Usher综合征相关基因变异的遗传及临床表型分析

Abstract

Objective

To investigate the molecular characteristics and clinical heterogeneity of Usher syndrome(USH) -related gene variants in patients with hereditary hearing loss in southwest China, providing a basis for early diagnosis and clinical management.

Methods

Thirteen patients from twelve families with hearing loss who attended the Affiliated Children's Hospital of Kunming Medical University between January 2017 and March 2021 were enrolled. All patients were identified as carrying USH-related gene variants through next-generation sequencing. Sanger sequencing was performed for all patients and their parents to validate the pathogenic variants. Comprehensive clinical evaluations, including medical history collection, otologic and ophthalmologic examinations, and vestibular function assessments, were conducted.

Results

Among the 13 patients, 4 were diagnosed with USH type 1 and 2 with USH type 2. A total of 19 pathogenic or likely pathogenic variants were detected in USH-related genes, including MYO7A, CDH23, USH1C, and USH2A. The causative gene was MYO7A in 3 probands, CDH23 in 5, USH1C in 3, and USH2A in 2. All patients exhibited an autosomal recessive inheritance pattern. Vestibular dysfunction was observed in 4 patients, and retinitis pigmentosa(RP) in 3 patients. Based on the genotype-phenotype correlation, 6 patients were initially diagnosed with USH, while 7 were classified as having non-syndromic hearing loss(NSHL).

Conclusion

This study revealed the clinical heterogeneity of USH-related gene variants in patients with hereditary deafness in southwest China. Although the clinical manifestations of USH are complex and there are overlapping characteristics between different subtypes, genetic testing provides an important basis for early diagnosis and precise clinical management. Especially for those with typical hearing loss, early genetic diagnosis can provide a window of time for early detection and intervention of retinitis pigmentosa.

人类的日常生活在很大程度上依赖于神经感觉系统，其中视觉和听觉在认知、沟通和社交能力中发挥着关键作用。聋盲症是一种同时影响听觉与视觉功能的严重综合性障碍，显著限制了患者的社会参与能力。Usher综合征(Usher syndrome，USH)是最常见的聋盲综合征，在65岁以下的遗传性聋盲症患者中USH约占50%以上^[1]。USH是一种常染色体隐性遗传病，其主要临床特征包括感音神经性听力损失(sensorineural hearing loss，SNHL)和视网膜色素变性(retinitis pigmentosa，RP)以及伴或不伴有前庭功能障碍^[2]。根据发病年龄、严重程度和症状进展USH分为4种亚型。Usher 1型(USH1)为临床表现最严重的亚型，临床特点是先天性重至极重度SNHL、青春期前发生RP以及前庭功能障碍^[3]；Usher 2型(USH2)是最常见的亚型，临床特点是先天性中至重度SNHL、生命的第二个十年或更晚发生RP，且无前庭受累^[4]；Usher 3型(USH3)的临床特点是可变的进行性SNHL、青春期后发生RP以及无前庭受累^[5]；Usher 4型(USH4)的临床特点是迟发性进行性SNHL、迟发性RP以及无前庭受累^[6]。目前已鉴定出10个USH的致病基因，其中USH1相关基因为MYO7A、USHIC、CDH23、PCDHI5、SANS；USH2相关基因为USH2A、ADGRV1、WHRN；USH3相关基因为CLRN1；USH4相关基因为ARSG (http://hereditaryhearingloss.org)。此外，MYO7A的致病突变还可导致非综合征性常染色体显性或隐性听力损失(DFNA11和DFNB2)或非典型的USH^[7]，CDH23、USH1C的致病突变亦可导致非综合征性常染色体隐性听力损失(前者DFNB12，后者DFNB18)。USH在临床表型和遗传学特征上均表现出较高的异质性。尽管进行了精细的亚型分类和基因鉴定，但仍有重叠特征和非典型表现的病例被报道^[8]。随着现代科学技术的快速发展，尤其是基因检测的临床应用，使USH的疑似患者在基因层面得以明确。本研究通过对我国西南地区12个耳聋家系的深入分析，探讨了USH相关基因变异所致遗传性聋的临床特征与基因变异谱。

