13-14]。本课题组前期研究发现^[3]，纤维蛋白胶的浓度可直接影响种子细胞的活性，在体外三维培养模式下，高浓度的纤维蛋白胶（>50 mg/mL）对 hADSCs 的生长具有明显抑制作用，而纤维蛋白原浓度低于 25 mg/mL 时hADSCs 存活良好，因此以 25 mg/mL 作为本实验最适纤维蛋白原浓度。本实验分别将转染及未转染 HGF 的 hADSCs 行成脂诱导 14 d 后悬于凝血酶溶液中，与最适浓度的纤维蛋白原溶液混合，通过双联注射器注入裸鼠背部皮下形成凝胶。实验发现，转染组和未转染组移植 12 周后均可见外观类似脂肪组织的新生物。经组织学检测发现，转染组可见大量单房脂肪细胞和少量纤维结缔组织，未转染组可见少量单房脂肪细胞和大量纤维结缔组织；转染组的新生物湿重和血管密度均高于未转染组。而空白对照组在移植 12 周取材时未见新生组织，说明纤维蛋白胶支架在 3 个月内已被宿主吸收。在转染组移植物中可见发出绿色荧光的脂肪细胞，说明部分 GFP 标记的 hADSCs 在组织中保留 12 周并分化为脂肪细胞。本研究结果表明，慢病毒搭载 HGF 基因转染 hADSCs 复合纤维蛋白胶支架构建可注射型组织工程脂肪是可行的，且携带 HGF 基因的种子细胞具有更强的生物活性，通过促进移植物的血管新生，从而提高移植物的保留率。

本研究中转染组还有部分脂肪细胞未见绿色荧光，这部分脂肪细胞可能是由宿主干细胞分化而来。根据国内外研究提示^[15-18]，这部分宿主干细胞的来源可能为 BMSCs 通过循环血来到移植区，也可能是移植区周边的干细胞直接迁移并分化为脂肪细胞。由此可见，本研究中获取的脂肪组织新生物可能由外源性种子细胞和宿主干细胞共同参与形成。

综上述，慢病毒携带 HGF基因转染 hADSCs 复合纤维蛋白胶支架构建可注射型组织工程脂肪具有以下优点：① 导入 HGF 基因的 hADSCs 作为种子细胞具有更强的生物活性，可通过释放 HGF 促进移植后的血管新生，从而提高移植物最终的保留率；② 纤维蛋白胶作为支架材料，具有良好的生物相容性，可促进种子细胞增殖分化，在移植后 12 周内完全降解；③ 可注射型组织工程脂肪植入体内不遗留瘢痕，可用于多种软组织缺损修复及美容填充，具有广阔的临床应用前景。但本研究观察到的新生物体积较小，且存在一定纤维化现象，尚不能满足临床要求。有研究指出^[19-21]，通过人工调整细胞支架材料的刚度，可诱导ADSCs的成脂分化，增加移植物保留率。如何降低移植后的纤维化，提高种子细胞的增殖、分化能力，则是本课题组后续研究方向。

Funding Statement

江西省自然科学基金资助项目（20151BAB205034）；江西省科技支撑计划资助项目（2010BSA15100）；南昌大学研究生创新专项基金（cx2016333）

Natural Science Foundation of Jiangxi Province (20151BAB205034); Jiangxi Science and Technology Support Plan (2010BSA15100); Innovative Funds for Graduate Students of Nanchang University (cx2016333)