cAMP/Ca²⁺ 信号通路在红景天苷诱导骨髓间充质干细胞向神经元细胞定向分化中的作用和机制

Abstract

To investigate the mechanism of cAMP/Ca²⁺ signaling pathway inducing bone marrow mesenchymal stem cells to differentiate into neuronal cells, we cultured the bone marrow mesenchymal stem cells D1 cells in the present study. D1 cells were divided into two groups: control group and salidroside inducing groups. Control group was cultured with complete culture solution D/F12, while salidroside inducing groups were induced with 100 mg·L^–1 salidroside for different time periods (24, 48 and 72 hours). PCR-array assay was used to detect expression of 84 calcium related mRNA, and significantly different genes were chosen to analyse. As a result, there were 4 significantly upregulated mRNAs inclu-ding DNA damage-inducible transcript 3 (Ddit3), heat shock protein 5 (Hspa5), protein phosphatase 1 regulatory subunit (Ppp1r15a) and prostaglandin-endoperoxide synthase 2 (Ptgs-2), and 4 significantly downregulated mRNAs including glucagon (Gcg), interleukin 2 (Il2), tumor necrosis factor (Tnf) and somatostatin (Sst) in the cAMP/Ca²⁺ signaling pathway. They probably had an effect on the process of salidroside induced D1 cells differentiating into neuronal cells.

引言

红景天（Rhodiola）是多年生草本或亚灌木野生植物，因其花、根和茎的浸液都是红色而得名，素有“高原人参”的美称，是我国的传统藏药。药理研究表明其主要有效成分红景天苷（salidroside，SD）具有调节免疫、抗缺氧、降血糖、保护神经细胞、抗氧化、防辐射和保护肝脏等作用^[1-2]。课题组前期研究证明，红景天苷可诱导骨髓间充质干细胞（bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs）分化为神经元细胞，而 Ca²⁺/钙调蛋白（calmodulin，CaM）信号通路在其分化过程中具有一定作用^[3]。

实时荧光定量 PCR 是一种检测基因表达水平的分子生物学技术，它以准确的定量、较好的重现性等优势，得到了全世界的公认。其基本原理是将荧光染料或荧光探针加入 PCR 反应体系中，由于荧光信号强度与 DNA 产量成正比，因此通过连续监测荧光信号强度的变化便可得到靶序列的初始浓度，由此便可推断出目的基因的初始量。实时定量 PCR 阵列技术（real-time quantitative PCR array technique，RQ-PCR array）以实时定量 PCR 技术为核心并结合了阵列技术，具有高通量检测基因表达水平的优势，能够准确、可靠地检测大规模基因的表达，在疾病相关通路的研究中具有重要意义。美国 SABiosciences 公司生产的 RT² Profiler PCR Array 是 RQ-PCR-array 技术的代表，在研究疾病发生的分子机制和辅助诊断方面具有重要参考意义。本实验以 cAMP/Ca²⁺ 信号通路为研究对象，运用 RT² Profiler PCR Array 方法检测红景天苷诱导 BMSCs 不同时间后该信号通路中差异表达的基因，进一步揭示红景天苷诱导 BMSCs 分化为神经细胞的分子机制。

1. 材料与方法

1.1. 实验材料

小鼠骨髓间充质干细胞 D1 细胞株（序列号 ATCCCRL-12424），购自美国 ATCC 公司。

1.2. 实验仪器

紫外分光光度计（G1115A）购自美国 HP 公司；实时荧光定量 PCR 仪（73000）购自美国 ABI 公司；CO₂ 细胞培养箱（Forma371）购自美国 Thermo Revco 公司；超净工作台（SW-CJ-1FD）购自苏州苏洁净化设备有限公司；台式高速冷冻离心机（Primo R）购自德国 Heraeus 公司；微量高速离心机（TG16-W）购自湖南仪器仪表总厂兴华仪器厂；自动纯水蒸馏器（SCD-Ⅱ）购自天津锐马兰盾科技有限公司；荧光显微镜（倒置1×71）购自日本 OLYMPUS 公司；压力蒸汽灭菌器（YXP-LS-50A）购自上海博迅实业有限公司；电热恒温鼓风干燥箱（ZX-GF101-BS2）购自上海跃进医疗器械厂。