1. 对象与方法

1.1. 研究对象

本研究对象为2017年1月—2021年3月于昆明医科大学附属儿童医院耳鼻咽喉头颈外科就诊的经二代测序检出携带USH相关基因变异的12个耳聋家系共13例患者，所有家系均来自中国西南地区。本研究经昆明医科大学附属儿童医院医学伦理委员会批准(No：2023-03-368-K01)，患儿及其家系成员均已签署知情同意书(未成年人由监护人签署)。

1.2. 方法

1.2.1. 临床评估

对所有先证者及可疑家系成员进行完整病史(出生史、耳聋病史、家族史、耳毒性药物应用史等)采集和全身体格检查。耳科检查：对先证者行耳纤维内镜检查、耳声发射、听性脑干反应、多频稳态诱发电位、声导抗、颞骨CT和头颅MRI等听力学及影像学检查，以及包括独立行走时间随访在内的前庭功能评估。眼科检查：视力、眼压、眼底照相、光学相干断层扫描后极部+黄斑、视觉诱发电位(P+FVEP)等检查。

1.2.2. 遗传学检测

① 目的基因捕获及高通量测序，取所有先证者外周静脉血2 mL，按照试剂盒建议的实验方案使用QiagenDNA MiniKit试剂盒(上海Qiagen公司)提取基因组DNA。目标基因捕获、质量评估及测序均按本团队前述方法^[9]执行。②生物信息学分析与变异位点筛选，测序数据经过比对、变异调用和注释后，筛选出耳聋相关基因的关键变异，最终根据美国医学遗传学和基因组学学会(Amercian College of Medical Geneticsand Genomics，ACMG)的指南对目标变异进行分类^[10-11]。本团队已在前期研究报告中公布了详细的生物信息学分析与变异位点筛选流程^[9]。③Sanger测序，抽取所有家系成员外周静脉血，提取基因组DNA。根据先前高通量测序所捕获到的可疑致病变异通过聚合酶链反应(PCR)和Sanger测序，在家系成员中进行验证。引物的设计、PCR反应以及序列比对流程与前期研究一致^[9]。

2. 结果

2.1. 临床资料

共纳入12个携带USH相关基因变异的家系，包含13例患者。全部家系符合常染色体隐性遗传模式(图 1)。入组患者中男8例，女5例；年龄2~10岁。所有患者经耳纤维内镜、颞骨CT及头颅MRI检查均未见明显结构性异常，无耳外伤史、中耳炎病史、耳毒性药物暴露史。所有患者父母非近亲结婚，无耳聋家族史，听力、视力均未见明显异常。

图 1.

所有家系图谱

所有患者均在4岁前发生双侧重-极重度感音神经性听力损失。家系2、7、10患者出生时听力筛查通过且言语发育正常，随后逐渐出现进行性听力下降，被诊断为语后聋。其余患者均表现为先天性听力损失。

视力情况：随访眼科检查显示：家系1、8、9先证者双眼视网膜色素变性(图 2)，其余患者视力目前无明显异常。

图 2.

家系1、8、9先证者眼底图

图中均可见明显的视网膜色素变性；A：家系1左眼，B：家系1右眼；C：家系8左眼，D：家系8右眼；E：家系9左眼，F：家系9右眼。

前庭功能评估情况：家系1、4、5、8、9先证者独立行走时间延迟(独立行走时间可以评估患者的前庭功能，往往超过18个月提示前庭功能异常)，其中家系1先证者迄今仍行走不稳、上下楼梯需要搀扶。其余患者正常。

所有患者均于我科接受单侧或双侧人工耳蜗植入术，详细临床资料及初步诊断见表 1。

表 1.

