小分子罗丹明B在软骨不同层区内的运转研究

Abstract

软骨内细胞正常代谢所需的小分子营养物质和细胞生长因子等主要通过分子自由扩散进入软骨，但目前软骨内具体传质规律尚有待研究。该研究以小分子罗丹明B为示踪剂，分别建立表面、侧面和复合路径下的软骨传质模型，通过激光共聚焦显微镜对不同传质时间下软骨进行切片观察，分析研究小分子在软骨不同层区内的运转规律。结果表明：在表面路径下，罗丹明B在2 h内可扩散至软骨全层；随着传质时间增加，软骨全层荧光强度增强；相比于2 h，传质24 h后软骨浅表层、中层和深层的平均荧光强度分别增加了1.83倍、1.95倍和3.64倍。在侧面路径下，罗丹明B沿软骨宽度方向进行传质，分子传输距离随着传质时间的增加而增长，在传质24 h后可转运至2 mm处。在复合路径下，无论沿着软骨厚度方向还是宽度方向，其传质效果都优于表面路径和侧面路径，尤其是可以改善软骨深层的传质效果。本研究可为软骨损伤的治疗和修复提供参考。

引言

营养物质和代谢产物的运转、传质是生物体新陈代谢的基本条件。对于无血管、无神经、无淋巴等组织的膝关节软骨而言，运转、传质过程不仅能维持营养物质的供给与废物的代谢，而且能提供对其新陈代谢有调节作用的酶类、抑制因子、细胞活性素和生长因子等具有生物活性的分子。膝关节中正常软骨组织营养物质的代谢主要来自软骨与关节囊中滑液的传输，小部分来自软骨下骨^[1]。当软骨缺损后，人们尝试通过植入支架修复体对软骨进行修复，但由于支架修复体与软骨间存在连接界面会影响传质的进行，尤其当缺损面积较大时，缺损中心区域很可能成为传质盲区，这将导致再生软骨为纤维软骨甚至中心区域无再生软骨^[2-3]，所以研究软骨内的分子转运、传质规律对软骨的治疗和缺损修复有重要的意义^[4]。

目前国内外学者对于机械载荷^[5-11]、溶质浓度^[12-13]、分子电荷^[14-16]和分子量大小^[17-22]对软骨内分子转运的影响进行了一些研究。在机械载荷方面，Evans等^[5]研究了动态载荷的加载频率对软骨中分子转运的影响，研究表明，当加载频率为0.1 Hz、应变幅值为10%~20%时软骨内的分子转运得到明显促进；Graham等^[6-7]通过研究滑动载荷对软骨中电中性分子运输的影响，发现滑动载荷可以有效促进软骨内分子的运输距离；Culliton等^[8]通过对比静态、单轴循环加载和滑动加载三种条件下软骨内分子转运情况，发现相较于静态和单轴循环加载，滑动加载对软骨中的分子转运促进效果更加明显。在溶质浓度对软骨内分子运输影响的研究中，Pouran等^[12]使用计算机断层扫描技术探究了软骨外溶液溶质浓度和电荷电性对分子运输的影响，结果发现溶液浓度对中性分子在软骨层中的扩散影响较小。另外，Didomenico等^[14]和Kokkonen等^[15]对比了带有不同电荷的溶质分子在软骨中的转运情况，发现分子所带电荷种类会对分子在软骨层中的转运产生影响，带负电荷的分子相较于中性分子扩散速度较慢。Didomenico等^[17]研究了机械载荷对软骨内不同抗体分子转运的影响，结果表明，分子大小会对分子在软骨内的扩散速度和距离产生影响。这些研究主要探讨表面路径下软骨内的分子运转情况，同时实验过程中伴随着对软骨表层或深层进行去除的实验操作^[5,9,14]，这会使得获得的软骨内分子转运规律与结构完整的软骨内分子转运规律出现较大偏差^[23-24]。