1.3. 主要试剂

红景天苷标准品购自中国药品生物制品检定所，纯度≥98%；D/F12 培养基购自美国 GIBCO 公司；胎牛血清购自兰州荣晔生物公司；全反式维甲酸（Retinoids acid，RA）购自美国 Sigma 公司；反转录试剂盒（Prime Script^TM reagentKit、RNeasy Mini Kit 和 RT² First strand kit）购自德国 QIAGEN 公司。

2. 实验方法

2.1. D1 细胞的培养

用含 10% 胎牛血清的 D/F12 完全培养液常规培养 D1 细胞，每 2～3 天更换一次培养液，待 80% 细胞融合后，用 0.25% 的胰酶对其消化传代，继续培养。

2.2. 神经细胞标志分子相关基因表达的检测

实验分为空白对照组、红景天苷诱导组和维甲酸诱导组（阳性对照组），分别使用 D/F12 完全培养液、含有 100 mg·L^–1 红景天苷的 D/F12 完全培养液、5 μg·L^–1 维甲酸诱导 D1 细胞 12 h，通过凝胶电泳检测神经细胞标志分子相关基因神经元特异性烯醇化酶（neuron-specific enolase，NSE）、β 微管蛋白 Ⅲ（β-Tubulin Ⅲ）和微管结合蛋白 2（microtubule- associated protein 2，MAP2）的表达情况。将 1×TAE 电泳缓冲液加至液面覆盖琼脂糖凝胶，在超净工作台上，吸取总 RNA 样品 4 μL 于封口膜上。在实验台上再加入 5 μL 1×TAE 电泳缓冲液及 1 μL 的 10×载样缓冲液，混匀后，小心加入点样孔。打开电源开关，调节电压至 100 V，使 RNA 由负极向正极电泳，约 30 min 后将凝胶放入 EB 染液中染色 5 min，用清水稍微漂洗。在紫外透射检测仪上观察 RNA 电泳结果，所有实验重复 3 次。

2.3. cAMP/Ca²⁺ Signaling PathwayFinder PCR Array 检测

实验分为红景天苷诱导组和空白对照组，诱导组细胞加入含有 100 mg·L^–1 红景天苷的 D/F12 完全培养液，空白对照组细胞加入不含药物的等量 D/F12 完全培养液，分别作用 D1 细胞 24、48 和 72 h。按照 RNeasy Mini Kit 试剂使用说明提取细胞总 RNA，紫外分光光度计测定 RNA 纯度和浓度，采用 G1115A 紫外分光光度计分别测定各组总 RNA 在 260、280、320 nm 波长的 OD 值，并用甲醛变性凝胶电泳做进一步的 RNA 质量检测。各组总 RNA 纯度应符合：OD260/OD280 Ratio 值在 1.8～2.0 之间。取 1 μg 总 RNA，RT² First Strand Kit 合成 cDNA，反应体系 10 μL，反应条件：42℃，15 min；95℃，5 min；采用荧光定量 PCR-7300 两步法扩增，反应体系 25 μL，PCR 反应条件：95℃ 预变性 10 min；95℃ 变性 15 s；60℃ 退火 1 min，40 个循环。分别检测信号通路中相关基因 mRNA 的表达水平，基因的相对表达采用 2^–ΔΔct 公式计算，所有实验重复 3 次。

2.4. 统计学分析

凝胶电泳检测结果使用单因素方差分析进行统计，RT² Profiler PCR Array 所得数据运用 RT² Profiler PCR Array Data Analysis version 3.5 软件在线进行分析（ http://pcrdataanalysis.sabiosciences. com/pcr/array analysis.php），上调或下调显著的判定标准为实验组比对照组表达量≥2 倍。

3. 实验结果

3.1. 凝胶电泳检测结果

红景天苷诱导 12 h 后，可见在 NSE、β-Tubulin Ⅲ 和 MAP2 mRNA 的表达上（见图 1），阳性对照组上述基因的表达丰度均低于红景天苷诱导组，差异具有统计学意义（P<0.01）；而空白对照组未见上述基因的表达。

图 1.

