树鼩感染相关细胞因子荧光定量 PCR 检测方法的建立

Abstract

Tree shrew is a novel and high-quality experimental animal model. In this study, the real-time polymerase chain reaction methods were established to detect infection-related cytokines interleukin-6 (IL-6), IL-8, IL-10, IL-17A, interferon-γ (IFN-γ) and housekeeping gene glyceraldehyde-phosphate dehydrogenase (GAPDH) of tree shrew. The results indicated that the establised methods had good specificity. The high point of the linear range of these reagents reached 1 × 10¹⁰ copies, and the low points ranged from 10 copies (IL-6, IL-17A), 100 copies (IL-10, GAPDH) to 1 000 copies (IL-8, IFN-γ). In this interval, the linear correlation coefficient R² of each reagent was greater than 0.99. The lowest detectable values of IL-6, IL-8, IL-10, IL-17A, IFN-γ and GAPDH were 8, 8, 4, 8, 128 and 4 copies, respectively. The results showed that the established detection methods had good specificity, sensitivity and wide linear range. The methods were suitable for detection of multiple concentration range samples, and could be used for the subsequent studies of tree shrew cytokines.

引言

树鼩（Tupaia belangeri，tree shrew）是一种形似松鼠的小型哺乳动物，在分类学上属于哺乳纲、有胎盘类，是一个独立的目，称为攀鼩目（Scandentia）。其主要分布在热带和亚热带，如我国云南、广西、广东和海南等地，以及东南亚的印度恒河北部、缅甸、越南、泰国、马来西亚、印尼和菲律宾等地。树鼩具有体型小、繁殖快、价格较为低廉以及易驯养和饲育的特点，新陈代谢比犬、鼠等动物更接近于人，解剖结构也更近似于人，许多分子与细胞结构与人类近似^[1]，因而是一种重要的新型实验动物。树鼩在医学生物学上的用途很多，受到许多学者的重视。目前利用树鼩开展的研究已经涉及到形态解剖学、生态学、行为学、人类学、生物化学、遗传学、心理学、神经生物学、繁殖生物学、胚胎学、寄生虫学、病毒学、免疫学、病理学以及运动生理、急慢性压力的影响和应激等社会生物学的研究^[2-7]。

树鼩作为一种新的优质动物模型，其研究还处于早期阶段。目前其重要的配套资源如细胞因子等的抗体的商品化仍未做到如小鼠等动物那样全面，而细胞因子水平是研究机体免疫活动的重要指标，如与感染密切相关的白介素（interleukin，IL）6（IL-6）、IL-8、IL-10、IL-17A、γ-干扰素（interferon-γ，IFN-γ）等^[8-9]。虽然目前树鼩还未有成熟的商品化的细胞因子抗体，无法进行基于免疫学技术的细胞因子水平检测，但得益于树鼩全基因组数据的获得^[10]，可以通过检测相关 mRNA 的方法进行细胞因子检测。

本研究基于 Taqman 探针法荧光定量聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，PCR）技术，通过对常见的感染相关细胞因子 IL-6、IL-8、IL-10、IL-17A、IFN-γ 进行序列分析，同时设计树鼩管家基因磷酸甘油醛脱氢酶（glyceraldehyde-phosphate dehydrogenase，GAPDH）mRNA 作为内参，建立高特异性、高灵敏度、快速、操作简单方便的树鼩常见感染相关细胞因子的检测及定量试剂，用于体内细胞因子水平的研究分析。

1. 材料与方法

1.1. 材料

树鼩购自昆明医科大学实验动物中心（树鼩生产许可证号：SCXK（滇）K2013-0002）；人喉癌上皮细胞 Hep-2、犬肾细胞 MDCK、E.coli TOP10、E.coli DH5а均由呼吸疾病国家重点实验室呼吸疾病生物资源库保存。本研究通过广东省实验动物监测所 IACUC 审核（编号：I-IACUC2015002）。