正常状态下，膝关节的软骨表面浸润在关节腔的滑液中，软骨的物质运输主要是通过软骨表面的分子扩散完成。关节软骨是一种独特而复杂的结缔组织，不同层区的软骨结构构成和组成成分有着明显的不同^[25-26]。当营养物质和活性分子进入软骨时必须穿过致密的软骨基质，这样的话，各向异性的软骨基质可能会影响这些溶质分子在软骨内的运转，出现不同的传质路径。尤其是当人体运动时，膝关节软骨层会受到挤压，进而导致进入软骨层中的溶质分子发生侧向扩散，而现有研究也表明，力学加载对软骨中的溶质分子运输有促进作用，但其具体促进路径尚不明确。另外，当膝关节软骨发生退变或者出现炎症时，需要定向运输药物或活性分子进行治疗，但这些药物或活性分子从关节腔进入软骨内的运转路径也未知。因此，需要构建不同的转运路径，分别探究这些路径条件下软骨不同层区内的分子运转规律。

本文以小分子罗丹明B作为示踪剂，以完整膝关节软骨为对象，构建不同运转路径，探究了不同运转时间和运转路径对软骨不同层区内分子转运规律的影响，研究成果对软骨的炎症治疗、缺损修复具有重要意义。

1. 材料与方法

1.1. 实验材料

实验材料选用18个月成年猪的膝关节股骨处的关节软骨。新鲜的猪股骨从成年猪体内取出后，使用手术刀将覆盖在股骨表面的肌肉组织去除，去除过程中保证关节软骨表面不受损伤；然后，将关节软骨及软骨下骨完整取下，放入磷酸盐缓冲液中保存备用。

1.2. 实验方法和内容

根据实验需要，将软骨分为表面路径分子转运组、侧面路径分子转运组和复合路径分子转运组（见图1）。表面路径组仅在软骨表面发生分子扩散，侧面路径组仅在软骨层一对侧面发生分子转运，复合路径组为软骨的表面和软骨层的一对侧面同时发生分子转运，为保证在进行特定路径的分子转运实验时其他路径不发生分子扩散行为，实验中使用改性丙烯酸酯对软骨不发生转运的端面进行密封处理。

图 1.

Schematic diagram of molecular transport pathways

分子转运路径示意图

蓝色箭头代表溶质分子运转方向；蓝色表面代表传质液与软骨的接触面。a. 表面路径；b. 侧面路径；c. 复合路径

the blue arrow represents the direction of molecular mass transfer; the blue surface represents the contact surface between the mass transfer fluid and the cartilage. a. surface pathway; b. lateral pathway; c. composite pathway

图2显示了软骨内分子运转模型的构建。首先，将猪股骨的髁骨部位分别切制成10 mm×6 mm×8 mm骨软骨矩形块，并放入磷酸盐缓冲液中静置平衡2 h。然后，根据传质路径的不同，使用改性丙烯酸酯对软骨不同的端面进行密封，构建三种不同的传质路径。最后，将进行密封处理后的软骨放入配制好的浓度为3.13 nmol/mL的罗丹明B（荧光示踪剂分子量479 Da，索莱宝，中国）溶液中，在三种传质路径下，分别进行时间为2、12、24 h的分子静态传质实验。在分子转运完成后，将骨软骨试样取出，使用徕卡切片机［徕卡显微系统（上海）有限公司，Leica RM2255，中国］进行切片。首先，沿骨软骨的z方向将骨软骨的窄侧边缘去除3 mm，如图3a所示；然后，调整切片机的切片厚度，将软骨层切成55 µm厚的软骨切片；完成切片后，使用激光共聚焦显微镜（Nikon A1，Nikon，日本）在激发波长543 nm条件下进行荧光激发观察，并拍照记录软骨中荧光分布情况。

图 2.

Construction of cartilage molecular transport model

软骨分子转运模型构建

图 3.

Definition of cartilage orientation and measurement of mean fluorescence intensity in cartilage

对软骨方向的定义和软骨中平均荧光强度的测量

a. 骨软骨三维模型及x、y、z方向的定义；b. 显微镜明场下软骨切片观察；c. 软骨厚度方向平均荧光强度测量；d. 软骨宽度方向平均荧光强度测量

a. three-dimensional 3D model of bone and cartilage, and definition of x, y and z directions; b. microscopic observation of cartilage sections under bright field; c. average fluorescence intensity measurement in cartilage thickness direction; d. average fluorescence intensity measurement in cartilage width direction