Expression of neuron related genes in different induced groups　1: salidroside induction group; 2: retinoic acid induction group; 3: control group; M: marker. Compared with the blank control group, ^*P<0.05,^**P<0.01; compared with the retinoic acid induction group,^#P<0.05

不同诱导组中神经相关基因的表达　1：红景天苷诱导组；2：维甲酸诱导组；3：空白对照组；M：分子量标记。与空白对照组相比，^*P<0.05，^**P<0.01；与维甲酸诱导组相比，^#P<0.05

3.2. PCR Array 检测结果

将实时荧光定量 PCR 所得数据使用 QIAGEN 公司在线软件进行分析，24、48、72 h 诱导组分别与对照组比较，诱导后 cAMP/Ca²⁺ 信号通路中 84 个相关基因的表达情况如表 1 所示。

表 1. Genes expression of induction groups compared with that of control group (n=3).

诱导组与对照组基因表达的比较（n=3）

基因	24 h			48 h			72 h			基因	24 h			48 h			72 h
	变化	评价		变化	评价		变化	评价			变化	评价		变化	评价		变化	评价
↑表示上调基因，↓表示下调基因，空白为无变化基因。OK 表示结果重复性优，A 表示结果重复性良好，B 表示结果重复性一般，C 表示结果重复性差
Adrb1	↓	OK			B		↓	OK		Kcna5		B			OK		↑	OK
Ahr	↑	OK		↓	A		↑	OK		Krtap14		C			C			OK
Amd1	↑	OK		↑	OK			OK		Ldha	↑	OK			OK			OK
Areg	↑	OK		↑	OK		↑	OK		Maf		OK			OK		↓	OK
Atf3	↑	OK		↑	OK		↑	OK		Mif	↑	OK		↑	OK			OK
Bcl2	↑	OK		↑	OK		↑	OK		Ncam1	↑	OK		↑	OK		↑	OK
Bdnf	↑	OK		↑	OK		↑	OK		Nf1		OK		↑	OK			OK
Brca1		OK			OK			OK		Nos2	↓	A		↓	OK		↓	A
Calb1	↓	OK			B			OK		Npy	↓	OK		↓	OK		↓	OK
Calb2	↓	OK		↓	OK		↓	OK		Pck2	↑	OK		↑	OK		↑	OK
Calcrl	↑	OK		↑	OK		↑	OK		Pcna	↑	OK		↑	OK			OK
Calm1		OK			OK			OK		Penk	↓	A			A		↑	OK
Calr		OK		↑	OK			OK		Per1		OK		↑	OK			OK
Ccna1	↓	OK			B		↓	OK		Plat		OK			OK			OK
Ccnd1		OK			OK			OK		Pln	↓	OK			OK		↓	A
Cdk5		OK			OK			OK		Pmaip1	↑	OK		↑	OK			OK
Cdkn2b		B			B			B		Pou1f1		OK		↑	OK			OK
Cga	↓	OK		↓	OK		↑	OK		Pou2af1	↓	OK		↓	OK		↓	OK
Chga	↓	OK		↓	OK		↑	A		Ppp1r15a	↑	OK		↑	OK		↑	OK
Cnn1	↓	OK			B			B		Ppp2ca	↑	OK		↑	OK		↑	OK
Creb1	↑	OK		↑	OK		↑	OK		Prkar1a	↑	OK		↑	OK			OK
Crem		OK			OK			OK		Prl	↓	OK		↓	OK		↓	OK
Crh		B			B			B		Ptgs2	↑	OK		↑	OK		↑	OK
Cyr61	↑	OK		↑	OK		↑	OK		Rb1		OK		↑	OK			OK
Ddit3	↑	OK		↑	OK		↑	OK		S100a8	↓	OK		↓	OK		↓	OK
Dusp1	↑	OK		↑	OK		↑	OK		S100a9	↓	OK		↓	OK		↓	OK
Egr1	↑	OK		↑	OK		↑	OK		S100g		OK			OK			OK
Egr2	↑	OK		↑	OK		↑	OK		Scg2	↓	OK		↓	OK		↓	OK
Eno2	↑	OK		↑	OK			OK		Sgk1		OK		↑	OK		↑	OK
Fgf6		B			B			B		Slc18a1	↓	OK		↓	OK		↓	OK
Fos		OK		↑	OK			OK		Sod2	↑	OK		↑	OK		↑	OK
Fosb		OK		↑	OK		↑	OK		Srf		OK		↑	OK		↑	OK
Gcg	↓	OK		↓	OK		↓	OK		Sst	↓	OK		↓	OK		↓	OK
Gem		OK		↑	OK			OK		Sstr2		B			OK			OK
Hk2		OK			OK			OK		Stat3	↑	OK		↑	OK		↑	OK
Hspa4		OK			OK			OK		Tacr1	↓	OK		↓	OK		↑	A
Hspa5	↑	OK		↑	OK		↑	OK		Tgfb3		OK		↑	OK		↑	OK
Il2	↓	OK		↓	OK		↓	OK		Th	↑	OK		↑	OK		↑	A
Il6	↑	A		↑	A			OK		Thbs1	↑	OK		↑	OK		↑	OK
Inhba	↑	OK		↑	OK		↑	OK		Tnf	↓	OK		↓	OK		↓	OK
Junb	↑	OK		↑	OK			OK		Vcl		OK			OK			OK
Jund	↑	OK			OK		↓	OK		Vip	↓	OK		↓	OK		↓	OK