1.2. 试剂与仪器

M-MLV 逆转录酶、Taq DNA 聚合酶与 dNTPs（美国 Promega 公司），优化的 5 × 一步法 RT-PCR 缓冲液 5 × reaction buffer 各成分配制含量为 250 mmol/L Tris-Cl［pH 8.9］、375 mmol/L KCl、20 mmol/L MgCl₂ 和 50% 甘油，Trizol（美国 Invitrogen 公司），小鼠淋巴细胞分离液（天津灏洋生物制品科技有限公司），E.coli TOP10 感受态细胞、TIANprep DNA gel extraction kit 及 TIANprep Plasmid extraction kit（天根生物公司），pMD-18T（宝生物（大连）工程有限公司），ABI 7500 荧光定量 PCR 仪（美国 ABI 公司），NanoDrop ONE 分光光度计（美国 Thermo Scientific 公司）。

1.3. 树鼩 IL-6、IL-8、IL-10、IL-17A、IFN-γ 及内参树鼩 GAPDH 跨内含子引物探针设计

本方法采用 Taqman 探针技术，通过 Genebank 中树鼩基因组及其 mRNA 的信息，查找的 IL-6（NW_006207386.1、KU519627.1、XM_006169841.2）、IL-8（LC218169.1、KJ126716.1）、IL-10（XM_006159278.1、NW_006160147.1、KC905630.1）、IL-17A（NW_006208319.1、XM_006170444.1）、IFN-γ（XM_006147283.1、NW_006159683.1）及树鼩内参 GAPDH mRNA（XM_006170849.1）的序列资料，并对比分析树鼩基因组序列信息，对各目标分子的跨内含子保守区进行引物探针设计，详细序列见表 1 所示。其中引物由华大基因公司合成，探针由宝生物工程（大连）公司合成。

表 1. Primers and probes of infection-related cytokines and GAPDH of tree shrew .

树鼩感染相关细胞因子引物及 GAPDH 探针序列

检测目标	引物探针	序列
IL-6	T-IL6F	5′-TGCTGAAGCAAAAGGAAACGT-3′
	T-IL6R	5′-CCATCAAGCTGGCATTTGAA-3′
	T-IL6Probe	5′-FAM-CCAAGTATAGTTCCCACCCCTGACCCA-BHQ1-3′
IL-8	T-IL-8F	5′-GACTTCCAAGCTGGCTATTGCT-3′
	T-IL-8R	5′-TTCTTGTCAAAACTGCAGCTTCA-3′
	T-IL-8Probe	5′-FAM-TTGGCAGCCTTAATGTTCTCTGCAGCTC-BHQ1-3′
IL-10	T-IL-10F	5′-GGGAGGGTGAAGACTTTCTTTCAA-3′
	T-IL-10R	5′-CTTCAGCAGAGACTCACTCAGCAA-3′
	T-IL-10Probe	5′-FAM-CCAGTGATCAGCTGGACA-BHQ1-3′
IL-17A	T-IL-17AF	5′-CAAAAGAGCCTCAGATTACTACAAACG-3′
	T-IL-17AR	5′-GGGATATCTCTCAGGGTCCTCAT-3′
	T-IL-17AProbe	5′-FAM-TCCACTTCACCTTGGACTCTCCACCG-BHQ1-3′
IFN-γ	T-IFN-gF	5′-TGCTTTCTATCATTTTGGGATCTTC-3′
	T-IFN-gR	5′-TCCTGGATCAGTTGCATTAAAATAGT-3′
	T-IFN-gProbe	5′-FAM-AGCTGTTACTGCCAGGCCCCATTTATG-BHQ1-3′
GAPDH	T-GAPDH-F	5′-AAGGTCGGAGTAAACGGATTTG-3′
	T-GAPDH-R	5′-CGTTGATGGCCACGACATC-3′
	T-GAPDH-Probe	5′-FAM-TGGTCACCAGGGCTGCCTTCAAC-BHQ1-3′