所有家系的突变基因与临床资料

家系编号	性别	年龄/岁	变异基因	听力情况	眼部情况	独立行走时间/月	其他系统异常	治疗方式	初步诊断
*需长期随访评估USH可能。
家系1	男	6	MYO7A	语前聋	RP	21		双侧人工耳蜗植入	USH1
家系2	女	10	MYO7A	语后聋	正常	14		单侧人工耳蜗植入	DFNB2
家系3	女	5	MYO7A	语前聋	正常	12		双侧人工耳蜗植入	DFNB2*
家系4	男	5	CDH23	语前聋	PVEP异常	24		双侧人工耳蜗植入	USH1
家系5	男	4	CDH23	语前聋	正常	16		双侧人工耳蜗植入	DFNB12*
家系6	男	7	CDH23	语前聋	正常	12		单侧人工耳蜗植入	DFNB12
	女	2	CDH23	语前聋	正常	11		双侧人工耳蜗植入	DFNB12
家系7	女	8	CDH23	语后聋	正常	15		双侧人工耳蜗植入	DFNB12
家系8	女	6	USH1C	语前聋	RP	21		单侧人工耳蜗植入	USH1
家系9	男	5	USH1C	语前聋	RP	24		单侧人工耳蜗植入	USH1
家系10	男	9	USH1C	语后聋	正常	14		单侧人工耳蜗植入	DFNB18
家系11	男	6	USH2A	语前聋	正常	12	双侧隐睾、动脉导管未闭	双侧人工耳蜗植入	USH2
家系12	男	6	USH2A	语前聋	正常	14	房间隔缺损、卵圆孔未闭、环状胰腺	双侧人工耳蜗植入	USH2

2.2. 遗传学资料

共检出USH相关基因(MYO7A、CDH23、USH1C、USH2A)致病或可疑致病变异19个。具体而言，11例患者存在USH1相关基因的致病变异，2例患者存在USH2相关基因的致病变异。其中3例先证者的致病基因为MYO7A，5例先证者的致病基因为CDH23，3例先证者的致病基因为USH1C，2例先证者的致病基因为USH2A (图 3)。

图 3.

所有家系先证者及家系成员基因检测结果

根据HGMD专业版数据库检索，家系4先证者的CDH23基因外显子37~50区域纯合缺失及家系7先证者CDH23基因c.6656A>T为未报道变异，其余所有变异位点均已在团队前期研究中报道^[9]。其中家系6中的2例患者致病基因变异位点相同。家系2、4、8、9、10先证者为纯合变异，其他均为复合杂合变异。家系2先证者为MYO7A基因c.765C>A纯合变异，母亲为表型正常的携带者，父亲无法提供血样。所有先证者父母均表型正常，家系内呈常染色体遗传模式；经Sanger验证除家系2先证者父亲外其余所有父母均为杂合变异携带者，所有变异在家系中符合共分离规律。除此之外，我们还检测到家系3先证者携带一个GJB2基因的c.109G>A变异，家系7先证者分别携带来源于父母的CDH23基因的c.9058C>T变异和PCDH15基因的c.1385A>G变异，家系10先证者携带来源于父亲的PTPRQ基因的c.1811T>C、c.3027A>G变异，通过分析变异频率、遗传方式和家系验证等排除了这些候选致聋基因。检测结果及致病性证据见表 2。

表 2.

所有家系USH相关基因变异信息

家庭编号	变异基因	cDNA	氨基酸改变	变异分类	MAF	预测	致病性分析	变异来源
MAF：最小等位基因频率；D：预测有害，B：预测良性，“—”表示未知。
家系1	MYO7A	c.4254delC	p.D1419Tfs*7	移码突变	—	—	致病	父
		c.5648G>T	p.R1883L	错义突变	—	D	疑似致病	母
家系2	MYO7A	c.765C>A	p.F255L	错义突变	0.0000000	D	疑似致病	母
家系3	MYO7A	c.160A>G	p.T54A	错义突变	0.0006000	B	意义未明	母
		c.4757A>G	p.N1586S	错义突变	0.0047317	B	意义未明	父
家系4	CDH23	del	(-)	CNV			疑似致病	父母
家系5	CDH23	c.805C>T	p.R269W	错义突变	0.0000086	B	意义未明	父
		c.2866G>A	p.E956K	错义突变	0.0000638	D	致病	母
家系6	CDH23	c.6604G>A	p.D2202N	错义突变	—	D	意义未明	父
		c.6504T>A	p.N2168K	错义突变	0.0006000	D	意义未明	母
家系7	CDH23	c.4562A>G	p.N1521S	错义突变	0.0006410	D	疑似致病	母
		c.6656A>T	p.D2219V	错义突变	0.0001997	B	意义未明	父
家系8	USH1C	c.388-1G>A	剪接突变	剪接突变	0.0000544	—	致病	父母
家系9	USH1C	c.388-1G>A	剪接突变	剪接突变	0.0000544	—	致病	父母
家系10	USH1C	c.1527delT	p.I509Mfs*2	移码突变	—	—	致病	父母
家系11	USH1C	c.11053T>C	p.W3685R	错义突变	0.0006000	B	意义未明	父
		c.5608C>T	p.R1870W	错义突变	0.0049000	B	意义未明	母
家系12	USH1C	c.4616C>T	p.T1539I	错义突变	0.0003270	B	意义未明	母
		c.206G>T	p.S69I	错义突变	0.0011000	B	意义未明	父