1.3. 实验数据处理及分析

对骨软骨矩形块的3个方向分别进行定义，如图3a所示，将自软骨表层到软骨深层的方向定义为厚度方向，用x表示；矩形软骨的窄侧边为宽度方向，用y表示；矩形软骨的长侧边为长度方向，用z表示。软骨切片中厚度方向和宽度方向如图3b所示。

荧光强度与示踪剂的浓度线性相关，荧光强度的大小反映了该区域示踪剂浓度的高低。因此，本文基于激光共聚焦显微镜拍摄的软骨荧光图片，使用Image J软件对软骨层内的平均荧光强度进行测量，进而分析、探究软骨内的传质效果。测量时，厚度方向上选择距离软骨侧面0.5 mm处，对自软骨表层至深层的不同位置的平均荧光强度进行测量（见图3c）。软骨的全层厚度使用l表示，不同位置的点表示为x。同时，为进一步比较软骨不同层区的分子运转结果，在软骨表层、中层和深层^[25]各选取一个点（即0.15l、0.5l、0.85l），测量这三个位置点的平均荧光强度。宽度方向上，以距离软骨表面0.3l的软骨中间层的平均荧光强度为考察对象，测量从软骨侧面至距离侧面2 mm位置处的平均荧光强度（见图3d）。将测量得到的平均荧光强度使用Origin 2017进行处理，分别获得在不同路径和不同时间条件下，软骨层中厚度方向和宽度方向上平均荧光强度的分布情况。并且，使用SPSS软件对不同条件下的平均荧光强度进行统计学分析，检验水准为0.05。

2. 结果与讨论

2.1. 表面路径分子转运结果

在表面路径条件下，软骨内的溶质分子主要是沿其厚度方向进行扩散。当通过表面路径进行2 h的传质后，软骨表层和中层的荧光强度较大，且两层区的荧光强度接近，软骨深层的荧光强度较小，其平均值为8.60 AU，仅为表层荧光强度的47.71%（见图4a）。随着罗丹明B分子在软骨中转运时间的增加，软骨中各个位置的平均荧光强度也在增加。在软骨厚度方向上，相较于传质2 h，传质12 h后软骨表层平均荧光强度增加了0.85倍，软骨中层荧光强度增加1.44倍，软骨深层荧光强度增加3.43倍。传质24 h后，软骨表层、中层和深层的荧光强度比2 h时分别增加了1.83倍、1.95倍、3.64倍(见图4c)。进一步分析静态传质12 h和24 h不同层区的传质情况，发现在软骨厚度方向上，这两种传质时间都是软骨中层的荧光强度高于软骨表层和深层的荧光强度。如静态传质12 h时，软骨中层的荧光强度比表层高40.45%，比深层高19.18%（见图4c）。静态传质24 h时，中层荧光强度分别比表层和深层高11.15%和37.07%（见图4c）。这一现象与Culliton等^[8]研究结果一致。以上变化造成的差异均有统计学意义（P < 0.05）。在宽度方向上，同一时间条件下荧光强度没有随着距离发生明显变化，但随着传质时间的增加，宽度方向上的平均荧光强度均出现增强（见图4b）。

图 4.

Mean fluorescence intensity of intrachondral mass transfer under surface pathway conditions

表面路径条件下软骨内传质的平均荧光强度

a. 软骨厚度方向的平均荧光强度；b. 软骨宽度方向的平均荧光强度；c. 不同时间软骨表、中、深层的平均荧光强度

a. average fluorescence intensity in cartilage thickness direction; b. average fluorescence intensity in cartilage width direction; c. mean fluorescence intensity of cartilage surface, middle and deep layers at different times

2.2. 侧面路径分子转运结果

在侧面路径条件下，软骨内的溶质分子主要是沿其宽度方向进行扩散。在软骨宽度方向上，随着分子转运时间的增加，小分子罗丹明B的转运距离也在增加。当传质24 h时，罗丹明B可以转运至距离软骨侧面2 mm处（见图5b）；同时，随着分子转运时间的增加，平均荧光强度也随之增强。相较于传质2 h，传质12 h时在0.5 mm处荧光强度增加1.60倍，在1 mm处荧光强度增加4.55倍；传质24 h后，在0.5 mm处荧光强度增加3.44倍，在1 mm处荧光强度增加14.65倍（见图5b），差异均有统计学意义（P < 0.05）。在软骨厚度方向上，在同一时刻下，软骨各层区间的平均荧光强度没有显著差异（见图5a）；但随着传质时间的增加，软骨各层区的平均荧光强度也随之增加（见图5c），软骨厚度方向的平均荧光强度随时间变化的差异均有统计学意义（P < 0.05）。

图 5.