1.4. 荧光 PCR 检测试剂建立及特异性实验

1.4.1. 核酸提取

实验分别取 2 只树鼩各 1 mL 抗凝全血，使用小鼠淋巴细胞分离液按照说明书进行淋巴细胞分离，加入 500 μL Trizol 进行 RNA 提取，最终得到 100 μL 提取 RNA，操作按照核酸提取试剂说明书进行。同时分别提取 5 × 10⁵ 左右的 MDCK 细胞 2 例、Hep-2 细胞 2 例及 1 mL 过夜培养的 E.coli TOP10、E.coli DH5a 各 1 例作为对照，方法同上。

1.4.2. 检测试剂建立

25 μL 反应体系中含有 5 × 一步法 RT-PCR 缓冲液 5 × reaction buffer 5 μL、dNTPs（10 mmol/L each）1.5 μL、正/反向引物（10 mmol/L each）各 1 μL、各组对应探针（10 mmol/L）0.3 μL、M-MLV 逆转录酶（200 U/μL）0.25 μL、Taq DNA 聚合酶（5 U/μL）0.2 μL、RNase Free dH₂O 10.75 μL、提取的样品核酸 5 μL。使用 ABI7500 荧光定量 PCR 仪进行反应，条件为：逆转录 48℃ 10 min；预变性 94℃ 2 min；循环条件：94℃ 10 s、55℃ 35 s（此步读取荧光值），40 个循环。实验中同时设置未加逆转录酶 M-MLV 的实验组，用于验证检测方法排除 DNA 干扰的能力。

1.4.3. 阳性 PCR 产物 T 载体克隆及测序验证特异性

扩增后阳性片段使用胶回收试剂盒进行回收。回收产物用于 pMD-18T 连接，并转化至 E.coli TOP10 感受态细胞中，后涂布于 LB-Amp 固体培养基平板中 37℃ 过夜培养。第二天挑取单克隆菌落接种于 3 mL 的 LB-Amp 液体培养中，37℃ 200 r/min 过夜培养。培养液直接送检用于测序分析（华大基因公司），并对比结果是否为正确的树鼩细胞因子序列。

1.5. 检测试剂的扩增线性范围及标准曲线

使用已经构建的含有树鼩目标检测片段的 T 载体克隆质粒作为灵敏度实验样品，对检测试剂的线性范围进行检测验证。

（1）培养含有树鼩 IL-6、IL-8、IL-10、IL-17A、IFN-γ 及 GAPDH 各目标片段的 T 载体质粒的细菌，并使用 TIANprep Plasmid extraction kit 提取质粒，步骤依照产品说明书进行。

（2）提取的质粒使用 NanoDrop ONE 分光光度计测量核酸浓度。根据其各自分子量和浓度计算得出 IL-6、IL-8、IL-10、IL-17A、IFN-γ 及 GAPDH 的 T 载体质粒的最终分子浓度分别为 5.85 × 10¹⁰、6.76 × 10¹⁰、7.02 × 10¹⁰、6.46 × 10¹⁰、7.29 × 10¹⁰、5.34 × 10¹⁰ copies/μL。

（3）质粒 10 倍梯度稀释，使 5 μL 上机检测的模板中分别含有 1 × 10¹⁰、1 × 10⁹、1 × 10⁸、1 × 10⁷、1 × 10⁶、0.2 × 10⁵、1 × 10⁴、1 × 10³、1 × 10²、1 × 10¹、1 × 10⁰ copies 的质粒。扩增检测，验证所建立试剂的线性范围及标准曲线方程。

1.6. 检测试剂的最低检测量

为验证所建立的试剂的最低核酸检测量，使用低浓度的含目标片段的 T 载体质粒，逐步 2 倍稀释后进行扩增检测，使 5 μL 上机检测的模板中分别含有 1 × 2¹⁰、1 × 2⁹、1 × 2⁸、1 × 2⁷、1 × 2⁶、1 × 2⁵、1 × 2⁴、1 × 2³、1 × 2²、1 × 2¹、1 × 2⁰ copies 的质粒。扩增检测，验证所建立试剂的最低检测量。