2.3. 初步分型

基于前期的基因检测结果、为期3~4年视力情况随访以及前庭功能评估，本研究为携带USH相关基因变异的患者进行初步分型和后续随诊建议。初步诊断显示：6例表现为USH(USH1型4例，USH2型2例)，7例表现为非综合征性聋。

3. 讨论

1858年德国眼科医生Albrecht von Graefe首次报道了3例家族性先天性耳聋合并RP的病例。1914年苏格兰眼科医生Charles Howard Usher报道了69例类似病例，并强调其具有家族遗传倾向，该疾病于1935年被正式命名为Usher综合征^{[1, 12]}。据估计全球USH患病人数超过40万，发病率为4~17/10万^[13]，日本地区发病率约为0.4/10万^[14]。该综合征的典型表现为耳蜗毛细胞发育异常引起的部分或全部听力损失，以及感光细胞功能障碍导致的视网膜退行性变化从而发生渐进性视力损失^[1]。此外，前庭毛细胞发育异常可导致部分患者出现前庭功能障碍，表现为平衡及协调等功能发育迟缓^[15]。迄今为止，尚未有关于该疾病诊断或治疗的专家指南或国际共识声明。

本团队前期对来自西南地区879例耳聋患者进行518个耳聋基因的panel测序，最终纳入12个家系。我们通过致病基因的筛选及遗传模式的分析进行初步诊断；对先证者的视力及前庭功能等情况持续随访3~4年，结合分子病因和表型诊断对入组患者进行初步鉴定。在实际临床工作中，SNHL和RP出现的时间跨度较大，增加了早期诊断的难度。研究表明，USH1患者前庭反射减退的早期标志通常为独立行走的年龄超过18个月^[15]，随后可表现出平衡活动方面的困难^[1]。这一发现为疑似USH1患者提供了重要的判断依据。我们调查了所有患者的独立行走年龄并充分了解其在生活中是否更容易跌倒等情况。典型USH1患者RP通常于10岁前发生且进展迅速^[1]。家系2、7、10先证者年龄接近10岁，无RP表现，结合语后聋及正常前庭功能，可排除USH可能。

MYO7A基因变异最常见导致USH，亦可引起包括DFNA11和DFNB2在内的非综合征型听力损失^[16]以及非典型USH^[17-18]。上述疾病中听力损失的频率、程度和发病时间不尽相同，即使在同一家族中由MYO7A导致的听力损失程度也有区别。DFNA11表现为语后听力损失，部分家系还存在眩晕、走路不稳等前庭症状^[19]。DFNB2与USH相比不存在视觉和前庭方面的症状，但也有研究认为DFNB2只是USH的一个早期阶段^[20-21]。本研究中3例MYO7A变异患者的临床表现呈现显著差异。家系1先证者在5岁时被确认为USH患者，家系2先证者因语后聋、10岁眼科未见异常排除USH可能，尽管家系3先证者因独立行走时间及多次眼科检查正常而初步判定为DFNB2，但我们仍谨慎地告知家属不能完全排除USH可能，需进行持续的眼科随诊。由此可见MYO7A基因变异所致疾病的异质性。目前仍缺少研究来阐明MYO7A的基因型与表型的关联，临床诊断仍需依赖基因检测与临床表型的协同分析。近年来基因检测的应用可有效识别MYO7A基因变异，为鉴别不同类型的听力损失和综合征提供重要依据。