与对照组比较，各诱导组基因变化情况如图 2 所示。其中 24 h 诱导组与空白对照组比较基因变化情况，上调基因有 12 个，下调基因 19 个（上图）；48 h 诱导组与空白对照组比较基因变化情况，上调基因 17 个，下调基因 12 个（中图）；72 h 诱导组与空白对照组比较基因变化情况，上调基因 14 个，下调基因 13 个（下图）。

图 2.

Scatter diagram of induction groups compared with that of control group　Group 1: 24 h induction group; Group 2: 48 h induction group; Group 3: 72 h induction group; Control: blank control group

24 h、48 h、72 h 诱导组基因变化散点图Group 1：24 h 诱导组；Group 2：48 h 诱导组；Group 3：72 h 诱导组；Control：空白对照组

综合以上结果，与对照组比较，诱导组中均表达上调且差异较显著的基因有 4 个，依次是：DNA 损伤诱导转录因子 3（DNA damage-inducible tran-script 3，Ddit3），变化在 20 倍以上；蛋白磷酸酶 1 调节亚单位 15a（protein phosphatase 1 regulatory subunit 15A，Ppp1r15a），变化在 13 倍以上；前列腺素内过氧化物合酶（prostaglandin-endoperoxide synthase 2，Ptgs2），变化量在 9 倍以上；热休克蛋白 5（heat shock protein 5，Hspa5），变化量 6 倍以上；其余基因在 2～5 倍之间，见图 3。

图 3.

Up-regulated and down-regulated genes according to fold changes　Compared with the blank control group, ^*P<0.05,^**P<0.01

根据差异倍数筛选的上调、下调基因　与空白对照组相比，^*P<0.05，^**P<0.01

诱导组表达下调且差异显著的基因有 4 个，依次是：胰高血糖素（glucagon，Gcg），变化倍数 8～16 倍；白细胞介素 2（interleukin 2，Il2）和肿瘤坏死因子（tumor necrosis factor，Tnf），变化倍数 5～10 倍；生长激素抑制素（somatostatin，Sst），变化 5～8 倍，见图 3。

基因聚类图显示（图 4），Ptgs-2、Ddit3、Hspa5 等基因相关性较强，Gcg、Il2 相关性较强，Sst、Tnf 相关性较强。

图 4.