2. 实验结果

2.1. 树鼩常见感染相关细胞因子荧光 PCR 检测方法建立及特异性

使用树鼩血液淋巴细胞、犬来源的 MDCK 细胞、人来源的 Hep-2 细胞及 E.coli 进行试剂特异性检测。结果表明该套细胞因子检测体系具有良好的特异性，未在非树鼩来源的样品中检测出阳性（见表 2）。实验同时设置不加逆转录酶 M-MLV 实验，验证跨内含子引物探针设计对排除 DNA 干扰的能力。结果未加逆转录酶的样品检测中都为阴性（见表 2）。进一步对荧光 PCR 检测阳性的样品进行 T 载体克隆后测序表明都为目标片段，结果如图 1 所示。

表 2. Specificity testing of real-time PCR for infection-related cytokines and GAPDH of tree shrew .

树鼩常见感染相关细胞因子及 GAPDH 荧光定量 PCR 特异性检测

样品来源	加入逆转录酶 M-MLV							未加入逆转录酶 M-MLV
	IL-6	IL-8	IL-10	IL-17A	IFN-γ	GAPDH		IL-6	IL-8	IL-10	IL-17A	IFN-γ	GAPDH
注：* 为 Ct 值；“–”为阴性
树鼩淋巴细胞 1#	33.88*	26.75	31.84	29.20	27.46	27.05		−	−	−	−	−	−
树鼩淋巴细胞 2#	35.01	26.94	31.78	28.92	26.93	25.42		−	−	−	−	−	−
Hep-2 1#	−	−	−	−	−	−		−	−	−	−	−	−
Hep-2 2#	−	−	−	−	−	−		−	−	−	−	−	−
MDCK 1#	−	−	−	−	−	−		−	−	−	−	−	−
MDCK 2#	−	−	−	−	−	−		−	−	−	−	−	−
E.coli TOP10	−	−	−	−	−	−		−	−	−	−	−	−
E.coli DH5а	−	−	−	−	−	−		−	−	−	−	−	−

图 1.

Sequence analysis of the positive products of real-time PCR for cytokines and GAPDH of tree shrew

测序分析树鼩细胞因子及 GAPDH 荧光定量 PCR 扩增片段

2.2. 检测方法的扩增线性范围及标准曲线

使用 5 μL 稀释好的含有 1～1 × 10¹⁰ copies 的树鼩目标检测片段的 T 载体克隆质粒作为灵敏度实验样品，验证所建立试剂的线性范围。结果显示 IL-6 在 1 × 10¹⁰～10 copies、IL-8 在 1 × 10¹⁰～1 × 10³ copies、IL-10 在 1 × 10¹⁰～100 copies、IL-17A 在 1 × 10¹⁰～10 copies、IFN-γ 在 1 × 10¹⁰～1 × 10³ copies 及 GAPDH 在 1 × 10¹⁰～100 copies 模板下均具有很好的线性。在此区间建立标准曲线，各试剂线性相关系数 R² 均大于 0.99（见图 2、表 3）。

图 2.

Amplification and standard curves of real-time PCR for cytokines and GAPDH of tree shrew

树鼩细胞因子及其内参 GAPDH 荧光定量 PCR 扩增图谱及标准曲线

表 3. Amplification linear ranges and standard curves of real- time PCR for cytokines and GAPDH of tree shrew .

树鼩细胞因子及 GAPDH 荧光定量 PCR 扩增线性范围 及标准曲线

项目种类	线性范围 （copies/5 μL）	标准曲线
		斜率	截距	线性相关 系数 R2
IL-6	1 × 1010～10	−3.555	41.150	0.993
IL-8	1 × 1010～1 × 103	−3.793	47.371	0.993
IL-10	1 × 1010～100	−3.530	43.148	0.997
IL-17A	1 × 1010～10	−3.366	40.325	0.996
IFN-γ	1 × 1010～1 × 103	−3.628	41.740	0.995
GAPDH	1 × 1010～100	−3.535	44.260	0.995

2.3. 检测试剂的最低检测量

为验证建立的试剂的最低核酸检测量，使用低浓度的含目标片段的 T 载体质粒，逐步稀释后进行扩增检测。结果表明试剂最低可检测到：IL-6 为 8 copies，IL-8 为 8 copies，IL-10 为 4 copies，IL-17A 为 8 copies，IFN-γ 为 128 copies，GAPDH 为 4 copies。其扩增曲线在此浓度下仍可清晰判断阴阳性（见图 3）。

图 3.