Mean fluorescence intensity of intrachondral mass transfer under lateral pathway conditions

侧面路径条件下软骨内传质的平均荧光强度

a. 软骨厚度方向的平均荧光强度；b. 软骨宽度方向的平均荧光强度；c. 不同时间软骨表、中、深层的平均荧光强度

a. average fluorescence intensity in cartilage thickness direction; b. average fluorescence intensity in cartilage width direction; c. mean fluorescence intensity of cartilage surface, middle and deep layers at different times

2.3. 复合路径分子转运结果

在复合路径条件下，软骨内的分子运转是沿其厚度方向和宽度方向同时进行的。在软骨厚度方向上，随着分子转运时间的增加，软骨中平均荧光强度随之增强（见图6a）。相较于传质2 h，传质12 h的软骨表层荧光强度增加了0.98倍，中层增加了1.38倍，深层增加了2.81倍；传质24 h的软骨表层、中层和深层的平均荧光强度分别增加1.89倍、2.50倍、5.49倍（见图6c），上述差异均有统计学意义（P < 0.05）。在宽度方向上，在距离软骨侧面0.25 mm处荧光强度有增强趋势；但随着距离的增加，荧光强度出现降低（见图6b）。

图 6.

Mean fluorescence intensity of intrachondral mass transfer under composite pathway conditions

复合路径条件下软骨内传质的平均荧光强度

a. 软骨厚度方向的平均荧光强度；b. 软骨宽度方向的平均荧光强度；c. 不同时间下软骨表、中、深层的平均荧光强度

a. average fluorescence intensity in cartilage thickness direction; b. average fluorescence intensity in cartilage width direction; c. mean fluorescence intensity of cartilage surface, middle and deep layers at different times

同时比较了分子运转2 h时三种路径条件下沿软骨厚度方向和宽度方向上的荧光强度，结果如图7所示。在表面转运路径条件下，软骨表层、中层和深层的平均荧光强度分别较侧面路径下对应层区的荧光强度增加了2.61倍、1.70倍、0.21倍（差异无统计学意义）；复合路径条件下软骨表层、中层和深层的平均荧光强度分别比侧面路径条件下对应层区的荧光强度增加了4.27倍、2.67倍、0.94倍（见图7c）。在宽度方向0.5 mm位置处，表面路径比侧面路径荧光强度增加2.58倍，复合路径比侧面路径增加3.65倍；在宽度方向1 mm位置处，表面路径比侧面路径荧光强度高14.52倍，复合路径比侧面路径高16.80倍（见图7b），以上结果除表面路径与侧面路径的深层平均荧光强度外，其他组别之间差异均有统计学意义（P < 0.05）。

图 7.

Comparison of the average fluorescence intensity within the cartilage at 2 h of mass transfer under three pathways

三种路径下传质2 h软骨内平均荧光强度的比较

a. 软骨厚度方向的平均荧光强度；b. 软骨宽度方向的平均荧光强度；c. 软骨表、中、深层的平均荧光强度

a. average fluorescence intensity in cartilage thickness direction; b. average fluorescence intensity in cartilage width direction; c. average fluorescence intensity of cartilage surface, middle and deep layers

3. 讨论

本文采用将软骨层的不同转运路径分别进行阻断的方法，研究小分子罗丹明B在软骨中的运转规律。以成年猪膝关节股骨处的软骨为对象，构建表面路径、侧面路径和复合路径三种条件下的分子转运模型，探讨了不同运转路径下小分子在软骨不同层区内的运转规律。