Cluster analysis of different time induction groups compared with that of control group　Group 1: 24 h induction group; Group 2: 48 h induction group; Group 3: 72 h induction group; Control: blank control group

不同时间诱导组与对照组基因变化聚类图　Group 1：24 h 诱导组；Group 2：48 h 诱导组；Group 3：72 h 诱导组；Control：空白对照组

4. 讨论

红景天味甘性寒，归脾、肺经，具有补肾养心、调经活血、明目安神、扶正固本之功效。红景天苷是红景天的主要有效成分，研究表明，红景天苷具有调节免疫、抗缺氧、保护神经细胞、抗氧化等作用^[2]。本实验结果显示，红景天能显著上调神经细胞相关基因 NSE、β-Tubulin Ⅲ 和 MAP2 的 mRNA 表达。NSE 是神经元和神经内分泌细胞所特有的标志分子，在鉴定神经细胞方面具有重要意义。β-Tubulin Ⅲ 是神经分化相关的一种微管蛋白。MAP2 的表达与与神经元的生长和损伤后修复有关。由此可知，红景天苷可诱导 BMSCs 向神经元样细胞分化。

细胞分化是指相同类型的细胞在分裂的过程中逐渐形成的在形态、结构和功能上都具有稳定性差异的细胞。其核心是通过基因的调控使细胞内合成了不同的专一蛋白质。

本实验将红景天苷作用 D1 细胞不同时间后，对表达差异具有统计学意义的基因进行筛选，涉及到的生物学功能主要包括细胞周期、细胞应激、炎症反应、DNA 损伤修复等各方面。我们从中挑选出上调较显著的基因 Ddit3、Hspa5、Ppp1r15a 和 Ptgs-2，以及下调较显著的基因 Gcg、Il2、Tnf 和 Sst，对其作用机制进行分析研究，以探讨 cAMP/Ca²⁺ 信号通路在红景天苷诱导 BMSCs 向神经元样细胞分化中的作用机制。

Ddit3 是内质网应激反应中的多功能转录因子，研究显示，它可上调 Ppp1r15a 基因^[4]与内质网氧化还原酶 1（endoplasmic reticulum oxidoreductase 1，EROlα）基因的表达^[5]，而后者又可激活磷脂酰肌醇 3-激酶（phosphatidylinositol 3-kinase，IP3R），从而促进大量的 Ca²⁺ 从内质网转运至胞质，使胞内 Ca²⁺ 浓度升高^[6]。研究发现内质网应激可上调 Ddit3 的表达^[7]，实验结果表明，Ddit3 在诱导 48 h 时上调较为显著，说明 Ddit3 在红景天苷诱导前期对 BMSCs 的神经向分化具有促进作用。

热休克蛋白是生物界中高度保守的一种蛋白质，细胞在受到某些刺激（如缺氧、高热、感染、缺血及化学物质等）时，机体在很短的时间内大量合成热休克蛋白，热休克蛋白的出现标志着细胞自身保护机制的启动。热休克蛋白还具有神经保护作用，许多神经系统疾病如癫痫、阿尔茨海默症、多发性硬化等，都与热休克蛋白有关^[8]。Hspa5 是热休克蛋 白70（heat shock protein 70，HSP70）家族的成员之一^[9]，该家族包含 21 种蛋白质，它们在进化上保持高度同源性。大体可分为 4 种类型：HSP70、HSC70、GRP78 和 GRP75^[10-11]。张霞等^[12]实验研究显示，热休克状态时，小鼠胚胎成纤维细胞中 CaM 和 HSP70 的表达量显著增加，若阻断 CaM 则 HSP70 的表达量也降低。Holmberg 等^[13]报道，钙调蛋白依赖性蛋白激酶 Ⅱ（calmodulin dependent protein kinase Ⅱ，CaMKⅡ）能促使 HeLa 细胞中热休克因子 1（heat shock factor 1，HSF1）的 Ser230 位点磷酸化，而 HSF1 可在热休克状态时被活化，并诱导 HSP70 基因的转录^[14]。CaMKⅡ 是 Ca²⁺/CaM 信号下游的一种重要蛋白激酶，可直接被 Ca²⁺/CaM 激活^[15]，并参与乙酰胆碱依赖性钙离子通道的激活^[16]和神经传导^[17]等生理过程。因此，Ca²⁺ 浓度的增加可激活 HSP70 的表达。实验显示，随着红景天苷诱导时间的增加，细胞内 Ca²⁺ 浓度在 48 h 时出现峰值，同样 HSP70 在 48 h 时表达量最高，结果表明 HSP70 在诱导中起正调控作用，48 h 时较为显著。