Amplification curves of real-time PCR for detection of minimum templates of cytokines and GAPDH of tree shrew

树鼩细胞因子及 GAPDH 荧光定量 PCR 最低检测模板扩增曲线

3. 讨论

树鼩是一种在多个方面比犬、鼠等更接近人的优质小型动物模型，其本身的诸多优点使其受到广泛的关注，也已经被用于医学生物学多个方向的研究，取得了较好的效果。但总体上，树鼩作为实验动物的研究仍处于早期阶段，其品系开发及对应的商品化的产品仍不完善，这在一定程度上也限制了树鼩在研究中的应用。2013 年 Fan 等^[10]报道了树鼩的全基因组结果，为基于核酸检测的研究方法的建立奠定了重要基础，对其发展具有重大的推动作用。

本研究中针对树鼩感染相关的常见细胞因子 IL-6、IL-8、IL-10、IL-17A、IFN-γ 及管家基因 GAPDH 的保守区序列特点，基于 Taqman real-time PCR 技术方法设计了跨内含子的引物、探针，并用于检测试剂中。该方法通过验证，具有很好的特异性和灵敏度。设计管家基因 GAPDH 作为内参，可直接对采样的效果进行质控；同时，样品采集后处理、核酸提取等过程是否合格，也可以通过检测样品中的管家基因进行质控。因此，通过 GAPDH 的引入对采样效果及核酸提取进行有效质控，可有效减少试剂的假阴性结果。

本研究通过使用树鼩淋巴细胞和其他非树鼩来源的真核、原核样品核酸验证检测试剂的特异性，结果未见非特异扩增产生（见表 2）。对阳性扩增产物的测序分析也确认为树鼩细胞因子的目标序列（见图 1），进一步验证了试剂的特异性。同时实验证明跨内含子引物、探针设计有效地避免了基因组污染的问题，无需对模板进行 DNA 酶切消化，减少了对 RNA 的损伤，提高了试剂的应用效果和实验的精确性。

在对各组试剂灵敏度的检测中发现，各组试剂的线性范围高点可达到 1 × 10¹⁰ copies，低点在 IL-6 和 IL-17A 为 10 copies，在 IL-10 和 GAPDH 为 100 copies，在 IL-8 和 IFN-γ 为 1 000 copies（见表 3）。在此区间内扩增图谱呈现标准 S 型和很好的梯度（见图 2）。该区间内建立的标准曲线的线性相关系数 R² 均大于 0.99，同时斜率相近，标准曲线基本平行。在最低浓度检测中，IL-6 在 8 copies、IL-8 在 8 copies、IL-10 在 4 copies、IL-17A 在 8 copies、IFN-γ 在 128 copies、GAPDH 在 4 copies 模板量下仍能准确判断阴阳性。这些结果都说明所建立的检测试剂具有很好的灵敏度及较广的线性范围，适用于多重浓度范围的样品检测。

综合上面的实验表明，本研究所研发的树鼩感染相关细胞因子及其内参 GAPDH real-time PCR 检测试剂具有特异性高、灵敏度高、线性范围广、易操作等特点，可以用于树鼩感染相关细胞因子检测，具有良好的应用前景。

致谢：此研究得到广州呼吸健康研究院马婧的协助，在此表示衷心感谢。

Funding Statement

国家自然科学基金（31500143）；国家科技重大专项（2018ZX10102001，2017ZX10103011）；广东省自然科学基金项目（2016A030313572）；广州市科技计划项目（201803040004）