既往研究表明CDH23基因变异方式与表型存在关联，即CDH23基因的移码突变、无义突变、剪切突变会导致USH1，而错义变异导致DFNB12^[16]。经HGMD专业版数据库查询，CDH23基因外显子37~50区域纯合缺失暂无文献报道，根据ACMG指南将其判定为可能致病变异。家系4先证者尽管眼科检查目前正常，但结合其CDH23基因外显子37~50区域纯合缺失、独立行走时间延长，仍需考虑为USH。因家系4先证者父母均为CDH23基因外显子37~50区域杂合缺失，对该家系的遗传关系发现先证者奶奶的母亲与外公的母亲为同胞姐妹，这表明家族内隐性突变积累可导致远亲婚配仍具有较大遗传病风险。家系5先证者携带CDH23错义突变，符合DFNB12的表型特征，初步诊断为DFNB12，但仍建议定期眼科随访以完全排除USH。家系6中2例患者均为CDH23基因c.6504T>A、c.6604G>A复合杂合突变。2例患者均未出现独立行走时间延迟，且先证者7岁眼科检查正常，初步判定为DFNB12，因2例患者突变位点相同，故其弟在2岁时即可排除USH可能。此外，从基因型角度来看，家系6先证者同样为错义突变，因此其表型与USH关联性也较低。USH早期诊断的挑战在于其多系统表现，尤其是听力损失和RP并非同期发生，而基因型-表型关联是对USH进行早期诊断的特殊工具，尤其在基因测序普及的情况下可以谨慎地基于基因型作出初步临床预后，对预警RP有重要临床价值。

前期研究中，团队针对家系8先证者的变异位点进行Minigene实验验证，结果表明USH1C基因c.388-1G>A纯合突变会导致mRNA异常剪接^[22]。在本研究中对家系8、9先证者进行眼科检查显示RP，故认为USH1C基因c.388-1G>A为USH的致病变异。

家系11先证者1岁时行人工耳蜗植入术，半年后因双侧隐睾行睾丸固定术联合睾丸鞘膜翻转术；家系12先证者1岁时因环状胰腺行胃十二指肠成形术及肠粘连松解术。然而，上述需要手术干预的表型与USH2A基因变异的潜在关联仍需分子机制研究证实。近年来部分USH2患者被发现除有听力损失和RP的经典症状外，还存在包括睡眠障碍、嗅觉触觉减退以及精子活力降低等与视网膜光感受器及耳蜗毛细胞病变无直接关联的其他表型^[12]。目前仍缺乏大规模分子水平上的研究来进一步证实这些现象与USH2A变异的关联。

一般来说，常染色体遗传病只有在2个等位基因突变时才会导致临床表现。近期研究表明，USH携带者尤其是老年可能出现中间的听力和视力表型，这些携带者实际上可能表现出隐性疾病的轻度症状，并非完全不受影响^[23]。本研究收集了多位USH患儿的父母，他们均为中年携带者。目前的详细调查显示，这些携带者的听力和视力均无明显异常。未来需通过开展更长期随访评估该人群听、视功能变化及潜在的易感性。

本研究中，共有6例患者被高度怀疑或诊断为USH，在所有双侧重-极重度SNHL患者中占0.68%(6/879)。如前所述，多数研究认为2型更为常见；而在本研究中，1型患者数量多于2型，可能与入组患者数量有限或人群遗传特征差异有关。USH患者通常首先表现为听力损失，双侧重度及以上SNHL患者可接受人工耳蜗植入术以实现听力重建，而目前尚无针对RP的广泛临床治疗或延缓病程的有效方法^[24]。本研究中所有经基因检测后高度怀疑USH的患儿均在主观视觉症状出现前接受了眼科检查，这表明早期基因诊断可为这类患者提供启动潜在可能干预的时间窗口。

USH相关基因变异位点已见于本团队前期研究，但本研究侧重点在于描述具体患者群体的临床症状以及对基因变异的分析。通过对中国西南地区耳聋家系的分析，为12个因USH相关基因变异致病的家系进行初步鉴定，揭示了这些基因变异在西南地区耳聋患者中的临床异质性，特别是在听力、视力及平衡障碍等方面的不同表现。这些临床发现为遗传性耳聋的早期诊断、临床干预及患者管理提供了新的视角和依据。

Funding Statement

国家自然科学基金(No：82360222)；先天性耳聋流行病学、致病分子机制研究及人工耳蜗术后听觉言语康复效果评价(No：2023533517000955)；云南省高层次卫生健康技术人才培养专项经费(No：L-2019002)