软骨的不同层区其结构构成和成分组成有所区别^[23]，因此软骨在不同路径中的分子转运行为可能有所不同。软骨表面路径的分子转运结果表明，小分子可以在2 h内扩散至软骨全层，如果软骨表面转运路径被阻断，则可能会导致软骨在极短的时间内出现营养匮乏甚至造成损伤，这与对关节滑液进行营养阻断会导致软骨出现损伤^[27]结果一致；同时有研究表明^[26，28-29]，软骨中的水、糖胺聚糖等成分会对关节软骨中的物质扩散产生影响，进而导致软骨中分子扩散系数发生变化，这可能是在表面路径传质条件下不同层区平均荧光强度出现差异的原因之一。在表面路径传质24 h的总时长中，相较于传质前12个小时，后12个小时中软骨层的平均荧光强度增加较慢，这可能是软骨层中的分子转运已经接近静态平衡，这与Culliton等^[8]的研究结果一致。

软骨层中的分子扩散不仅发生在厚度方向上，还发生在宽度方向上。Evans等^[5]和Didomenico等^[17]探究了抗体和葡萄糖类似物在软骨宽度方向上的分子扩散行为。在侧面路径的分子转运中，分子沿软骨宽度方向进行自由扩散，在厚度方向上没有发生分子自由扩散。侧面路径的分子转运趋势与表面路径的分子转运不同，在宽度方向上传质时间影响传质距离，传质时间增加使得分子转运的距离增加；同时随着距离的增加，其平均荧光强度逐渐降低，这与Didomenico等^[9]的研究结果一致。在侧面路径传质条件下，分子沿宽度方向进行扩散时，软骨表、中、深层的荧光强度没有明显差距。研究结果表明，虽然在软骨进行表面路径的分子运输时，各层结构和成分会对软骨内分子的运转产生影响，但是在侧面进行分子运转时，不同软骨层结构和成分对分子运转的影响并不显著，这进一步说明分子在软骨中的自由运转具有各向异性，本研究结果与Leddy等^[30]一致。

当进行复合路径分子转运时，在软骨厚度方向上的结果显示，运转24 h时软骨深层相较于软骨中层的平均荧光强度减弱的现象有所改善，虽然效果还不够明显，但这表明可以尝试通过软骨侧面进行分子转运，提升对软骨深层区域营养和药物的运输，该结果对于治疗和修复软骨缺损具有重要意义。将传质2 h不同路径下的分子转运结果进行比较，发现在厚度方向和宽度方向上复合路径的分子转运结果均优于表面路径和侧面路径。因此，在对软骨的治疗和修复过程中，进行关节腔注射的同时，也应考虑分子在软骨层中的横向运输。

以上研究结果表明，只进行表面路径或侧面路径的分子转运时，软骨中心的深层区域对分子的运输阻力相对较大，可能使得该区域获得的营养物质较少，甚至一些用于治疗软骨损伤的药物因子根本无法到达该区域；而复合路径条件下，软骨层可以更好地进行分子运输，这可能是滑动加载条件下的分子运输优于轴向加载的原因之一^[8]。因此，在对软骨进行治疗和修复时，除了考虑通过关节软骨表面进行分子扩散外，也要对分子在软骨中的横向运输予以关注。

4. 结论

（1）在表面路径传质中，软骨厚度方向上小分子罗丹明B可在2 h扩散至软骨全层；随着扩散时间的增加，软骨各层的平均荧光强度均增强，并且在12 h和24 h时罗丹明B在软骨中层的平均荧光强度显著增强。

（2）在侧面路径传质中，随着传质时间的增加，罗丹明B的运转距离增加；当传质24 h后，罗丹明B分子可转运至距离软骨侧面2 mm处；但随着转运距离的增加，软骨层中的平均荧光强度逐渐降低。

（3）在同一时间条件下，复合路径在厚度方向和宽度方向上的传质效果均优于表面路径和侧面路径，即复合路径为最优的传质路径。

重要声明

利益冲突声明：本文全体作者均声明不存在利益冲突。

作者贡献声明：高丽兰、全洲、谭沿松在实验设计、数据分析和论文写作中有重要贡献；数据收集主要由全洲完成；张春秋、高丽兰、谭沿松、李瑞欣、史艳萍在数据分析和论文的修改中有重要贡献。

Funding Statement

国家自然科学基金项目（32271371，12072235，11972198）；天津市自然科学多元投入基金项目（21JCYBJC00940，21JCZDJC00920）