Ppp1r15a，又称为 GADD34（DNA 损伤诱导蛋白 34）。PP1 是一种细胞周期蛋白，是真核生物中的一种重要的蛋白磷酸酶，参与细胞的生长、分化、转录、翻译等生理过程^[18]。PP1 和 CaMKⅡ 是一对去磷酸化与磷酸化蛋白质，它们可直接或间接参与 Ca²⁺ 及 Ca²⁺-ATPase 活性的调控^[19]。研究表明，内质网应激在脑缺血预处理后引起的神经保护中发挥着重要作用^[20]，Ppp1r15a 在实验中表达升高，说明其对神经分化起正调控作用，48 h 时较显著。

Ptgs2 又名环氧化酶 2（cyclooxygenase 2，COX-2），是一种重要的炎性介质，参与中枢神经系统多种病理过程，参与炎症反应、神经元死亡、神经元超兴奋性、星形细胞活化，也与细胞增殖有关^[21]。它是前列腺素合成的限速酶，在正常体细胞中不表达，仅在细胞受到某种刺激（如生长因子、细胞因子、维甲酸和热休克蛋白等）时才会迅速合成并分泌，被称为“快速反应基因”。Ptgs2 启动子上含有两个核转录因子 κB（nuclear transcription factor，NF-κB）位点序列，该序列可诱导 Ptgs2 转录激活，当它与特异性抑制因子结合后，以 IκB 非活性形式存在。核转录因子 κB 激酶抑制剂（inhibitor of nuclear factor kappa-B kinase，IKK）是 NF-κB 信号传导通路的关键性激酶，当细胞外信号作用于细胞时，可激活 IKK，使 IκB 磷酸化，并释放出有活性的 NF-κB，活化的 NF-κB 进入细胞核后可调节许多基因的转录[如神经黏附分子、诱导型一氧化氮合酶、脑源性神经营养因子（brain-derived neurotmphic factor，BDNF）、Ptgs2 和 CaMKⅡ]^[22]，参与细胞的增殖、分化、炎症反应、凋亡等过程。研究表明^[23]，神经元细胞的胞外 Ca²⁺ 可通过 L-型钙离子通道进入细胞内，进而激活 CaMKⅡ，后者又经过自体磷酸化而激活 NF-κB，NF-κB 在神经突触可塑性中具有重要作用。Ptgs2 在诱导过程中表达上调，表明它对神经元样细胞的诱导分化具有促进作用，48 h 时较显著。

Choudhary 等^[24]研究发现 Ca²⁺ 诱导 Ptgs2 mRNA 的表达启动子的活性不依赖于蛋白激酶 C（protein kinase C，PKC）而依赖于蛋白激酶 A（protein kinase A，PKA）信号通路。Ogata 等^[25]采用下颌骨成纤维细胞研究 Ca²⁺ 敏感性受体的作用时发现，细胞外 Ca²⁺ 可能通过 Ca²⁺ 敏感性受体激活细胞外调节蛋白激酶（extracellular regulated protein kinases，ERK）1/2、p38MAPK 和 c-jun N 端激酶（c-jun N-terminal kinase，JNK），增加 Ptgs2 的表达。而陈亚男^[26]研究发现，红景天苷可通过激活 ERK1/2 和 PI3K/AKT/mTOR 信号通路，促进 BMSCs 向神经细胞定向分化。

Gcg 又名胰增血糖素或抗胰岛素，是胰岛 α 细胞分泌的一种激素，具有促进糖原分解和糖异生的作用。Gcg 作用初期首先与胞细胞膜上的受体特异性结合，将腺苷酸环化酶活化，cAMP 成为第二信使活化磷酸化酶，促进糖原分解。研究表明^[27]，细胞内钙离子浓度的升高可促使 Gcg 的释放。这是由于血糖浓度的下降能促使胰岛 α 细胞释放谷氨酸盐，谷氨酸盐作用于 α-氨基-3-羟基-5-甲基-4-异恶唑丙酸（α-amino-3-hydroxy-5-methyl-4-isoxazole-propionic acid，AMPA）和 kainate 型促离子型谷氨酸受体，使细胞膜去极化，钙离子通道被打开，细胞质中的自由钙离子浓度增加，从而促进 Gcg 的释放。Gcg 在诱导分化中表达下调，表明其对 BMSCs 的神经向分化起负调控作用。

Il2 是一种具有多向性作用的细胞因子，主要由活化的 T 细胞产生，对机体的免疫应答和抗病毒感染等有重要作用。研究表明^[28]，Il2 与其受体结合后主要通过三条信号通路进行信号转导：JAK/STAT5、PI3K/Akt/mTOR 以及丝裂原激活的蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）通路。实验已证实，在离体神经细胞培养中，Il2 可促进鼠海马细胞、皮质细胞、纹状体、小脑及交感神经元的存活。Il2 可影响神经元的形态如轴突的分支及长度。目前认为其对神经轴突起的外生作用是直接的，而对神经元存活的影响可能为间接的，还可能参与影响少突胶质细胞的增生及成熟分化及星形胶质细胞、小胶质细胞的生长^[29]。实验结果表明 Il2 表达下调，说明它对神经向分化具有抑制作用。

Tnf 是一种抗肿瘤作用最强的细胞因子，主要由活化的单核/巨噬细胞产生，除了杀伤和抑制肿瘤细胞外，还可促进细胞的增殖、分化。根据其来源和结构不同可分为 Tnf-a 和 Tnf-b，同时，Tnf 还具有抗病毒及细菌，激活 T 细胞，促进 Il1、Il2、Il6 的产生及分泌，诱发炎症反应的作用，是重要的炎症因子^[30]。研究表明，Tnf 具有体外诱导 BMSCs 向神经样细胞分化的作用^[31]。本实验结果表明 Tnf 对神经元样细胞的分化起负调控作用。

Sst 广泛存在于中枢及周围神经系统、心脏、甲状腺、消化道及胰腺中，其中神经系统的下丘脑浓度最高。武小路^[32]研究发现，Sst 对丘脑、大脑皮层和脊髓神经元具有普遍的抑制作用，注射 Sst 可抑制脑许多部位的自发性电活动，从而影响动物的行为。实验结果表明，Sst 在红景天苷诱导后表达下调，因此它在此过程中具有抑制作用。

前期研究结果表明，红景天苷可诱导 BMSCs 分化为神经元样细胞，在其分化过程中 ERK1/2 以及 PI3K/AKT/mTOR 信号通路在诱导分化过程中具有促进作用^[26]，而 Ca²⁺/CaM 信号途径在诱导过程中则起抑制作用。根据本实验基因聚类分析结果可以看出，Ddit3、Hspa5、Ptgs2 和 ppp1r15a 之间，以及 Gcg、Il2、Tnf 和 Sst 之间具有相关性，说明它们是功能相似或者密切相关的一类基因。经过分析发现 Ddit3、Hspa5、Ptgs-2、Ppp1r15a 在诱导分化过程中具有正调控作用，Gcg、Il2、Tnf、Sst 则对诱导起负调控作用。综上所述，cAMP/Ca²⁺ 信号通路中以上基因在诱导分化中的调控作用及它们之间的相互作用是红景天苷诱导 BMSCs 分化为神经元样细胞的分子学基础。

Funding Statement

国家自然科学基金面上项目（81073156）